熊文皙,黃清俊*,黃金龍,吳范宏,樊敏偉

(1.上海應用技術大學生態(tài)技術與工程學院，上海 201418；2.上海應用技術大學化學技術與工程學院，上海 201418; 3.上海中藥制藥技術有限公司，上海 201203)

石斛通常是指蘭科石斛屬(DendrobiumSw.)多年生草本植物的總稱。其廣泛分布于日本、韓國、印度與中國等?！吨袊参镏尽穂1]記載我國石斛屬植物共有74種2變種，目前所有石斛中發(fā)現(xiàn)可藥用約為51種，有三十余種石斛有可食用記錄[2]。2020年版《中國藥典》收錄中藥石斛為金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)、霍山石斛(D.huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng)鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.)、流蘇石斛(D.fimbriatumHook.)以及鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo.)的栽培品及其同屬近似種的新鮮或干燥莖[3]。石斛具有珍貴的藥用及保健作用，其“補虛，除痹下氣，強陰益精，厚腸胃，輕身延年”，早在公元前200年，中藥學著作《神農(nóng)本草經(jīng)》便提到石斛為一種滋補品，為止血收斂劑以及止痛、消炎類的物質(zhì)[4]。

多糖為石斛發(fā)揮藥效的有效成分之一，具有廣泛生物效應。關于石斛多糖藥物，隨著現(xiàn)代藥理研究的發(fā)展，石斛多糖從提高機體免疫力到如今發(fā)現(xiàn)具有降血壓[5]、抗凝和抗血栓[6]、抗氧化衰老[7]以及抗腫瘤[8]和抑菌[9]等作用。自古以來石斛講究“鮮品為上”，干鮮石斛滋陰生津之力大不同，近代研究發(fā)現(xiàn)鮮石斛多糖含量與干石斛差異不大，還原糖及生物堿含量卻明顯高于干品[10]；1977年開始至2020年，九版《中國藥典》都收錄鮮藥石斛為藥材飲片；因植物多糖具有特殊的理化性質(zhì)，徐偉琴[11]以新鮮鐵皮石斛為原料，多元化確定鮮石斛果膠較優(yōu)提取工藝并用作增稠劑、乳化劑加以利用。

目前，直接處理鮮石斛后提取多糖相關研究較缺乏，多糖含量測定多基于從干石斛出發(fā)，大部分新鮮石斛多糖含量未有比較研究分析，含量測定也大多集中在鼓槌石斛[12]、鐵皮石斛、金釵石斛[13]和流蘇石斛[14]等。因此本實驗現(xiàn)對國內(nèi)主要26種(含一品種)新鮮石斛取樣，進行多糖含量測定，以期發(fā)現(xiàn)更多具有潛在保健價值的石斛植物，為石斛植物多糖有效成分的種類完善、篩選和推廣應用提供實驗支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

石斛均為2018年從四川、云南和安徽分別引種栽培至上海應用技術大學玻璃溫室(經(jīng)上海應用技術大學生態(tài)技術與工程學院黃清俊教授鑒定)，栽培基質(zhì)為草炭土、松樹皮、陶粒的混合基質(zhì)。于2020年9月，采集2年生石斛鮮莖段20 g，放入密封袋中立即帶回實驗室冰箱冷藏后備用。

1.2 儀器與試劑

UV-2405型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；TDL-5-A型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所)；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；D-無水葡萄糖(中國食品藥品鑒定研究院110833-201908供含量測定用)；苯酚(上海凌峰化學試劑有限公司)；濃硫酸(國藥集團化學試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 相對含水量測定

采用干燥法：首先取已100 ℃烘干30 min并冷卻潔凈后干燥的玻璃稱量瓶，稱定重量記為M1，后取健康無病害樣品莖段，稱定重量記為M。后將樣品置于玻璃稱量瓶中105 ℃殺青30 min，55℃烘干至恒重，冷卻后稱定總重量，記為M2。相對含水量=(M1+M-M2)/M*100%。

1.3.2 對照品溶液制備

取D-無水葡萄糖對照品溶液適量，精密稱定，加蒸餾水制成每1 mL含100 μg的溶液，搖勻即得。

1.3.3 供試品溶液制備

取無病蟲害并去除葉片的石斛鮮莖段約5 g，使用勻漿機反復攪碎，加蒸餾水150 mL，加熱回流2 h，放冷，轉移至250 mL容量瓶中，合并洗液后加水至刻度搖勻并過濾。精密量取續(xù)濾液10 mL置50 mL離心管中，再加入無水乙醇40 mL搖勻冷藏1 h后取出。5000 r·min-1離心20 min，棄去上清液。沉淀用8 mL 80%乙醇洗滌2次，離心10 min，棄去上清液。沉淀用熱水溶解，轉移至25 mL容量瓶中，放至室溫后加水至刻度，搖勻后作為供試品溶液備用。

1.3.4 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水至1.0 mL，依次精密加入5%苯酚溶液1 mL(現(xiàn)用配制)和硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min后置冰水浴中冷卻5 min[3]。以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2020年版四部通則0401)方法，在486 nm的波長處測定吸光度，以葡萄糖濃度(X)為橫坐標，吸光度(Y)為縱坐標，得回歸線方程為：y=8.3472x+ 0.1107(R2=0.9993)。如表1所示，葡萄糖檢測濃度0.024～0.120 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關系。

表1 線性關系Table 1 Linear Relationship Survey Results

1.3.5 多糖含量測定

分別精密量取各鮮石斛的供試品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，照1.3.4項下的方法，依次測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中D-無水葡萄糖的量，計算即得各鮮石斛多糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件對26種石斛的多糖含量進行均值、方差統(tǒng)計處理，結果以平均值±標準偏差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果和分析

2.1 方法學考察

2.1.1 波長檢測實驗

精密量取供試品溶液1 mL，以D-無水葡萄糖溶液作對照，在300～600 nm進行掃描，得出供試品與對照品最大吸收波長為486 nm，因此486 nm為檢測波長。

2.1.2 精密度實驗

精密量取D-無水葡萄糖對照品溶液0.6 mL，置10 mL具塞試管中，加水至1.0 mL，依法測定吸光度，連續(xù)測定6次，計算吸光度值的RSD為0.32%(n=6)，結果表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實驗

取同批D6石斛適量，自1.3.4項下“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法分別于0,0.5,1,1.5,2,3 h計算吸光度值的RSD為0.44%(n=6)，穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復性實驗

取同批D6石斛粉末6份，每份約5 g，按1.3.4項下測定吸光度，計算多糖含量。結果RSD值為1.95%(n=6)，表明重復性良好。

2.1.5 加樣回收率實驗

精確稱取9份已知總多糖含量的D6石斛多糖，準確加入一定量的葡萄糖對照品，制備樣品溶液，測定吸光度，得平均回收率為100.50%，RSD值為1.88%(n=9)。

2.2 石斛多糖含量測定結果

測定結果見表2所示。所測26種石斛多糖含量介于0.044%～30.086%之間，差距高達30.042%，其中霍山米斛多糖含量(30.086%)最高，與其余25種石斛有顯著性差異(P<0.05)，其次為鐵皮石斛(20.344%)、報春石斛(18.025%)和密花石斛(17.427%)。多糖含量在10%以上的有7種，除以上的4種外，還有矩唇石斛、蜻蜓石斛和血喉石斛。多糖含量在1%～10%之間的有10種，包括霍山鐵皮石斛、球花石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛等。其余9種石斛均低于1%，之間無顯著性差異(P>0.05)，最低為反瓣石斛(0.044%)。相較于王再花[15]、吳剛[16]、王曉媛[17]、秦向東[18]、姚亮[19]和金海英[20]的研究，本實驗首次新增測定矩唇石斛(13.028%)、血喉石斛(10.976%)、晶帽石斛(4.993%)、龍石斛(3.106%)、紅牙刷石斛(0.528%)和金石斛(0.531%)的多糖含量，其中包含《中國植物志》中未收錄的紅牙刷石斛、龍石斛和血喉石斛。

表2 26種石斛(含一品種)多糖含量測定結果Table 2 The polysaccharide contents of 25 kinds of Dendrobium Sw.(contains a variety) and Flickingeria comata (Bl.) Hawkes

3 討論與結論

3.1 關于石斛多糖的測定

根據(jù)DB34/T 486-2016霍山石斛安徽地方標準，霍山米斛為著名道地產(chǎn)區(qū)安徽省霍山縣所產(chǎn)霍山石斛中3種石斛之一，其在所測26種石斛中多糖含量最高，為30.086%，其多糖含量高于2020年版《中國藥典》所規(guī)定的25.0%，略高于姚亮(28.33%)[19]測量干品多糖結果，可見遺傳因素是霍山米斛多糖含量的決定性因素，因此多糖可作為霍山米斛的特征性成分，具有潛在保健藥用開發(fā)價值。

鐵皮石斛多年來一直是研究熱點之一，也是保健市場主銷產(chǎn)品，主要原因是它的石斛多糖含量比較高，研究表明鐵皮石斛多糖含量多在20%～50%[21]之間，本實驗測定多糖含量為20.344%，與云南品系干品多糖結果相較，高于李杰(17.9%)[22]低于陳丹(35.64%～39.39%)[14]、劉文杰(30.63%～35.87%)[23]的研究結果，與徐雅囡(21.85%)[24]、吳建國(15.46%～29.27%)[25]測定結果相似。霍山鐵皮石斛與鐵皮石斛是同一個生物種，霍山鐵皮石斛產(chǎn)地是安徽霍山，但此次實驗其石斛多糖含量不及四川來源的鐵皮石斛。所以，即使同種石斛，石斛多糖的含量與產(chǎn)地密切相關，不同來源地的石斛多糖含量顯著不同。

在提取多糖和測定方法相似，產(chǎn)地同為云南情況下，密花石斛、鼓槌石斛、金釵石斛、球花石斛多糖含量與王再花[15]測定干品多糖研究結果相比，密花石斛多糖測定結果(17.427%)明顯高于王再花(11.8%)，其余均低于；將本實驗產(chǎn)地為四川的鮮品流蘇石斛(3.366%)與源自云南和緬甸干品相比，多糖含量高于產(chǎn)地為云南(2.43%)[15]，低于產(chǎn)地為緬甸(26.9%)[17]，說明石斛不同形態(tài)對多糖含量具有較大影響。在不同提取多糖和測定方法情況下，孫卓然[26]與本實驗中球花石斛與疊鞘石斛產(chǎn)地均為四川，但多糖含量(18.96%；16.32%)遠高于本實驗結果，因此多糖含量與提取方式和測定方法息息相關。

本實驗中球花石斛(5.021%)與蜻蜓石斛(12.268%)多糖含量高于龔恒佩(4.42%)[27]與王曉媛(6.92%)[17]測定結果；李杰[22]測定的大苞鞘石斛(24.3%)，滕建北[28]測定的鼓槌石斛(30.65%)，秦向東[18]測定的棒節(jié)石斛(9.6%)，王曉媛[17]測定的杓唇石斛(15.98%)、疊鞘石斛(23.51%)，吳剛[16]測定的金釵石斛(39.39%)和王再花[15]測定的腫節(jié)石斛(39.1%)、報春石斛(23.2%)、杯鞘石斛(14%)、束花石斛(9.3%)和反瓣石斛(2%)均高于本實驗結果，并有明顯差異，可見石斛多糖含量受遺傳特性、種質(zhì)來源和提取方式影響極大。

3.2 關于石斛多糖的提取方式

就提取方式而言，本實驗直接處理鮮石斛進行多糖提取，因為石斛鮮莖條中含有黏液成分可直接食用，加工為干品后其黏液成分被固化而穩(wěn)定，使有效成分不易分解，營養(yǎng)成分多糖不能完全釋放，造成了極大的浪費[29]。實驗處理材料上較傳統(tǒng)方式而言，更加便捷易操作，但是鮮石斛存在有氧呼吸消耗多糖的情況，這可能導致部分石斛多糖含量有所偏低。在提取多糖和測定方法相似情況下，就霍山米斛而言，本實驗測定結果略高于姚亮[19]使用干品測量結果；鐵皮石斛多糖含量與李曉軍(25.46%～26.55%)[30]同樣直接測定鮮品和徐雅囡[24]使用干品測定結果接近，為徐程(7.05%)[31]測定鮮品多糖含量的2.8～5.1倍；王再花(6.5%)[15]與龔恒佩[27]測定球花石斛干品多糖時，含量與本實驗差異較小。因此，直接使用新鮮石斛提取多糖進行含量測定具有可行性，但需要對具體的石斛品種和提取方式進一步深入判斷分析，在使用具體石斛藥材時，也需根據(jù)其品種的具體藥性藥效決定。

3.3 結論

本實驗直接從鮮石斛提取多糖進行含量測定，測定達26種石斛，涵蓋國內(nèi)主要的石斛種類?；谑o部多糖有效成分含量指標，霍山米斛(>30%)為石斛中品質(zhì)優(yōu)良石斛種類；本實驗首次報道測定了矩唇石斛(13.028%)，血喉石斛(10.976%)，晶帽石斛(4.993%)，龍石斛(3.106%)，紅牙刷石斛(0.528%)和金石斛(0.531%)的多糖含量。石斛多糖的測定為石斛應用篩選提供了實驗基礎，而石斛多糖其潛在保健藥用價值有待研究和挖掘，相關鮮藥保鮮技術、鮮藥飲片與鮮藥制劑的研發(fā)技術還有待進一步加強。