王學(xué)洋，鐘 成，崔吉曉，楊 穎，胡曉慧，辛 波,2

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308)

細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是一種新型的納米纖維素材料，主要由細(xì)菌發(fā)酵形成。BC具有極細(xì)的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、較高的持水性能、高比表面積、優(yōu)異的力學(xué)性能、親水性、良好的生物相容性等特征，在食品、生物醫(yī)藥、工業(yè)造紙、環(huán)境等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力[1]。然而，BC本身并不具備抑菌性能，在一定程度上限制了其實(shí)際應(yīng)用。

氧化石墨烯(GO)是一種二維納米片狀材料，GO 及其衍生物最重要的特性是它們具有一定的抑菌性能和細(xì)胞相容性好等優(yōu)點(diǎn)。作為石墨烯的衍生物，還原石墨烯(rGO)已經(jīng)引起了相關(guān)學(xué)者極大的關(guān)注[2]，其表面具有豐富的官能團(tuán)，是吸附金屬或其他無機(jī)前體的良好候選物，可以輕松地被各種有機(jī)小分子和聚合物功能化[3]。此外，具有抗菌活性的rGO基材料可用作生物醫(yī)學(xué)設(shè)備和食品包裝中的抗菌涂層材料[4]。二氧化錫(SnO2)納米粒子具有優(yōu)異的光催化性能、晶粒尺寸小、良好的穩(wěn)定性等特點(diǎn)，可以充分利用其光催化性能對(duì)rGO進(jìn)行功能化修飾，增強(qiáng)rGO的抗菌性能，從而達(dá)到協(xié)同抗菌的效果。

本文中，筆者首先采用氧化還原反應(yīng)制備rGO-SnO2復(fù)合納米粒子，然后通過勻漿共混法將納米復(fù)合物填充到BC基質(zhì)中，制備細(xì)菌纖維素/功能氧化石墨烯抗菌復(fù)合材料，然后測(cè)定復(fù)合材料的性能，為后續(xù)的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要菌種及其來源

木糖駒形氏桿菌(Komagataeibacterxylinus，CGMCC 2955，由工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCCC)保藏；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAK由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院楊洪江教授惠贈(zèng)?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.504由天津市畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基及溶液配制

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25、酵母提取物7.5、胰蛋白胨10、Na2HPO410；冰乙酸調(diào)節(jié)pH至6.0。

細(xì)菌培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5。

2 mg/mL的GO溶液的配制：精確稱取GO納米片0.5 g，加入250 mL的純水中，超聲分散10 h，直至GO溶液充分分散溶解。

1.3 細(xì)菌纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)

從培養(yǎng)皿上挑取K.xylinus單菌落，180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，向液體培養(yǎng)基中添加0.4%(體積分?jǐn)?shù))的纖維素酶，以6%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種培養(yǎng)，直至菌體OD600為0.5～0.6。離心收集菌體，洗滌后重懸于200 mL的液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌體OD600為0.02。在30 ℃下靜置培養(yǎng)4 d后，使細(xì)菌纖維素膜厚度約為6 mm。

將得到的細(xì)菌纖維素膜浸泡在0.1 mol/L的NaOH溶液中直至膜中殘留的培養(yǎng)基和菌體被完全除去，此時(shí)BC膜呈乳白色半透明狀，用去離子水反復(fù)沖洗，直至膜表面水的pH呈中性。采用纖維疏解器將BC破碎處理，調(diào)制BC漿液質(zhì)量濃度為10 g/L。

1.4 rGO-SnO2納米復(fù)合物的制備

以GO為模板載體吸附金屬離子前驅(qū)體，合成rGO-SnO2納米復(fù)合物。通過GO和SnCl2在90 ℃下發(fā)生直接氧化還原反應(yīng)得到SnO2修飾的rGO(rGO-SnO2納米復(fù)合物)，GO被SnCl2還原為rGO，與此同時(shí)Sn2+被氧化成SnO2納米粒子沉積在rGO的表面。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先將64 mL 的2 mg/mL GO懸浮液用超純水稀釋至200 mL。然后將0.56 g的SnCl2·2H2O 加入200 mL的鹽酸溶液(含4 mL 37% HCl)，攪拌至溶解。將上述2種溶液混合超聲分散10 min后，90 ℃磁力攪拌反應(yīng)6 h。最后，再收集離心得到的納米復(fù)合物，用超純水離心洗滌若干次(10 000 r/min，10 min)后80 ℃真空干燥，即得rGO-SnO2納米復(fù)合物。

1.5 BC/rGO-SnO2納米復(fù)合材料的制備

分別將5、10和15 mg的rGO-SnO2納米復(fù)合物加入10 mL的超純水中，超聲分散均勻，將得到的混合溶液加入一定量的細(xì)菌纖維素勻漿(10 g/L)中，攪拌均勻，超聲分散，得到的混合物用醋酸纖維素膜抽濾成薄膜狀，之后冷凍干燥，保存?zhèn)溆?，得到不同?fù)合比率(5%、10%和15%)的復(fù)合材料，分別命名為BC/rGO-SnO2-5%、BC/rGO-SnO2-10%和BC/rGO-SnO2-15%。

1.6 BC/rGO-SnO2復(fù)合材料膜光催化性能測(cè)定

以亞甲基橙(MO)為模型化合物，研究BC/rGO-SnO2復(fù)合膜對(duì)于甲基橙染料的光催化降解效率。首先將0.4 g BC、BC/GO、BC/SnO2、BC/rGO-SnO2樣品浸沒在100 mL配制好的MO溶液(10 mg/L)中，超聲分散5 min后，在黑暗條件下攪拌1 h，達(dá)到吸附平衡后，用功率為250 W的紫外燈(波長254 nm)對(duì)MO溶液進(jìn)行照射(光源距離為10 cm)，之后每隔一段時(shí)間(0、20、40、60、80、100和120 min)取樣測(cè)定1次。在甲基橙樣品溶液測(cè)定前，10 000 r/min離心10 min去除溶液中的不溶雜質(zhì)和沉淀后，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定甲基橙溶液的吸收光譜。

1.7 BC/rGO-SnO2復(fù)合材料的光催化抑菌實(shí)驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌作為測(cè)試菌株，在近紫外光的催化下(365 nm，20 W)，測(cè)定不同樣品BC(對(duì)照組)、BC/SnO2以及BC/rGO-SnO2復(fù)合膜的抑菌活性。具體的過程如下：

金黃色葡萄球菌在LB液體培養(yǎng)基內(nèi)37 ℃培養(yǎng)過夜，收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸，調(diào)節(jié)OD600為0.5。取直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入20 mL的菌懸液后，將BC膜和rGO-SnO2納米復(fù)合物復(fù)合比率分別為5%、10%、15%的BC/SnO2以及BC/rGO-SnO2納米復(fù)合膜圓片(直徑約為90 mm，約0.5 g)分別加至有菌液的平板，在近紫外光(365 nm，20 W)激發(fā)下測(cè)定材料的光催化抑菌活性。輻照時(shí)間為6 h，取菌液進(jìn)行梯度稀釋，之后取100 μL的菌液涂布在準(zhǔn)備好的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算抑菌率。實(shí)驗(yàn)之前，復(fù)合材料要經(jīng)過高溫蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 透射電鏡(TEM)分析

GO納米片的TEM圖像如圖1(a)所示。由圖1(a)可知：?jiǎn)螌覩O納米片的TEM圖成薄紗狀，表面含有許多的褶皺。

圖1(b)～(c)為rGO-SnO2的TEM照片。由圖1(b)和(c)可知：SnO2納米顆粒均勻地沉積在rGO薄片上，rGO薄片的整個(gè)表面都被蠕蟲狀的SnO2納米顆粒所修飾。

圖1(d)為rGO-SnO2的晶格照片。由圖1(d)可知：晶格間距為0.33和0.26 nm，分別對(duì)應(yīng)于金紅石相SnO2的(110)和(101)晶格平面的d-間距。

圖1(e)為rGO-SnO2的選區(qū)電子衍射(SAED)圖像。圖1(e)進(jìn)一步證實(shí)rGO-SnO2復(fù)合物的形成,其中衍射環(huán)表示的是rGO-SnO2復(fù)合物，衍射斑點(diǎn)是石墨烯[5]。

圖1(f)為負(fù)載在rGO薄片上的SnO2納米顆粒的粒徑分布圖，是從rGO-SnO2納米復(fù)合物的高倍TEM圖中隨機(jī)選取了50個(gè)SnO2納米顆粒，通過Nano Measure軟件分析[6]計(jì)算得到的。由圖1(f)可知：在GO納米片上，原位生長的SnO2納米顆粒粒徑為3～6 nm，平均粒徑為4.5 nm。

圖1 GO(a)、rGO-SnO2(b、c)膜的TEM圖譜，rGO-SnO2(d)的HRTEM圖譜，rGO-SnO2(e)的SAED圖譜和SnO2 NPs在rGO片上的粒徑分布(f)Fig.1 TEM images of GO sheets(a),rGO-SnO2 (b,c),and high-resolution TEM image of SnO2 nanoparticles on a rGO sheet(d),SAED pattern of rGO-SnO2(e),histograms and particle distribution of SnO2 nanoparticles on rGO sheets(f)

2.2 X線衍射(XRD)分析

圖2為rGO-SnO2、BC/rGO-SnO2、BC/SnO2和BC的XRD圖譜。由圖2可知：BC的XRD圖譜在2θ=14.9°和2θ=23.1°處有2個(gè)主要的結(jié)晶峰，為BC的特征衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于BC的(110)和(200)晶面；在2θ=17.2°處的峰是BC位于無定形區(qū)的非結(jié)晶峰。rGO-SnO2樣品中未見層狀GO的衍射峰，說明陽離子還原后GO的層狀堆疊結(jié)構(gòu)消失了。在2θ=26.6°、33.7°和52.2°處出現(xiàn)的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于金紅石相SnO2的(110)、(101)和(211)晶格平面(JCPDS 41-1445)[7]。這些較寬的衍射峰表明在rGO納米片上原位合成的SnO2的顆粒粒徑較小，結(jié)晶性差。同時(shí)，在圖中均未發(fā)現(xiàn)rGO衍射峰，可能是由于rGO含量過低未達(dá)到儀器檢測(cè)水平造成的。

圖2 rGO-SnO2、BC/rGO-SnO2、BC/SnO2和BC的XRD圖譜Fig.2 XRD patterns of rGO-SnO2,BC/rGO-SnO2,BC/SnO2 and BC

2.3 掃描電鏡(SEM)分析

圖3為BC、BC/rGO-SnO2的SEM分析及BC/rGO-SnO2的能譜圖。由圖3可知：呈三維纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米纖維組成了BC膜，形成BC薄膜的單根納米纖維的直徑為30～100 nm；rGO-SnO2納米復(fù)合物填充在細(xì)菌纖維素的間隙和孔洞中，使復(fù)合膜的表面結(jié)構(gòu)更加致密，這是因?yàn)锽C水凝膠具有天然多孔結(jié)構(gòu)，因此以BC作為基質(zhì)可以大量負(fù)載rGO-SnO2納米復(fù)合物[8]，而且rGO-SnO2納米雜化物具有一定的團(tuán)聚性；GO納米片具有高密度的成核位點(diǎn)，這也導(dǎo)致了SnO2納米顆粒在rGO片上大量的形成。BC/rGO-SnO2復(fù)合材料的能譜分析(EDS)結(jié)果表明，復(fù)合材料中含有C、O、Sn這3種元素，進(jìn)一步證實(shí)了rGO-SnO2復(fù)合物的形成[9]，而EDS圖譜中出現(xiàn)的Au元素是復(fù)合材料進(jìn)行掃描電鏡前噴金處理引入的，Cl-的存在可能是rGO-SnO2復(fù)合物制備過程中未充分洗滌除去Cl-造成的。

圖3 BC(a)、BC/rGO-SnO2(b、c、d) 的掃描電鏡照片和BC/rGO-SnO2(e)的能譜圖Fig.3 SEM images of BC(a)and BC/rGO-SnO2(b，c，d)and the EDS spectrum of the BC/rGO-SnO2 membrane(e)

2.4 熱質(zhì)量分析(TGA)

圖4為GO和rGO-SnO2的TGA曲線。由圖4可知：GO有2個(gè)主要的質(zhì)量損失溫度區(qū)，第一個(gè)快速失質(zhì)量區(qū)(～20%)為室溫到150 ℃，這可能是由于GO表面水分子的蒸發(fā)造成的；第二個(gè)快速失質(zhì)量區(qū)(～18%)為150～200 ℃，這可能是由于GO表面含氧官能團(tuán)的分解造成的[10]。與GO相比，rGO-SnO2納米雜化復(fù)合物的熱穩(wěn)定性更高，rGO-SnO2的質(zhì)量損失在200和400 ℃時(shí)分別只有6.5%和10.9%。

圖4 GO和rGO-SnO2的TGA曲線Fig.4 TGA curves of GO and rGO-SnO2 under N2 atmosphere

2.5 復(fù)合材料的力學(xué)性能分析

表1顯示了BC以及不同復(fù)合比率的BC/rGO-SnO2的力學(xué)性能。由表1可知：隨著納米填充物rGO-SnO2復(fù)合比率的增加，復(fù)合材料的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量逐漸增大，當(dāng)rGO-SnO2復(fù)合比率為5%時(shí)，拉伸強(qiáng)度和楊氏模量分別增加了15.9%和5.6%。當(dāng)rGO-SnO2復(fù)合比率為15%時(shí)，拉伸強(qiáng)度和楊氏模量分別增加了48.2%和69.5%。這是因細(xì)菌纖維素纖維呈無規(guī)則的排布，導(dǎo)致纖維間空隙和孔洞的形成，當(dāng)rGO-SnO2納米復(fù)合物填充在細(xì)菌纖維素纖維的微孔當(dāng)中，在纖維間起到了交聯(lián)作用，從而增強(qiáng)了納米復(fù)合材料的力學(xué)性能。

表1 BC及BC/rGO-SnO2的力學(xué)性能Table 1 Mechanical properties of BC and BC/rGO-SnO2

2.6 BC/rGO-SnO2復(fù)合材料膜的光催化性能

考察BC、BC/GO、BC/SnO2和BC/rGO-SnO2這4種材料對(duì)有機(jī)染料MO的光催化降解活性，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：MO的最大吸收波長為464 nm，隨著UV照射時(shí)間的延長，BC/GO、BC/SnO2和BC/rGO-SnO2處理組MO溶液的峰值強(qiáng)度逐漸減小，說明MO在UV照射下被降解；BC/GO、BC/SnO2和BC/rGO-SnO2都具有不同程度的光催化性，與BC/GO和BC/SnO2相比，BC/rGO-SnO2具有更高的光催化活性，并且光催化效果隨著光催化時(shí)間的延長而增強(qiáng)。這是因?yàn)槭┡c半導(dǎo)體材料復(fù)合后，由于石墨烯良好的導(dǎo)電性能和巨大的比表面積，促進(jìn)了光生電子和光生空穴的有效分離，抑制了電子-空穴復(fù)合反應(yīng)的進(jìn)行，因此提高了催化劑的光催化效率[11-12]。由于有效的電荷分離和轉(zhuǎn)移，石墨烯納米片的存在大大提高了金屬氧化物在紫外光照射下降解MO的光催化活性，大約有93.4%的MO在2 h內(nèi)被BC/rGO-SnO2納米復(fù)合材料降解(圖5(d))，這說明BC/rGO-SnO2對(duì)MO有較好的降解作用。光催化降解通常發(fā)生在光催化產(chǎn)物的表面，因此表面積是光催化的一個(gè)重要參數(shù)。此外，MO的降解遵循式(1)所描述的擬一階反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[13]。

圖5 納米復(fù)合材料處理MO溶液在紫外線照射不同時(shí)間后的紫外-可見光譜及BC/rGO-SnO2處理MO溶液在紫外照射不同時(shí)間后的紫外-可見光譜Fig.5 UV-visible spectra of MO solution treated with nanocomposites at different UV-irradiation time,and photodegradation of MO with BC/rGO-SnO2

(1)

式中：c0和c分別對(duì)應(yīng)于MO溶液的初始濃度和在t時(shí)刻的測(cè)量濃度，k為光降解速率常數(shù)。

由此計(jì)算得到BC/rGO-SnO2納米復(fù)合材料降解MO的光降解反應(yīng)的速率常數(shù)k為0.023 2 min-1。

2.7 BC/rGO-SnO2復(fù)合材料的光催化抑菌實(shí)驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌作為測(cè)試菌株，將BC、BC/SnO2和BC/rGO-SnO2復(fù)合材料放入菌液中，紫外光催化6 h(預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在沒有復(fù)合材料的培養(yǎng)基中，紫外線照射后金黃色葡萄球菌的CFU并沒有明顯的下降，這說明在低能量的UV-A光照下，光化學(xué)失活可以忽略不計(jì))，對(duì)BC/SnO2和BC/rGO-SnO2光催化復(fù)合材料的光催化抑菌性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：與對(duì)照組相比，BC/SnO2和BC/rGO-SnO2組在紫外光誘導(dǎo)下的菌體活力都有不同程度的降低,復(fù)合比率為5%、10%和15%的BC/rGO-SnO2組菌體死亡率分別為24.77%、31.94%和52.12%，由此可見，隨著rGO-SnO2納米復(fù)合物復(fù)合比率的增加，其抑菌能力逐漸增強(qiáng)，復(fù)合比率為5%、10%和15%的BC/SnO2組的抑菌率分別為9.71%、12.26%和17.76%。BC/rGO-SnO2組的抑菌效果要優(yōu)于BC/SnO2組，這與BC/rGO-SnO2組的光催化活性高于BC/SnO2組的結(jié)果一致，說明復(fù)合材料的光催化性能直接影響著它的光催化抑菌能力[14-15]。

圖6 BC、BC/SnO2和BC/rGO-SnO2復(fù)合材料對(duì)S. aureus的光催化抑菌性Fig.6 Photocatalytic antibacterial activity of BC，BC/SnO2 and BC/rGO-SnO2 composites against S. aureus

2.8 BC/rGO-SnO2復(fù)合材料對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的影響

為了探究BC/rGO-SnO2復(fù)合材料的抑菌機(jī)制，以S.aureus為對(duì)象測(cè)定紫外光照射6 h后、BC/rGO-SnO2材料處理后細(xì)胞內(nèi)ROS[16]的含量，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：與對(duì)照組的結(jié)果相比，黑暗處理組的熒光強(qiáng)度無明顯變化。在光照條件下，復(fù)合比率為5%、10%和15%的BC/rGO-SnO2材料在紫外光催化6 h后ROS的熒光強(qiáng)度分別為對(duì)照組的1.83、2.52和3.85倍，S.aureus胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度與細(xì)菌死亡率的趨勢(shì)一致。但隨著rGO-SnO2納米復(fù)合物復(fù)合比率的增加，BC/rGO-SnO2復(fù)合材料的光催化能力增強(qiáng)，復(fù)合材料處理后S.aureus胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說明細(xì)菌的死亡率逐漸增加。由此初步推斷：BC/rGO-SnO2復(fù)合材料在紫外光誘導(dǎo)下產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細(xì)菌受到氧化脅迫，造成細(xì)菌的氧化損傷，進(jìn)而引起菌體的死亡[17-18]。

圖7 S. aureus胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度(光照6 h)Fig.7 Fluorescence intensity of intracellular ROS inS. aureus by contacting with 5%,10%,15% BC/rGO-SnO2 composites under UV-A light for 6 h

3 結(jié)論

通過TEM、XRD、SEM和TGA等技術(shù)手段對(duì)制備得到的BC/rGO-SnO2復(fù)合材料進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蠕蟲狀的平均粒徑為4.5 nm 的SnO2NPs均勻地沉積在rGO薄片上，形成了rGO-SnO2納米復(fù)合物；在rGO納米片上原位合成的SnO2的顆粒粒徑較小，結(jié)晶性差。SEM結(jié)果表明，rGO-SnO2納米復(fù)合物填充在細(xì)菌纖維素的間隙和孔洞中，使復(fù)合膜的表面結(jié)構(gòu)更加致密；與GO相比，rGO-SnO2納米雜化復(fù)合物的熱穩(wěn)定性更高。rGO-SnO2納米復(fù)合物填充在BC纖維的空隙和孔洞當(dāng)中，在纖維間起交聯(lián)作用，因此BC/rGO-SnO2復(fù)合材料的力學(xué)性能增強(qiáng).

同時(shí)以具有光催化能力的SnO2NPs來修飾GO后負(fù)載在BC纖維中得到BC/rGO-SnO2納米材料。復(fù)合材料在近紫外光催化下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，這是因?yàn)锽C/rGO-SnO2復(fù)合材料在紫外光誘導(dǎo)下產(chǎn)生大量的ROS導(dǎo)致細(xì)菌受到氧化脅迫，造成細(xì)菌的氧化損傷，進(jìn)而引起菌體的死亡。

由此，BC/rGO-SnO2納米復(fù)合薄膜不僅可以保持BC本身優(yōu)異的材料性能，而且還附加了功能化氧化石墨烯和金屬氧化物納米粒子的抗菌特性及光催化性能，還具有優(yōu)異的力學(xué)特征，為BC在抑菌、環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路。