楊曉偉,趙自亮，付 雨，涂少宇，劉 霞，李照偉，浦同燦，王 慧，曾 紅，趙光偉* (.西南大學 動物醫(yī)學院，重慶 榮昌 40460；.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008；.貴州省花溪區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，為單股環(huán)狀DNA病毒，是獸醫(yī)學上迄今發(fā)現(xiàn)的己知動物病毒中最小的病毒[1]。根據(jù)其抗原性和基因組特性目前可分為PCV1、PCV2和新出現(xiàn)的PCV3以及PCV4[2-4]，其中PCV1無致病性，PCV2能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)，被廣為周知，而PCV3和PCV4近幾年才被報道，在2016年，PCV3首次被發(fā)現(xiàn)于美國密蘇里州、明尼蘇達州和南達科他州患有心肌炎、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的仔豬中[3]，PCV4則是被我國學者于2019年從湖南省臨床出現(xiàn)呼吸道疾病、腸道疾病和PDNS的豬群中首次發(fā)現(xiàn)[4]。由此，PCV的復(fù)雜性引起了國內(nèi)眾多學者的廣泛關(guān)注。

PCV3基因組全長2 000 bp，GC含量為50%，包含3個開放閱讀框(ORF)，ORF1編碼衣殼(capsid,Cap)蛋白，ORF2 編碼復(fù)制(replication,REP)相關(guān)蛋白，ORF3編碼的蛋白的功能還不清楚。盡管該病毒多報道于患有呼吸道、繁殖障礙、消化道疾病的豬上，但由于毒株分離困難，對其致病性的研究并不多。最新的資料顯示汪孟航[5]利用PK-15細胞成功分離到1株P(guān)CV3，用其感染3周齡剖宮產(chǎn)仔豬，證實了PCV3具有廣泛的組織嗜性，但仔豬并不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此仍需加強對PCV3的研究。川、黔、渝3省(市)是我國西南地區(qū)生豬養(yǎng)殖的重要區(qū)域，尤其四川省，2020年國家統(tǒng)計局統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示該省生豬出欄量為5 614.4萬頭，居全國之首，因此進一步了解該地區(qū)PCV3的感染情況及其毒株的分子特征，可為該病毒的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本信息 臨床樣本來源于2020年1月至2021年1月期間四川宜賓、瀘州、資陽、內(nèi)江、自貢、達州、隆昌、敘永、簡陽9個地區(qū)共145份樣本；貴州播州、玉屏、松桃、赤水、貞豐、獨山、威寧和花溪8個地區(qū)共293份樣本；重慶涪陵、石柱、永川、江津、云陽、梁平、忠縣、潼南、長壽、合川、巫溪、彭水和云陽13個地區(qū)共201份樣本。其中四川和重慶地區(qū)為臨床患病樣本，發(fā)病癥狀不盡相同，主要包括發(fā)燒、呼吸道癥狀、繁殖障礙等，多為中小規(guī)模養(yǎng)殖場(基礎(chǔ)母豬存欄量50～500頭)；貴州樣本均為表觀無臨床癥狀，均為規(guī)模化豬場(基礎(chǔ)母豬存欄量500頭以上)。樣本類型包括血清、脾、淋巴結(jié)和扁桃體，保存于-80℃。

1.1.2主要試劑 Easy Pure Viral DNA/RNA Kit(ER201-02)購自北京全式金生物公司；DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒、rTaq聚合酶預(yù)混液等為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計與合成 參考PALINSKI等[3]的文獻報道合成PCV3檢測所用引物(PCV3-Cap)，參考文獻[6]合成PCV3全基因組測序引物(PCV3-Full-1,2,3)，引物序列見表1，由華大基因科技有限公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.2.2核酸的提取 按Easy Pure Viral DNA/RNA Kit試劑盒的說明提取所有樣本的DNA，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR擴增條件 PCV3檢測反應(yīng)體系25 μL：2× rTaq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，PCV3-CAP上下游引物各1.5 μL，樣本DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCV3全基因組擴增反應(yīng)體系50 μL：2× rTaq PCR Mix 25 μL，ddH2O 15 μL，PCV3-Full-1,2,3上、下游引物各3 μL，樣本DNA模板4 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性30 s,55℃退火60 s，共30個循環(huán)；72℃延伸2 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過Vilber Lourmat Quantum-ST5 成像系統(tǒng)拍照。利用膠回收試劑盒純化陽性PCR產(chǎn)物后送華大基因科技有限公司進行測序。

1.2.4序列分析及比對 利用DNAstar 7.0和SeqMan軟件對測序結(jié)果進行分析和拼接，拼接后的全基因組序列通過NCBI網(wǎng)站中BankIt通道上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，利用DNAStar軟件對序列進行同源性比對，利用Mega 7.0軟件對本試驗中PCV3全基因組序列、Cap蛋白序列與國內(nèi)外PCV3株以及PCV2、PCV4毒株進行遺傳進化分析，運用Neighbor-Joining方法構(gòu)建進化樹。本試驗中所使用的毒株序列等信息見表2。

表2 本試驗所用毒株信息

2 結(jié)果

2.1 川渝黔地區(qū)PCV3檢測結(jié)果檢測結(jié)果(表3)顯示，四川省9個地區(qū)145份樣本中陽性樣本2份，均來自達州某養(yǎng)殖場，陽性率1.38%(2/145)；重慶13個地區(qū)201份樣本中共檢測到陽性樣本4份，陽性率1.99%(2/201)，其中涪陵、云陽地區(qū)各2份陽性樣本均來源于不同的養(yǎng)殖場；貴州8個地區(qū)293份樣本中僅在花溪豬場檢測到陽性樣本1份，陽性率0.34%(1/293)。本次3個省(市)共檢測639份樣本，陽性樣本7份，整體陽性率1.10%，陽性樣本的PCR檢測結(jié)果見圖1。

M.DL2000 DNA Marker；1～2.重慶涪陵樣本；3～4.重慶云陽樣本；5～6.四川達州樣本；7.貴州花溪樣本圖1 PCV3陽性樣本PCR擴增結(jié)果

表3 川、渝、黔地區(qū)PCV3檢測結(jié)果 份

2.2 PCV3全基因組擴增結(jié)果對重慶云陽(2份)、涪陵(1份)、四川達州(1份)和貴州花溪(1份)共5份陽性樣本分3個片段進行全基因組序列的擴增，結(jié)果如圖2A～C所示。

A，B，C分別為5份樣本PCV3 3個片段擴增結(jié)果，目的片段分別為1 072，425，1 007 bp(M.DL2000 DNA Marker；1～2.重慶云陽樣本；3.重慶涪陵樣本；4.四川達州樣本；5.貴州花溪樣本)圖2 PCV3全基因組擴增結(jié)果

2.3 PCV3全基因組的組裝與同源性分析測序拼接結(jié)果顯示，5株P(guān)CV3全基因組均為2 000 bp，按照樣本檢出地將其分別命名為Chongqing-YY1、Chongqing-YY2、Chongqing FL、Sichuan-DZ 和

Guizhou-GYHX(登錄號分別為：OK334614～OK334618)，與NCBI數(shù)據(jù)庫中最早報道的美國PCV3 29160株(登錄號：KT869077)相比其同源性為98.8%～99.2%；與國內(nèi)其他省市毒株同源性為98.2%～99.2%；與PCV2代表毒株相比，同源性較低，僅為44.9%～45.5%；而與最新報道的PCV4 毒株的同源性為46.3%～46.9%(圖3)。

圖3 5株P(guān)CV3全基因組序列與國內(nèi)外參考毒株同源性比較

2.4 PCV3全基因組及Cap蛋白的遺傳進化分析將獲得的PCV3基因組序列與國內(nèi)外已發(fā)表毒株進行遺傳特性及親緣關(guān)系分析，通過Mega7.0軟件繪制進化樹(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重慶云陽2株(Chongqing-YY1，Chongqing-YY2)和涪陵(Chongqing FL)

為本試驗所獲得的5個PCV3全基因組序列；為GenBank中登記的川、渝、黔毒株；為美國最早報道的PCV3毒株f圖4 5株P(guān)CV3全基因組序列與參考毒株的系統(tǒng)進化樹

PCV3與PCV3-Sichuan-2020(MZ449244)位列同一支，具有較高的親緣關(guān)系。本試驗中四川達州地區(qū)毒株Sichuan-DZ與2016年湖北地區(qū)毒株P(guān)CV 3 Hubei-618(KY354039)具有較高的親緣；貴州花溪樣本與2016年廣東(KY418606)、廣西(MG250179)樣本親緣關(guān)系較為密切。與相同省份樣本(KY075990、MZ449244、MZ449237)的比對結(jié)果顯示，重慶、四川、貴州樣本均未與之前報道的序列位于一支。同時，5份樣本與PCV2和PCV4均處于不同進化分支，親緣關(guān)系較遠。

PCV3基因組中編碼Cap蛋白的核苷酸存在一致性變異，是進行基因型分類的標準[7]，因此本試驗對PCV3毒株編碼Cap蛋白的氨基酸序列進行了對比(圖5A)以及系統(tǒng)進化樹的繪制(圖5B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重慶地區(qū)的3個毒株(Chongqing-YY1，Chongqing-YY2，Chongqing FL)和四川達州地區(qū)毒株(Sichuan-DZ)均為24A(丙氨酸)/27R(精氨酸)，基因型為PCV3a，與美國29160株(KT869077)、湖北地區(qū)Hubei-618株(KY354039)、四川地區(qū)(MZ449244)和山東地區(qū)(KY778776)毒株同屬3a基因型，具有較近的親緣關(guān)系；貴州花溪毒株(Guizhou-GYHX)為24L(亮氨酸)/27K(賴氨酸)，屬于一種新的變異基因型，按照現(xiàn)有的分類標準不能準確分型。

A．5株P(guān)CV3 Cap蛋白與參考毒株氨基酸序列對比結(jié)果 B．基于PCV3 Cap序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹。為本試驗所獲得的5株P(guān)CV3 Cap蛋白序列圖5 PCV3 Cap蛋白氨基酸序列比對及遺傳進化樹

3 討論

PCV3是一種近幾年新發(fā)現(xiàn)的病毒，但研究表明其與豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙和多系統(tǒng)衰竭綜合征等密切相關(guān)，在不同年齡階段的豬組織、血樣以及糞便樣本中均有檢出[7]。該病毒于2016年首次在美國患病仔豬中發(fā)現(xiàn)，而后在其他多個國家被檢出，我國也相繼出現(xiàn)[8-9]。盡管目前PCV3的致病性研究尚未得到充分證實，但由于該病毒常與其他病原混合感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的潛在威脅。本試驗共檢測了3個省(市)639份樣本，陽性樣本7份，整體陽性率1.10%，這與張邑帆等[10]報道的2020年重慶地區(qū)PCV3 3.1%的陽性率較接近，但與孫明等[11]報道的2016-2017年間北京地區(qū)30.1% 的陽性率有較大差別。分析其原因可能有以下幾點：首先是樣本的類型不同，本試驗中所檢測的樣本以血清為主，組織病料的樣本數(shù)量相對較少，不同類型樣本的病毒載量不同有可能是造成本試驗陽性率低的原因，而陽性率較高的報道中均采用的是組織病料，包括淋巴結(jié)、肺、脾和腎等；其次，樣本采集策略不同，本試驗并未針對有特定臨床表現(xiàn)的豬進行樣本的采集，而其他研究中的樣本均采集自患繁殖障礙和嚴重呼吸道疾病的豬，推測這或許是造成陽性率差異的主要原因；最后，養(yǎng)殖規(guī)模、管理方式以及不同的時空區(qū)域等都有可能是造成陽性率差異的原因。

本試驗獲得3省市共5株P(guān)CV3的全基因組，大小均為2 000 bp，5株病毒之間同源性為98.7%～99.9%，與其他省份以及國外毒株的同源性為98.2%～99.2%，說明PCV3的序列較為保守，這與季程遠等[12]報道一致。與臨床常見的PCV2毒株相比，兩者的同源性較低，僅為44.9%～45.5%，與最新報道的PCV4 毒株的同源性也不高，為46.3%～46.9%，因此推斷PCV2、PCV3和PCV4之間的交叉保護性會很差或者不存在，由于PCV3和PCV4均為新發(fā)病原且都難于分離，因而尚均缺乏詳細的研究數(shù)據(jù)。

根據(jù)之前的報道[13-14]，PCV3 基因組中Cap基因是最容易變異的區(qū)域，也是受宿主免疫壓力選擇影響最大的區(qū)域，因此基于PCV3 Cap蛋白第24位和27位氨基酸的一致性差異，將PCV3的基因型分為3種，即PCV3a、PCV3b和PCV3c。PCV3a Cap蛋白第24位和第27位氨基酸位點為丙氨酸(A)和精氨酸(R)，PCV3b相應(yīng)的2個位點分別是丙氨酸(A)和賴氨酸(K)，PCV3c相應(yīng)的2個位點則是纈氨酸(V)和賴氨酸(K)。本試驗獲得的5株P(guān)CV3中重慶地區(qū)的3株均為PCV3a，而在此之前重慶地區(qū)最早發(fā)現(xiàn)的毒株(KY075990)為PCV3c，說明該病毒在此地區(qū)的流行基因型復(fù)雜。而本試驗鑒定的四川地區(qū)毒株與2020年報道的四川毒株(MZ449244)一致，均為PCV3a。值得注意的是本試驗中貴州地區(qū)毒株Cap蛋白的24和27位氨基酸分別為亮氨酸(L)和賴氨酸(K)，GenBank數(shù)據(jù)庫中尚未發(fā)現(xiàn)有類似突變的毒株，以現(xiàn)有的分型標準不能準確判斷其基因型，該樣本來自于貴州花溪地區(qū)一無臨床表現(xiàn)的豬血清樣本，目前尚不清楚其突變意義，需進一步深入研究。

本試驗結(jié)果也暴露出目前尚無絕對完善的PCV3基因分型方案，對其分型方法的標準仍有待于進一步研究，此外由于目前所發(fā)現(xiàn)的PCV3全基因組數(shù)量仍較少，且未見基因型與致病性相關(guān)聯(lián)的研究報道，已有學者針對現(xiàn)行的PCV3分型方法提出了是否具有必要性和現(xiàn)實意義的疑問[14]，因此對毒株進行分離以及致病性等基礎(chǔ)研究應(yīng)是將來的重點研究方向。

綜上，本試驗獲得了四川、重慶和貴州3省市PCV3感染情況的一手資料，對不同省份PCV3毒株的全基因組進行了測定和分析，其結(jié)果對了解PCV3的遺傳變異和地方流行病學特征提供了數(shù)據(jù)參考。