李 洋,胥曉雯,楊凱晴,陳星宇,宋天順,謝婧婧

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800)

羽毛是鳥類與禽類表皮細胞角質化的衍生物[1]，占其總體質量的5%～7%[2]。全球家禽養(yǎng)殖場的廢棄羽毛年產量約有2 000 000 t[3]，這些羽毛被隨意堆棄，導致病毒、細菌滋生，繼而產生大量的有害物質，危害人類健康及引起環(huán)境污染[4-5]。羽毛的主要成分是蛋白質和氨基酸，其中粗蛋白含量更是達到了90%以上[6]。羽毛中的角蛋白由復雜的三維超螺旋結構組成，使得一般的蛋白酶不易被完全降解[7-8]。目前降解羽毛的主要方法包括：物理法、化學法和微生物法。物理法主要是通過高溫高壓對羽毛進行加工處理，其生產成本較高，持續(xù)的高溫高壓會破壞部分熱敏性氨基酸，降低某些氨基酸的消化率[9]，繼而降低營養(yǎng)價值?；瘜W法工藝復雜，所需設備多，對設備的損耗大，還會破壞一些熱敏性的氨基酸，降低部分氨基酸的利用率或消化率[10]。微生物法是目前最為常用的羽毛降解方法，其反應條件較為溫和，對環(huán)境的破壞小，降解效率高，具有多樣化的降解產物并擁有良好的應用前景。羽毛通常含有20余種氨基酸[11]，經微生物法降解后，仍可以保留豐富且較為全面的氨基酸，用作氨基酸肥不會導致土壤累計無機氮，并且氮循環(huán)的效益更為顯著，因而可以避免傳統(tǒng)化肥所帶來的環(huán)境污染[12]。

本研究從堆積羽毛的土壤中篩選出一株羽毛高效降解菌，分析其降解產物的成分，確認其具備成為氨基酸肥的潛力，通過黑葉葵扇白菜盆栽試驗，評估羽毛降解產物對小白菜的促生作用，以期為實現(xiàn)羽毛廢棄物的資源化利用提供參考途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

完整羽毛，江蘇翠谷鴿業(yè)有限公司提供；羽毛粉，經清洗烘干后的完整羽毛，被粉碎機粉碎后，過150 μm篩備用。

1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(L)：脫脂奶粉10 g，瓊脂20 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O(100 g/L) 0.1 mL，NaCl 0.5 g，蒸餾水1 L；pH 8.0～8.1；分別經脫脂奶粉與瓊脂溶解，再經高壓后混勻。

復篩培養(yǎng)基(L)：完整羽毛2 g，K2HPO41 g，KH2PO40.4 g，NaCl 1 g。

LB液體培養(yǎng)基(L)：酵母浸粉5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 1 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基(L)：羽毛粉10 g，K2HPO41 g，KH2PO40.4 g，NaCl 1 g。

LB固體培養(yǎng)基(L)：酵母浸粉5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 1 g，瓊脂 20 g。

1.3 羽毛降解菌的分離篩選

從長期堆積腐爛鴿毛的土壤樣品中稱取新鮮土壤5 g，加入50 mL離心管中(含15 mL無菌水)。置于30 ℃、160 r/min培養(yǎng)的搖床中30 min，制成懸浮液。取0.1 mL置于20 mL的種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。取懸浮液按10-4～10-8梯度進行稀釋。取各梯度懸浮液0.1 mL于篩選培養(yǎng)基上涂布，將平板放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取有明顯水解圈的菌落進行劃線分離，并保存菌株。

測定菌株生長曲線，將菌株富集培養(yǎng)，取對數期種子液(OD600=0.8)，按1%接種量接種于復篩培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，觀察5 d內培養(yǎng)基內羽毛的降解情況，發(fā)酵后仍存在于培養(yǎng)基中的羽毛通過高速濾紙過濾。依據文獻[13]失質量率的測定方法加以修改。失質量率為羽毛降解前后的質量差的百分比；失質量率與羽毛降解率呈正相關。具體測定方法是將發(fā)酵液以8 000r/min轉速離心20 min，棄上清液，向沉淀中加入20 mL蒸餾水，于8 000 r/min的轉速離心10 min，反復離心清洗3次。將處理后的樣品于65 ℃的烘箱中烘干至恒質量，稱質量，計算失質量率，從而篩選出降解率最高的菌株，失質量率按式(1)計算。

X=(m1-m2)/m1×100%

(1)

式中:m1為羽毛降解前的質量，m2為羽毛降解后剩余的質量。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)學的鑒定分析

將篩選出的菌株在LB固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察其形態(tài)。參照文獻[14]的方法對菌株進行生理生化鑒定。

1.4.2 16S rDNA測序

采用引物1492R和27F，以X-Y4菌株的全基因組序列為模板進行PCR擴增，純化后送測，在NCBI網站進行序列比對，使用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 羽毛降解菌的單因素試驗

采用單因素試驗考察菌株的羽毛添加量、搖床轉速、初始pH、接種量和發(fā)酵溫度對可溶性蛋白產量的影響，每個試驗分別做3組平行。搖瓶初始發(fā)酵條件:羽毛添加量1.0 g，160 r/min，pH 7.0，菌株的接種量1%(體積分數)，OD6000.8，30 ℃，搖瓶發(fā)酵72 h。

1.5.1 羽毛添加量的確定

發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，采用250 mL搖瓶裝液，裝液量為100 mL，羽毛添加量分別為5、10、15、20、25和30 g/L，測定培養(yǎng)后溶液中可溶性蛋白含量，以確定最佳羽毛添加量。

1.5.2 搖床轉速的確定

羽毛添加量取上述試驗確定的最佳結果，其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，搖床轉速分別為140、160、180、200、220和240 r/min，考察搖床轉速對菌種降解羽毛生成可溶性蛋白的影響。

1.5.3 初始pH的確定

羽毛添加量和搖床轉速確定的最佳結果，其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，經過前期試驗，初步調整初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，考察pH對菌種降解羽毛生成可溶性蛋白的影響。

1.5.4 接種量的確定

羽毛添加量、搖床轉速和初始pH取上述試驗確定的最佳結果，其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，接種量分別為1%、2%、3%、4%和5%，考察搖床轉速對菌種降解羽毛生成可溶性蛋白的影響。

1.5.5 溫度的確定

羽毛添加量、搖床轉速、初始pH和接種量取上述試驗確定的最佳結果，其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件，分別在25、30、35、40和45 ℃搖床中進行發(fā)酵培養(yǎng)后測定可溶性蛋白，考察溫度對菌種降解羽毛生成可溶性蛋白的影響。

1.6 制備羽毛降解成氨基酸肥

將保藏的羽毛降解菌涂布劃線，挑單菌落接種于20 mL種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.8。按接種量1% 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，經驗證菌株降解羽毛第3天時氨基酸的含量最高，故選擇第3天收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液8 000 r/min 離心15 min，得上清液，上清液即為羽毛降解氨基酸肥溶液。

1.7 黑葉葵扇白菜盆栽試驗

去除表層土壤，取用耕層3～30 cm的土壤，將土壤曬干然后砸碎，分裝于15個花盆(口徑140 mm，高115 mm)中，每盆填入650 g土壤。每盆氮肥、鉀肥施用量為NH4NO30.571 g/kg、KH2PO40.439 g/kg、KCl 0.141 g/kg，將肥料與土壤拌勻裝盆，放入適量的水使土壤完全浸濕。將15盆盆栽隨機分成5組：處理組1(CK)為普通土壤；處理組2(P1)為普通土壤+葉面噴灑0.1 L/m2氨基酸肥；處理組3(P2)為普通土壤+葉面噴灑0.2 L/m2氨基酸肥；處理組4(P3)為普通土壤+灌根施加0.1 L/m2氨基酸肥；處理組5(P4)為普通土壤+灌根施加0.2 L/m2氨基酸肥，未經葉面噴灑和灌根施肥處理的均用等量水進行同樣操作。將撒5顆黑葉葵扇白菜種籽，待4 d發(fā)芽后間苗至2顆，待其過兩葉期(14 d)后，用不同濃度羽毛降解氨基酸溶液進行葉面噴灑和灌根施加，葉面噴灑每3天進行1次，灌根施加每7天進行1次。黑葉葵扇白菜生長培養(yǎng)30 d后，對其基本指標進行測定分析。

1.8 分析方法

1.8.1 可溶性蛋白含量的測定

采用文獻[15]的方法測定羽毛的發(fā)酵液中可溶性蛋白的濃度。

1.8.2 游離氨基酸的測定

取5 mL發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心15 min，將質量分數10%磺基水楊酸(10.00 g磺基水楊酸溶于100 mL蒸餾水中)與上清液按4∶1的體積比例均勻混合，于4 ℃的冰箱保存1 h，離心取上清液用0.22 μm濾膜過濾稀釋適當倍數后，再用0.22 μm濾膜過濾，最后參考文獻[16]的方法進行測定。

2 結果與討論

2.1 高效羽毛降解菌的篩選與鑒定

在篩選培養(yǎng)基上根據形態(tài)區(qū)別，挑選6個單菌落，分別命名為X-Y1、X-Y2、X-Y3、X-Y4、X-Y5和X-Y6。進行多次劃線純化后，保存以備復篩使用。將上述篩選出的6株菌接種于復篩培養(yǎng)基中，根據降解率高低再篩選出2株菌(X-Y1、X-Y4)。羽毛的降解是一個持續(xù)進行的過程，在一定時間內，羽毛降解率與發(fā)酵時間基本呈正相關性(圖1)。由圖1可知：發(fā)酵1 d時，菌群濃度積累到一定程度，羽毛開始降解。發(fā)酵2 d時，降解速率加快，X-Y4菌株的降解率已經明顯高于X-Y1菌株。到3 d時，X-Y4菌株降解基本停止，降解率達到(93.85±1.07)%，相比于國內外報道的其他羽毛降解菌[17-19]有較高的降解效率。例如王繼勇等[17]發(fā)現(xiàn)，4 d后，天然羽毛的降解率達71.3%。周蓮等[18]發(fā)現(xiàn)，132 h天然羽毛的降解率為70.12%。Oliveira等[19]發(fā)現(xiàn)，9 d后，天然羽毛的降解率為95%。X-Y1菌株在4 d時仍在緩慢降解，降解率為(79.33±1.99)%，由圖1還可知：X-Y4菌株降解速率明顯優(yōu)于X-Y1菌株，故選取X-Y4菌株作為后續(xù)的研究對象。

圖1 X-Y1和X-Y4菌株對羽毛降解率的比較Fig.1 Comparison of degradation rate of feathers by X-Y1 and X-Y4 strains

篩選得到的1株高效降解羽毛的X-Y4菌株，將其劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基上，觀察可知：其菌落呈圓形，金黃色，邊緣整齊，表面光滑，中間突起，不透明且黏稠。其生理生化特性見表1。由表1可知：X-Y4菌株可降解酪蛋白、酪氨酸、麥芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖和淀粉，H2O2酶試驗呈陽性，甲基紅和乙酰甲基甲醇試驗均呈現(xiàn)陰性。經測序結果比對發(fā)現(xiàn)，X-Y4菌株與產吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes)的同源性達到98%。通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，觀察菌株形態(tài)和生理生化特征，初步確定X-Y4菌株為產吲哚金黃桿菌。進一步研究發(fā)現(xiàn)，X-Y4菌可在溫度為15～45 ℃、pH 4.5～11.0條件下生長發(fā)育。

圖2 X-Y4菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain X-Y4

表1 X-Y4菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical properties of strain X-Y4

2.2 羽毛降解發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 不同羽毛添加量對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響

不同羽毛添加量對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響結果見圖3。由圖3可知：對于不同羽毛添加量，X-Y4的可溶性蛋白含量是隨著羽毛添加量先增加后減少的，其中羽毛添加量為10 g/L時，可溶性蛋白含量最高，達到(122.35±3.53) μg/mL。添加量在10 g/L后處于下降趨勢，可能是由于羽毛含量過大，水含量相對較低。當羽毛含量過多時，傳質過程不能順利進行，影響發(fā)酵體系的供氧，因此菌株降解羽毛能力開始減弱[20]。因此，選擇10 g/L為最佳羽毛添加量。

圖3 不同羽毛添加量對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響Fig.3 Effects of different feather addition amount on soluble protein production of X-Y4 strain

2.2.2 不同轉速對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響

不同轉速對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響見圖4。由圖4可知：對于不同轉速，X-Y4的可溶性蛋白含量是隨著轉速的增加，呈先增加后減少趨勢。當轉速為200 r/min時，可溶性蛋白含量最高，為(121.32±20.76) μg/mL。適宜的轉速可以增加溶氧，因此選擇200 r/min為最佳轉速。

圖4 不同轉速對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響Fig.4 Effects of different rotation speeds on soluble protein production by X-Y4 strain

2.2.3 不同pH對菌株產可溶性蛋白的影響

不同pH對菌株產可溶性蛋白的影響見圖5。參考文獻[21-23]，并由圖5可知：當培養(yǎng)基的初始pH 為8.0～10.0時，可溶蛋白含量差異不大，表明在堿性條件下，X-Y4菌株降解羽毛的能力較強。菌株在生長過程中，會逐漸調節(jié)pH，最后穩(wěn)定在pH 9.0，故選擇pH 9.0為最佳pH。本試驗所采用的產吲哚金黃桿菌X-Y4在堿性條件下更有利于角蛋白酶的積累和加速菌體的生長，并能提高羽毛的降解效率。

圖5 不同pH對X- Y4菌株產可溶性蛋白的影響Fig.5 Effects of different pH on soluble protein production by X-Y4 strain

2.2.4 不同接種量對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響

不同接種量對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響見圖6。由圖6可知：對于不同接種量，X-Y4的可溶性蛋白含量是隨著接種量的增加，呈先增加后減少的趨勢，其中接種量為2%時，可溶性蛋白含量最高，達到(168.56±7.82) μg/mL。因此，選擇2%時為最佳接種量。

圖6 不同接種量對X- Y4菌株產可溶性蛋白的影響Fig.6 Effects of different inoculation amount on soluble protein production by X-Y4 strain

2.2.5 不同溫度對X-Y4菌株產可溶性蛋白的影響

溫度能夠影響微生物體內進行的許多生化反應，從而影響微生物的代謝活動。本試驗分別設置25、30、35、40和45 ℃，考察不同溫度對可溶性蛋白含量的影響結果見圖7。由圖7可知：對于不同溫度，X-Y4的可溶性蛋白含量是先增加后減少的，其中溫度為35 ℃時，可溶性蛋白含量最高，可達(173.27±2.95) μg/mL。

圖7 不同溫度對X- Y4菌株產可溶性蛋白的影響Fig.7 Effects of different temperatures on soluble protein production by X-Y4 strain

2.3 X-Y4菌株發(fā)酵液中氨基酸的分析

使用全自動氨基酸分析儀測定發(fā)酵上清液中的氨基酸種類和含量，結果見表2。由表2可知:羽毛填量10 g/L，轉速200 r/min，初始pH 9.0，接種量2%，溫度35 ℃，在此條件下72 h后發(fā)酵液中游離氨基酸總含量達到437.7 nmol/mL，其中Asp、Glu和Tyr含量最高，均超過10%;Ser、Ala、Val、Phe、Lys含量也較高，均超過了5%，說明具有應用于有機肥和動物飼料蛋白的潛力。

表2 羽毛經X-Y4菌發(fā)酵后氨基酸的組成和含量Table 2 The composition and content of amino acids in feathers after fermentation by X-Y4

2.4 X-Y4氨基酸肥對黑葉葵扇白菜生長的影響

在黑葉葵扇白菜盆栽試驗中，添加一定濃度的氨基酸肥可以提高黑葉葵扇白菜的株高和鮮質量，并具有促進其生長發(fā)育的功能。盆栽試驗中經不同處理條件后的黑葉葵扇白菜的生長情況見表3。由表3可知：試驗組P1、P2、P3和P4的株高分別高出對照組CK 8.24%、17.42%、17.79%和29.91%，雖然實驗組長勢優(yōu)于對照組，但由于株高的限制，所以株高數據進行分析未達到顯著差異水平(P<0.05)。試驗組P1、P2、P3和P4的鮮質量高出對照組CK的2.42%、22.21%、51.16%和63.48%，采用葉面噴灑處理的P1、P2試驗組，雖有增加一定的鮮質量，但不明顯，采用灌根施加的P3、P4試驗組優(yōu)于前者且達到顯著性差異(P<0.05)，其中灌根處理優(yōu)于葉面處理，0.2 L/m2的濃度優(yōu)于0.1 L/m2，結果表明：X-Y4菌株降解后的羽毛發(fā)酵產物能夠促進作物生長，灌根施加0.2 L/m2氨基酸肥的效果最佳。王東方等[24]、魏啟舜等[25]、圣亞男等[26]研究結果表明：植物施用氨基酸可提高其生理活性，增加葉片的葉綠素含量，促進作物對養(yǎng)分的吸收利用，有利于植物干物質的積累，從而增加生物量。本研究采用的黑葉葵扇白菜盆栽試驗結果與上述報道一致，含有氨基酸成分的P3、P4試驗組的地上部分鮮質量均顯著高于CK對照組。

表3 盆栽試驗中不同處理條件下黑葉葵扇白菜的生長情況Table 3 Chinese cabbage growth indicators in various treatments in the pot experiment

3 結論

本研究從堆積腐爛羽毛的土壤中篩選出1株高效羽毛降解菌X-Y4，經鑒定其為產吲哚金黃桿菌。該菌株最適發(fā)酵條件：羽毛填量10 g/L、轉速200 r/min、pH 9.0、接種量2%、溫度35 ℃。在此條件下，可溶性蛋白產量為(173.27±2.95) μg/mL。將該羽毛降解菌制得的氨基酸肥施用于黑葉葵扇白菜盆栽，并對其基本指標進行分析后發(fā)現(xiàn)：試驗組施加0.2 L/m2葉面處理，0.1 L/m2灌根施加和0.2 L/m2灌根施加的鮮質量均高出對照組的鮮質量22.21%、51.16%、63.48%，其中0.2 L/m2灌根施加，對黑葉葵扇白菜的促生效果最為明顯。