施明雨，郭 亭,,3,，魏荷芬，應(yīng)漢杰,,3，張宿義，陳 勇,,3，唐成倫

(1.江蘇集萃工業(yè)生物技術(shù)研究所有限公司，江蘇 南京 211800；2.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學(xué) 國家生化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 211800；4.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

唾液酸(SA)，化學(xué)名為N-乙?；窠?jīng)氨酸，是一種天然的碳水化合物[1]。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，唾液酸在大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的產(chǎn)生和發(fā)育中發(fā)揮非常重要的作用[2]。特別是對(duì)于出生體質(zhì)量較輕的嬰兒，充足的唾液酸補(bǔ)給對(duì)嬰兒大腦的正常發(fā)育至關(guān)重要；孕婦分娩后體內(nèi)的唾液酸含量水平逐漸下降，為維持體內(nèi)唾液酸水平，孕婦乃至孕后仍需額外攝取足量的唾液酸。另外，唾液酸的含量還與DHA的含量有著明顯的相關(guān)性，這表明它極有可能與嬰兒的腦結(jié)構(gòu)和腦功能發(fā)育有關(guān)，可能兩者都對(duì)早期腦發(fā)育有益[3]。目前，唾液酸作為一種“全能型”新食品資源，可以應(yīng)用于食品、奶粉、醫(yī)藥和化妝品等眾多領(lǐng)域。

據(jù)中國燕窩市場(chǎng)分析報(bào)告顯示，2016—2020年，燕窩的需求與供給均以超過10%的速度增長，但供需矛盾非常突出，如2019年的供需差額約3 000 噸/年；隨著唾液酸的應(yīng)用市場(chǎng)的不斷拓展，唾液酸的潛在市場(chǎng)需求估計(jì)為1 500 噸/年，其市場(chǎng)容量在300～1 000億元/年[6]。唾液酸的生產(chǎn)方法主要有天然提取法、酶合成法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。唾液酸在天然原料中的含量很低，所以唾液酸的天然提取法應(yīng)用有限；唾液酸酶合成法的缺點(diǎn)是原料成本高，這在一定程度上限制了酶合成法的規(guī)?；a(chǎn)；唾液酸的化學(xué)合成法所需的反應(yīng)條件苛刻(如氧化過程需要在-78 ℃進(jìn)行)，不具備優(yōu)勢(shì)；微生物發(fā)酵法生產(chǎn)唾液酸具有原料廉價(jià)、反應(yīng)條件溫和、易于放大的優(yōu)勢(shì)，是最具產(chǎn)業(yè)化前景的方法。

聚唾液酸(polysialic acid，PSA)是唾液酸單體通過α-2，8和/或者α-2，9糖苷鍵連接而成的線性多聚糖，以莢膜的形式存在于少數(shù)幾種致病菌細(xì)胞的表面。1959年，Barry和Goebel首先在大腸桿菌(Escherichiacoli) K-235和K-1中發(fā)現(xiàn)該聚合物[4]。在固體發(fā)酵過程中,聚唾液酸通常以夾膜的形式附于細(xì)胞表面；在液體發(fā)酵過程中，由于攪拌等作用，聚唾液酸通常以黏液的形式脫落到發(fā)酵液中。將聚唾液酸進(jìn)行酸水解或酶水解后，離純化可得到唾液酸,這是工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)唾液酸的基礎(chǔ)[5]。

現(xiàn)階段的聚唾液酸生產(chǎn)菌株主要是大腸桿菌，野生型大腸桿菌聚唾液酸的產(chǎn)量一般都不高且發(fā)酵水平不穩(wěn)定，所以大腸桿菌的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)量普遍較低(5～6 g/L)，一定程度上限制了其應(yīng)用。Rode等[7]利用大腸桿菌E.coliK92發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸，產(chǎn)量為1.6 g/L。Stark等[8]利用E.coli通過溶氧反饋補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸，產(chǎn)量3 g/L。國內(nèi)對(duì)聚唾液酸的研究起步較晚，目前國內(nèi)聚唾液酸的發(fā)酵水平較低，發(fā)酵成本較高。詹曉北等[9]對(duì)聚唾液酸的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)以及pH控制補(bǔ)料進(jìn)行了研究。張琦等[10]通過兩階段攪拌策略發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸，產(chǎn)量為3.966 g/L。劉金龍[11]優(yōu)化聚唾液酸生產(chǎn)工藝，進(jìn)行了500 L規(guī)模的中試放大驗(yàn)證，聚唾液酸產(chǎn)量達(dá)到5.5 g/L。

誘變篩選技術(shù)是獲得高產(chǎn)菌株的有效手段之一，但高產(chǎn)聚唾液酸選育過程繁瑣。國外關(guān)于唾液酸的研究很多,但是主要都是關(guān)于唾液酸及其衍生物生物生理活性的研究。本研究利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變和微生物高通量自動(dòng)挑選儀，誘變選育得到高產(chǎn)聚唾液酸菌株，通過高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化，提升聚唾液酸的生產(chǎn)效率，為發(fā)酵法制備唾液酸的產(chǎn)業(yè)化提供良好的生產(chǎn)菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集自某天然水體。

EscherichiacoliSA-1，由江蘇集萃工業(yè)生物技術(shù)研究所有限公司微生物育種平臺(tái)誘變篩選并保藏。

葡萄糖(食品級(jí))，山東西王藥業(yè)有限公司；山梨醇、瓊脂，NaCl、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨(AR)，OXOID公司。

固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、NaCl 10、酵母粉5、瓊脂20；滅菌前pH自然。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、NaCl 10、酵母粉5；滅菌前pH自然。

鑒別培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、KH2PO41.0、蛋白胨10、MgSO40.6、瓊脂20；滅菌前pH 7.6。

搖瓶培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇40、(NH4)2SO44.94、K2HPO4·3H2O 5.2、蛋白胨10、MgSO41.2；滅菌前pH 7.6。

上罐培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、玉米漿20、K2HPO4·3H2O 2.5、KH2PO45.0，MgSO40.9、NaCl 5；pH 6.4。

1.2 主要儀器

ARTP-M型等離子誘變儀，無錫天木清源生物科技有限公司；QPix420型微生物高通量全自動(dòng)挑選儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GENESYS 10S型分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；ZQZY-CT型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；T&J-Btype 10 L*2發(fā)酵系統(tǒng)，迪必爾生物工程(上海)有限公司；PL600E/02型電子稱，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；G180DWS型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；Centrifuge 5424R型高速離心機(jī)，艾本德中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PSA含量測(cè)定

采用間苯二酚-鹽酸法[12]，測(cè)定PSA含量。

1.3.2 菌株的分離和純化

將所取水樣逐級(jí)稀釋，分別涂布在鑒別培養(yǎng)基(另加溴甲酚紫10 g/L)上，通過多次稀釋和挑選單菌落劃線進(jìn)行純化，獲得多株菌株，編號(hào)保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.3.3 菌種的生理生化鑒定和進(jìn)化樹分析

Biolog細(xì)菌鑒定:采用Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)(MicroStation，Biolog公司)，細(xì)菌純培養(yǎng)采用Biolog BUG 的固體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，再將菌落用液體培養(yǎng)基(IF - B)稀釋，稀釋的菌液加入到Gen Ⅲ微板中(每個(gè)孔100 μL),37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，然后用MicroStation進(jìn)行鑒定。

將測(cè)序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行BLAST分析。選取同源性相近的序列，再用MEGA7軟件對(duì)選取的序列進(jìn)行編輯，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.4 ARTP誘變

從超低溫冰箱內(nèi)取出甘油管劃線于LB固體平板，挑選單菌落接種至一級(jí)種子液(LB，裝液量20 mL，于100 mL搖瓶中)，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。按4%的接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至二級(jí)種子液(LB，裝液量20 mL)，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)約3 h，OD600達(dá)到0.6～0.8，取菌液1 mL，用無菌生理鹽水梯度稀釋104，制成誘變菌懸液。取10 μL菌懸液均勻涂布于載片上，放置在ARTP操作室中：高度2 mm，通氣量10 L/min(0 ℃，1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓)，功率100 W，分別處理0、10、20、30、35、40、45和50 s。處理完的載片，迅速轉(zhuǎn)移至1 mL生理鹽水中，充分振蕩后涂布于含溴甲酚紫的鑒別培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，平板放置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄平板上的活菌數(shù)并計(jì)算致死率。致死率按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：A為未誘變處理平板上菌落數(shù)；L為誘變處理后平板上菌落數(shù)。

1.3.5 高產(chǎn)菌株篩選

1) 初篩。利用微生物高通量自動(dòng)挑選儀掃描鑒別培養(yǎng)基平板上變色光圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值較大的菌落，自動(dòng)挑選至含搖瓶培養(yǎng)基的96孔板(裝液量100 μL)，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h，測(cè)定各孔菌株的PSA含量。每株單菌落做2個(gè)平行試驗(yàn)，復(fù)挑至Copy板培養(yǎng)24 h，作為初篩種子保藏甘油管。

2) 搖瓶復(fù)篩。將初篩得到菌株甘油管從超低溫冰箱取出劃線接種于LB固體平板，挑選單菌落接種至一級(jí)種子液(LB，裝液量20 mL)，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。按2%的接種量將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至含搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中(LB，裝液量100 mL于500 mL搖瓶中)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h。以間苯二酚法檢測(cè)PSA含量，以出發(fā)菌株為對(duì)照，篩選PSA產(chǎn)量較高的菌株。

1.3.6 細(xì)胞生物量測(cè)定

菌體量測(cè)定取一定量發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后測(cè)定OD600，OD600=1.0相當(dāng)于0.45 g干菌體的質(zhì)量(以1 L發(fā)酵液計(jì))。

1.3.7 遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

對(duì)獲得的突變菌株進(jìn)行5次傳代，經(jīng)過搖瓶(裝液量100 mL)37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)72 h，測(cè)定其各代的SA產(chǎn)量、生物量、發(fā)酵結(jié)束pH，驗(yàn)證菌種的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.8 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

在10 L發(fā)酵罐上對(duì)篩選的高產(chǎn)菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，優(yōu)化最佳產(chǎn)高PSA的高密度培養(yǎng)條件。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件：10 L玻璃發(fā)酵罐裝液量為5 L、接種量為4%、發(fā)酵溫度為37 ℃并以15%氨水控制pH在6.4，通過聯(lián)動(dòng)調(diào)節(jié)攪拌和通氣量控制溶解氧在30%以上，采用恒速補(bǔ)料策略(發(fā)酵5 h開始以100 mL/h的速率)進(jìn)行補(bǔ)料至發(fā)酵結(jié)束,補(bǔ)料培養(yǎng)基為500 g/L葡萄糖。

2 結(jié)果與分析

產(chǎn)聚唾液酸大腸桿菌菌株的選育過程通常是酸堿指示劑為初篩條件，然后通過間苯二酚法檢測(cè)聚唾液酸含量來篩選出高產(chǎn)菌株，如高霖等[13]以溴甲酚紫為酸堿指示劑，對(duì)大腸桿菌SA-1進(jìn)行常溫常壓等離子體(ARTP)和硫酸二乙酯(DES)誘變，然后在含酸堿指示劑的平板上人工挑選光圈、菌落較大的菌株，整個(gè)過程工作枯燥，步驟單一，操作人員容易疲勞、出錯(cuò)。高產(chǎn)聚唾液酸的大腸桿菌菌株的獲得一定是基于龐大的突變庫，本研究將酸堿指示劑和高通量自動(dòng)挑選儀結(jié)合進(jìn)行自動(dòng)化高通量篩選，經(jīng)過多輪篩選獲得高產(chǎn)唾液酸大腸桿菌菌株。

2.1 產(chǎn)唾液酸菌株篩選

從天然水體取得水樣，通過溴甲酚紫的鑒別培養(yǎng)基共分離純化出50株菌，并借助全自動(dòng)菌落挑選儀的顏色識(shí)別功能進(jìn)行高通量自動(dòng)化挑選培養(yǎng)基上各菌株的變色光圈直徑(D)/菌落直徑(d)比值較大的唾液酸突變株，經(jīng)過多輪篩選獲得高產(chǎn)唾液酸大腸桿菌菌株，篩選出6株菌株，見表1。進(jìn)一步檢測(cè)6株菌株聚唾液酸含量(間苯二酚法)，其產(chǎn)量為0.01～0.20 g/L，其中5號(hào)菌株產(chǎn)量最高(0.20 g/L)，記為SA-1，選作為后續(xù)研究菌株。

表1 產(chǎn)聚唾液酸菌株的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of polysialic acid producing strains

2.2 菌株鑒定

將菌株SA-1接種于LB固體培養(yǎng)基中，菌落邊緣整齊、濕潤、透明、有光澤；對(duì)菌株SA-1進(jìn)行Biolog鑒定(表2)，相似度大于0.5；另外，對(duì)菌株SA-1系統(tǒng)進(jìn)化樹同源性分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知：菌株SA-1與大腸桿菌144的同源性達(dá)100%。選取序列相近的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析，測(cè)序序列與大腸桿菌K235的同源性達(dá)100%。綜合2種鑒定結(jié)果判定該菌為大腸桿菌。

表2 菌株SA-1的Biolog鑒定結(jié)果Table 2 Results of strain SA-1 by Biolog identification

圖2 菌體SA-1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain SA-1

2.3 ARTP誘變結(jié)果

產(chǎn)唾液酸大腸桿菌ARTP誘變存活曲線如圖3所示。

圖3 E.coli SA-1的ARTP誘變存活曲線Fig.3 Survival curve of E.coli SA-1 by ARTP

由圖3可知：在0～30 s時(shí)，隨著照射時(shí)間的增加，存活率在逐步降低；照射時(shí)間≥40 s時(shí)存活率接近于0；而當(dāng)照射時(shí)間為35 s時(shí)，存活率為19.20%，選取該照射時(shí)間下誘變的菌落進(jìn)行培養(yǎng)。

2.4 高產(chǎn)菌株篩選

出發(fā)菌株SA-1通過ARTP誘變后，經(jīng)溴甲酚紫鑒別培養(yǎng)基初篩，再通過搖瓶復(fù)篩，經(jīng)過5輪篩選獲得搖瓶發(fā)酵唾液酸產(chǎn)量最高的突變菌株SA-18，其搖瓶產(chǎn)量為0.95 g/L，是出發(fā)菌株產(chǎn)量(0.20 g/L)的4.75倍。

2.5 菌株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

為檢測(cè)突變菌株E．coliSA-18產(chǎn)PSA的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)了8代，測(cè)定各代發(fā)酵參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 E.coli SA-18的遺傳穩(wěn)定性測(cè)試Table 3 Genetic stability test of E.coli SA-18

由表3可知：各代菌株發(fā)酵結(jié)束時(shí)的PSA產(chǎn)量在0.95 g/L左右，檢測(cè)指標(biāo)較為穩(wěn)定，說明菌株SA-18具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.6 高密度發(fā)酵過程中磷酸鹽濃度優(yōu)化

目前，聚唾液酸發(fā)酵生產(chǎn)過程通常都采用較高濃度磷酸鹽和山梨醇為碳源的培養(yǎng)基，高質(zhì)量濃度磷酸鹽(20 g/L K2HPO4)可以有效提高PSA的產(chǎn)量和菌體濃度[14]，但以山梨醇碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，山梨醇并非速效碳源，導(dǎo)致細(xì)胞生長代謝較慢，發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)基中會(huì)積累大量的磷酸鹽，磷酸鹽在發(fā)酵體系中的另外一個(gè)重要作用就是作為緩沖體系，而SA的分離需要經(jīng)過高濃度的酸來酸解，過高濃度的磷酸鹽勢(shì)必會(huì)大幅增加酸解過程酸的消耗，不利于SA的分離。本研究在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行SA的高密度發(fā)酵，以葡萄糖為碳源，采用恒速補(bǔ)料的方式，發(fā)酵初始培養(yǎng)基不變，通過在補(bǔ)料培養(yǎng)基中分別添加0、2.5、5.0、7.5和10.0 g/L K2HPO4進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如圖4和5所示。

圖4 磷酸鹽用量對(duì)誘變菌株SA-18發(fā)酵過程細(xì)胞生長的影響Fig.4 Effects of phosphate concentrations on cell growth in the fermentation process of SA-18 mutated strain

圖5 K2HPO4用量對(duì)菌株SA-18產(chǎn)SA的影響Fig.5 Effects of different phosphate concentrations on SA in SA-18

由圖4和5可知：補(bǔ)料培養(yǎng)基中K2HPO4用量為0、2.5 g/L時(shí)，菌體生長速率相對(duì)偏慢，最終唾液酸產(chǎn)量相較低；而當(dāng)K2HPO4為7.5、10.0 g/L時(shí)，菌體前期生長迅猛，但發(fā)酵后期菌濃下降，即菌體自溶，后期SA合成速率也下降；當(dāng)K2HPO4為5.0 g/L時(shí)，菌體生長穩(wěn)定，最終SA產(chǎn)量也達(dá)到最高值16.10 g/L。

3 結(jié)論

為獲得高產(chǎn)聚唾液酸的菌株，本研究首先從天然水體中獲得樣品，經(jīng)鑒別培養(yǎng)基篩選到產(chǎn)唾液酸出發(fā)菌株SA-1。進(jìn)一步通過優(yōu)化最佳致死率等條件得到最佳誘變條件，出發(fā)菌株經(jīng)ARTP等離子體誘變后獲得大量突變株。借助全自動(dòng)菌落挑選儀的顏色識(shí)別功能進(jìn)行高通量自動(dòng)化挑選高產(chǎn)唾液酸突變株，經(jīng)過多輪篩選獲得高產(chǎn)聚唾液酸大腸桿菌菌株SA-18(搖瓶水平達(dá)0.95 g/L)。在10 L發(fā)酵罐中，對(duì)突變菌株SA-18進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化補(bǔ)料培養(yǎng)基中的K2HPO4濃度，當(dāng)K2HPO4用量為5.0 g/L時(shí)，此時(shí)SA產(chǎn)量達(dá)到16.10 g/L。