魏嘉妤,陳明珠，彭麗娟,3*，丁海霞，田 靜

(1.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省黔東南州煙草公司岑鞏縣分公司，貴州 岑鞏 557800；3.貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

植物附生菌(epiphyte)是一類龐大且豐富的微生物群體，在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用。因生長于植物表面，其菌群數(shù)量與結(jié)構(gòu)受光、溫、水氣以及地勢等影響而發(fā)生改變；同時附生菌的生存方式不同于其他微生物類群，可通過產(chǎn)生胞外分泌物，在植物表面形成一種生物膜，使其粘合在植物表面，這可幫助附生菌有效減少菌體水分散失。附生真菌主要由酵母菌和絲狀真菌兩大類群構(gòu)成，分布在植物葉片表面的酵母菌也稱為葉棲酵母菌。目前，葉棲酵母菌的研究主要側(cè)重于分離鑒定種類以及菌種資源分布等方面。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)植物葉棲酵母菌的種類以擔子菌為主，以擲孢酵母屬 ()、隱球酵母屬()、紅酵母屬 ()等數(shù)量最多。臧威等在浙江雁蕩山山脈進行葉棲酵母菌資源考察，分離出 56 個已知類群和 19 個疑似新種，但未探究葉棲酵母菌的功能特點。

課題組前期在分離錦繡杜鵑葉腫病菌(，日本外擔菌)的過程中，分離到1株葉棲酵母菌，為探究該葉棲酵母菌具有何種功能及對植物生長發(fā)育的影響，明確該菌株的分類地位，依據(jù)菌株的形態(tài)特征和分子生物學(xué)方法進行種的鑒定，同時對其培養(yǎng)液中植物生長物質(zhì)等代謝物進行初步分析，為該菌作為微生物菌劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，以及為后續(xù)研究葉棲酵母菌在葉片表面作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年、2020年4月中旬，從貴州省貴陽市南明區(qū)鳳凰山采集的錦繡杜鵑葉腫病典型癥狀標本，分離方法參考文獻[6]，代謝組分析培養(yǎng)液參照文獻[7]進行制備。

1.2 方法

..形態(tài)特征鑒定

挑取 PDA 平板上生長 3 d 的葉棲酵母菌菌落，蔡司 Axio Image M2 光學(xué)顯微鏡下觀察測量 30 個分生孢子大??；選取在 PDA 上培養(yǎng) 10 d的葉棲酵母菌，用徠卡 M205FA 體式鏡拍攝菌落形態(tài)。

..分子生物學(xué)鑒定

PDA上25 ℃培養(yǎng)12 d的純培養(yǎng)物，用滅菌手術(shù)刀刮取 2.0 g 于2.0 mL EP ( Eppendorf )管中。用 Biomiga公司真菌DNA提取試劑盒提取總 DNA。選擇引物L(fēng)SU(NL4/NL1)和ITS(ITS5/ITS4)對菌株進行PCR擴增，所用引物信息、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參考李振英的方法，將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和純化后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

將測序結(jié)果在NCBI (http://www.ncbi.nlm.gov) 數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，提交序列至GenBank。在UNITE(https：//unite.ut.ee/#panel3)上搜索外擔菌綱相關(guān)物種和對應(yīng)種的模式菌株序列(表1)，采用最大似然法( Maximum Likehood,ML)，通過raxmlGUI 15b2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap檢驗的重復(fù)次數(shù)為1000。

表1 采用類群和序列登錄數(shù)對2種基因進行組合序列分析Tab.1 Taxa and sequence accession numbers employed in the combined two genes sequence analysis

..ITS 擴增子測序

選取新鮮有典型錦繡杜鵑葉腫病癥狀的感病葉片，用滅菌手術(shù)刀刮取表面白色子實層于無菌1.5 mL EP管中，3個重復(fù)，用干冰運送至北京諾禾致源公司對其ITS1區(qū)引物(ITS5-F和ITS1-R)進行PCR擴增測序，同時構(gòu)建PE擴增文庫，使用NovaSeq600進行上機測序。下機數(shù)據(jù)參照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質(zhì)量控制流程，經(jīng)過嚴格的過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)，利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)對所有樣本的全部 Effective Tag進行聚類，用Qiime軟件(Version 1.9.1)中的blast方法(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)與Unit (v7.2) 數(shù)據(jù)庫(https://unite.ut.ee/)進行物種注釋分析，最后將 OUTs 代表序列與相應(yīng)微生物數(shù)據(jù)庫進行比對，得到各樣本的物種分類信息與各水平注釋信息。同時，獲得基于聚類結(jié)果的多樣性分析與基于注釋結(jié)果的各分類水平物種組成信息。

..2種真菌共培養(yǎng)

參考Berendsen等的方法，挑取培養(yǎng)12 d的葉棲酵母菌與 15 d的日本外擔菌單菌落，同時接種于PDA培養(yǎng)基(?=9 cm)上，在培養(yǎng)皿底畫夾角為30°的兩條線，接種8個單菌落呈V形擺放，倒置放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天觀察2種菌間生長的變化。用徠卡 M205FA 體式鏡拍攝其培養(yǎng)菌落形態(tài)。

..基于液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)

從3瓶葉棲酵母菌培養(yǎng)液中分別取50 mL菌液移至3個無菌離心管后，參照文獻[6]的方法進行處理后用干冰送至北京諾禾致源公司，進行LC-MS/MS進行分析。

..致病性測定

分別于2021年3月12日在貴州省貴陽市南明區(qū)鳳凰山、4月14日在貴州大學(xué)西校區(qū)進行致病性測定。

采用有傷、無傷2種方法進行接種，共設(shè)8個處理(表 2)，2種接種方法各4個處理；對照、日本外擔菌菌餅、葉棲酵母菌菌餅以及混接2種菌餅。選生長健康的錦繡杜鵑幼嫩葉片用無菌水沖洗3次，使用無菌濾紙吸干葉片表面水分，接著進行接種，有傷處理用無菌一次性針筒(規(guī)格為10 mL)的針尖在葉脈兩側(cè)各輕輕劃開1個約為5 mm的傷口，無傷處理直接接種。用打孔器(?=5 mm)在培養(yǎng)好的菌種上打孔，取2個菌餅接種于葉片的葉脈兩側(cè)各1個(有傷處理接種至傷口處)，沾濕無菌水的無菌棉覆蓋菌餅，使用保鮮膜纏繞封好，維持保濕狀態(tài)。不同菌種使用記號筆在葉基部兩側(cè)上注明標記(：A；GYDJ-G：B)，每片葉接種2個菌餅，每株接種5片葉，每處理5株。錦繡杜鵑處于自然條件下生長。

表2 回接試驗Tab.2 Pathogenicity testing

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

所有數(shù)據(jù)均通過Excel 2019整理，利用SPSS 21.0 軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征及培養(yǎng)特性

從錦繡杜鵑病葉上分離到10個葉棲酵母菌純培養(yǎng)物，選取其中1株編號為GYDJ-G的觀察形態(tài)特征(圖1-a～g)。在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)12 d菌落直徑13～16 mm，單菌落為圓形(圖1-b、c)，米白色，毛絮狀，緊貼平板向上生長，長在一起形成不規(guī)則菌落(圖1-a)，培養(yǎng)3 d的菌落在顯微鏡下觀察到其擲孢子形態(tài)(圖1-d、e)：長棒狀，長10.8～19.1 μm，寬1.7～2.6 μm，有2～3個油球，油球直徑1.0～2.3 μm ，部分擲孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管(圖1-f、g)，12 d后菌落生長以菌絲為主。

注：a～c為單個擲孢子在PDA上25 ℃黑暗培養(yǎng)12 d后形成的淺色戈盧別夫氏菌菌落形態(tài); d、e為擲孢子; f、g為擲孢子萌發(fā)，bars =10 μm圖1 淺色戈盧別夫氏菌的形態(tài)特征(a-g)Fig.1 Morphological features of Golubevia pallescens(a-g)

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

測序結(jié)果顯示，葉棲酵母菌GYDJ-G ITS/LSU長度為680/622 bp，序列已上傳至NCBI網(wǎng)站。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，葉棲酵母菌以97%支持率與淺色戈盧別夫氏菌(CBS 364.85) (登錄號：DQ3176 36/AJ235292)聚在一起，形成一個明顯的分支。結(jié)合GYDJ-G 菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征分析，確定該菌株為淺色戈盧別夫氏菌。

圖2 利用LSU和ITS序列的最大似然分析構(gòu)建了GYDJ-G的系統(tǒng)發(fā)育樹，以 Entyloma arnoseridis 為外群最大似然bootstrap值(≥70%)Fig.2 Phylogenetic tree constructed by maximum likelihood analyses of LSU and ITS sequences for GYDJ-G,with Entyloma arnoseridis as outgroups.Maximum likelihood bootstrap values(≥70%)

2.3 擴增子分析

分別從屬水平與種水平分析擴增子結(jié)果。首先通過多序列比對得到top 100屬的代表序列，再選取top 34屬構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，豐度水平排名前12個屬依次為、、、戈盧別夫氏菌屬()、、外擔菌屬()、、、、、和(圖3)，其中，戈盧別夫氏菌屬和外擔菌屬豐度分別位于第4和第6位。種水平豐度前20物種系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，淺色戈盧別夫氏菌占所觀察物種比例為4.62%，占真菌序列比例為12.00%；日本外擔菌相應(yīng)比例分別為1.03%和2.67%，可聚類到日本外擔菌和淺色戈盧別夫氏菌。上述結(jié)果說明，在錦繡杜鵑葉腫病葉片上確實存在淺色戈盧別夫氏菌(圖4)。

圖3 屬水平擴增子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 A phylogenetic tree of amplifying subsystems at the genus level

圖4 種水平擴增子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 A phylogenetic tree of amplifying subsystems at the species level

2.4 2種真菌共培養(yǎng)

2種真菌共同培養(yǎng)15 d后可看出，淺色戈盧別夫氏菌與日本外擔菌在PDA平板上生長不相互排斥(圖5-a～d)，說明這2種真菌在PDA 平板上生長相互吸引，沒有拮抗作用。

注：a,2種真菌共培養(yǎng)；b,日本外擔菌菌落; c,淺色戈盧別夫氏菌菌落；d,2種真菌共培養(yǎng)菌落。圖5 日本外擔菌和淺色戈盧別夫氏菌共培養(yǎng)Fig.5 Synergistic interactions between Exobasidium japonicum and Golubevia pallescens

2.5 培養(yǎng)液代謝組分析

對培養(yǎng)液中代謝物進行分析，結(jié)果顯示培養(yǎng)液中含有557種化合物，其中正離子化合物379種，負離子化合物178種。因其代謝物中化合物種類較多，本文僅對其中植物生長物質(zhì)、氨基酸和維生素種類進行統(tǒng)計分析。淺色戈盧別夫氏菌 ()培養(yǎng)液中含有維生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B6和維生素C等5種維生素(圖6-a)；含有吲哚乙酸(IAA)、反式玉米素(trans-Zeatin)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、褪黑素(MT)、茉莉酸(JA)、亞精胺(Spermidine)和組胺(Histamine)等8種植物生長物質(zhì)(圖6-b)；含有絲氨酸(Serine)、賴氨酸(Lysine)、谷氨酸(Glutamic acid)、組氨酸(Histidine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、色氨酸(Tryptophan)、纈氨酸(Valine)精氨酸(Arginine)、脯氨酸(Proline)、焦谷氨酸(Pyroglutamic acid)和肌氨酸(Sarcosine)等11種氨基酸(圖6-c)。

注：a,維生素; b,植物生長物質(zhì); c,氨基酸，不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)。圖6 淺色戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液代謝物Fig.6 Metabolites of Golubevia pallescens in liquid culture

2.6 致病性測定結(jié)果

處理后第5天、10天、15天，有傷與無傷接種8個處理均未發(fā)病(圖7-a～f)，同時期錦繡杜鵑葉腫病在自然條件下的發(fā)病癥狀如圖7-g～i。結(jié)果表明淺色戈盧別夫氏菌不是錦繡杜鵑葉腫病的病原菌。

注：a、d,接種第 5 d ; b、 e 接種第 10 d ;c、 f,接種第 15 d；g～i,在同時間自然條件情況下，錦繡杜鵑感病癥狀。圖7 菌株GYDJ-G的致病性試驗Fig.7 Pathogenicity test of strain GYDJ-G

3 結(jié)論與討論

經(jīng)形態(tài)特征與分子生物學(xué)相結(jié)合方法鑒定，該葉棲酵母菌為淺色戈盧別夫氏菌。擴增子結(jié)果顯示，日本外擔菌和淺色戈盧別夫氏菌同時存在于錦繡杜鵑葉片上。共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)2種菌在PDA平板上相互吸引，致病性測定證明淺色戈盧別夫氏菌不是錦繡杜鵑葉腫病病原菌。在對這2種菌的分離純化過程中發(fā)現(xiàn)，淺色戈盧別夫氏菌生長速度遠快于日本外擔菌，菌落直徑比日本外擔菌大。2019、2020年均從貴州省貴陽市鳳凰山錦繡杜鵑葉腫病葉上分離到葉棲酵母菌。2019年從貴州省遵義市和貴州省遵義市鳳岡縣采集杜鵑()葉腫病分離日本外擔菌過程中，并未分離到淺色戈盧別夫氏菌。臧威等在對浙江雁蕩山葉棲酵母菌資源進行考察時，采用組織懸掛法從半枯葉片上分離到1株淺色戈盧別夫氏菌，本研究從錦繡杜鵑葉腫病葉上分離，而遵義市2個地點杜鵑()葉腫病葉上未分離到葉棲酵母菌。其中浙江雁蕩山與貴州省貴陽市鳳凰山均有大量的木本植物，而遵義市標本采集點為園林綠化區(qū)域，推測淺色戈盧別夫氏菌和日本外擔菌共同生長可能與生態(tài)條件有一定關(guān)系。

戈盧別夫氏菌屬由Wang等采用多基因分子系統(tǒng)發(fā)育分析方法建立的新屬，其模式種為淺色戈盧別夫氏菌(菌株號：CBS 364.85)，其同物異名種為腥擲孢菌屬()的。目前報道戈盧別夫氏菌屬僅有2個種，淺色戈盧別夫氏菌是1973年從日本鏈擔耳菌屬()的子實體上分離到的(http://www.indexfungorum.org/Names/NamesRecord.asp?RecordID =324632)。另1個種是異形戈盧別夫氏菌()，菌落為奶油色或白色，擲孢子與淺色戈盧別夫氏菌相似，呈圓柱形、細長形或月形，在歐洲多國引起蘋果果實白斑病。

本研究基于液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)對淺色戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液中代謝物進行分析，其培養(yǎng)液中含有8種植物生長物質(zhì)，有研究表明一些微生物可產(chǎn)生植物生長物質(zhì)，對植物生長有一定調(diào)控作用。高繪菊等報道桑樹內(nèi)生拮抗細菌枯草芽孢桿菌 ()能產(chǎn)生植物生長激素IAA，該菌株的培養(yǎng)液和菌體懸浮液及胞外分泌物對桑樹()和玉米()幼苗有較明顯的促生作用；Mehmood等從受到干旱脅迫的催眠睡茄()葉片中分離到1株內(nèi)生真菌正泡盛曲霉()，該菌產(chǎn)生3-吲哚乙酸(IAA)、酚類和糖類等次生代謝物，可有效定殖于玉米根系并促進玉米生長。韓麗珍等從茶樹根際分離出6株根際促生菌，其分屬于假單胞菌屬(sp.)、芽孢桿菌屬(sp.)、束村氏菌屬(sp.)、伯克霍爾德氏菌屬(sp.)和根瘤菌屬(sp.)，均有產(chǎn)IAA能力，具有良好的促生性能。而淺色戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液的代謝物會通過何種方式影響植株的生長發(fā)育尚未明確，值得進一步研究。