萬志平 楊小安 鄧洪

目前，非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是世界上慢性肝病的最常見原因，影響著全球近25%的人口。NAFLD 是指排除酒精和其他明確的肝損害所致的、以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征。其疾病譜包括單純性肝臟脂肪變性（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化以及肝細胞癌。NASH 的病理表現(xiàn)有肝細胞脂肪變性、氣球樣變，巨噬細胞活化浸潤等。肝臟中的巨噬細胞群由肝巨噬細胞和單核細胞衍生的浸潤性巨噬細胞組成，它們根據(jù)接收到的信號分化為M1 型或M2 型巨噬細胞，表達相應(yīng)的分子標志物，以調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)。肝細胞脂肪變性是NAFLD 的早期事件也是NASH 發(fā)生及進展的前提條件，而巨噬細胞的活化與NASH 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。目前巨噬細胞活化的機制仍未完全闡明。近年細胞外囊泡（EV）引起了研究人員的廣泛關(guān)注。EV 是一種微小的膜囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑為30～150 nm。絕大多數(shù)細胞都能分泌EV，而且來自不同細胞類型的EV 可以將特征性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸轉(zhuǎn)運到受體細胞，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。細胞間的通信除旁分泌途徑外，還可以由EV 介導(dǎo)，因此不能忽視EV 在NASH 發(fā)生、發(fā)展中的作用。本文探討由脂肪變性肝細胞分泌的EV對巨噬細胞活化的影響，為深入理解EV 在NASH發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、NASH 動物模型的構(gòu)建

10 只6～7 周齡（體質(zhì)量180～200 g）的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)，飼養(yǎng)于溫度可控的無病原體環(huán)境中，光照/黑暗循環(huán)12 h，能自由獲取食物和水。經(jīng)過1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，SD 大鼠按體質(zhì)量匹配分為常規(guī)飲食組（Control 組，n = 5）和高脂肪高膽固醇（HFHCD）飲食組（HFHCD 組，n = 5），分別予常規(guī)飼料和HFHCD 飼料喂養(yǎng)。24 周后Control 組和HFHCD組大鼠禁食過夜，施以安樂死后收集它們的肝臟，并儲存在-80 ℃冰箱。所有的動物實驗均經(jīng)過中山大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準（批件號：IACUC-AEWC-F2008032），并符合《動物研究：體內(nèi)實驗報告（ARRIVE）指南》以及美國國立衛(wèi)生研究院的實驗動物護理和使用指南。

二、細胞模型的構(gòu)建

人肝癌細胞系（HepG2 細胞）培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中。當HepG2 細胞生長密度達到80%時，將細胞鋪至6 孔板，分別添加不同濃度的棕櫚酸（PA）。按PA 含量分為6 組，即0 mmol/L 組、0.1 mmol/L 組、0.2 mmol/L組、0.3 mmol/L 組、0.4 mmol/L 組和0.5 mmol/L 組。24 h 后用油紅O 染色劑（Servicebio）染色觀察細胞內(nèi)脂滴沉積的情況。對于細胞活力檢測，則將細胞鋪至96 孔板，24 h 后用CCK-8 檢測試劑盒（TargetMol）檢測6 組細胞的活力。

人單核巨噬細胞（THP-1 細胞）培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在THP-1細胞生長密度達到80%時，將原培養(yǎng)基更換為含有100 ng/mL 的佛波酯中，24 h 后THP-1 將會貼壁成為M0 型巨噬細胞。

三、大鼠肝組織病理和免疫熒光染色

HFHCD 組和Control 組大鼠肝組織經(jīng)石蠟包埋后制作3～5 μm 厚的石蠟切片，然后將石蠟切片脫水并用HE（Servicebio）或 Masson（Servicebio）染色劑染色。油紅O 染色為從-80℃冰箱取出肝組織制備冰凍切片，隨后用油紅O 染色劑（Servicebio）染色并用蘇木素復(fù)染。免疫熒光染色為冰凍切片在進行封閉后，與抗CD68（1∶50，Proteintech）和CD86（1∶50，Santa Cruz）的抗體在4℃下孵育過夜，然后與熒光標記的二抗（1∶500，Invitrogen）在室溫下孵育60 min。最后，切片用4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色劑核染，再滴入抗猝滅劑進行封片后鏡檢拍照。

四、EV 分離與鑒定

根據(jù)既往文獻［12-13］報道的方法，從HepG2細胞培養(yǎng)液中分離EV ：將培養(yǎng)液以300×g 離心10 min 和2000×g 離心20 min 以去除細胞和細胞碎片，然后再以10 000×g 離心30 min 去除大囊泡，最后將培養(yǎng)液以100 000×g 超速離心70 min后沉淀EV，并在磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗滌純化EV。通過透射電子顯微鏡（JEM-1200EX）和納米粒子跟蹤分析（NanoSight NS300）鑒定分離的EV。將經(jīng)PA 干預(yù)Hep2 細胞培養(yǎng)液中分離的EV設(shè)為PA組，未經(jīng)PA 干預(yù)Hep2 細胞培養(yǎng)液中分離的EV 設(shè)為Con組。

五、蛋白質(zhì)提取和蛋白免疫印跡法檢測

使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液（Thermo Fisher Scientific）從細胞及分離的EV 中提取總蛋白（以細胞裂解液為對照），然后對樣品進行凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，分別在抗CD63（1∶1000，Immunoway）、CD81 （1∶1000，Immunoway） 和TSG101（1∶1000，Immunoway）的抗體中4 ℃孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（1∶10 000，Abcam）常溫孵育60 min 后，使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)條帶。

六、EV 攝取實驗

用紅色熒光染料PKH26 標記脂肪變性肝細胞分泌的EV 后，將其添加至M0 型巨噬細胞的培養(yǎng)基，6 h 后棄上清，PBS 洗滌之后用DAPI 染核，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察EV 被M0 型巨噬細胞攝取的情況。

七、EV 干預(yù)實驗

用BCA 試劑盒檢測提取的EV 濃度，然后將EV 添加至M0 型巨噬細胞培養(yǎng)基，使其工作濃度為50 μg/mL。并在干預(yù)48 h 后收集細胞，用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）和流式細胞術(shù)檢測M1 型巨噬細胞標志物的表達。

八、細胞共培養(yǎng)實驗

將脂肪變性肝細胞（PA 干預(yù)后的HepG2 細胞）與M0 型巨噬細胞在Transwell 小室中共培養(yǎng)，同時加或不加EV 抑制劑GW4869（PA+GW4869組或PA 組），并設(shè)未經(jīng)PA 干預(yù)的對照組（Con 組及Con+GW4869 組）。在48 h 后收集巨噬細胞，檢測相關(guān)指標的表達。

九、RNA 提取和RT-qPCR 檢測

使用TRIzol RNA 抽提試劑（Invitrogen）用于提取細胞RNA。應(yīng)用PrimeScriptRT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA 后，再使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（TaKaRa） 進行RT-qPCR 反應(yīng)， 反應(yīng)體系的配制以及反應(yīng)流程均參照試劑盒說明書。采用2法分析計算目的基因的相對表達水平。所用基因的引物序列如下：IL-1β 正向5′-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3′、反向5′-GT CGGAGATTCGTAGCTGGA-3′，產(chǎn)物長度131 bp；IL-18正向5′-TCTTCATTGACCAAGGAAATCGG-3′、反向5′-TCCGGGGTGCATTATCTCTAC-3′，產(chǎn)物長度75 bp；TNF-α 正向5′-AGCCCATGTTGTAGCAAACC-3′、反向5′-TGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3′，產(chǎn)物長度134 bp；β-actin 正向5′-TGTGGATCGGTGGCTCCA TCCT-3′、反向5′-AAACGCAGCTCAGTAACAGTCC GC-3′，產(chǎn)物長度137 bp。

十、流式細胞術(shù)檢測

巨噬細胞在室溫下在黑暗中用 PE 偶聯(lián)的抗CD86（eBiosciences）染色30 min。 隨后用含有2%胎牛血清的PBS 洗滌并重懸細胞，最后通過流式細胞儀分析CD86細胞的比例。原始數(shù)據(jù)通過CytExpert 軟件進行分析。

十一、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、NASH 動物模型中M1 型巨噬細胞標志物表達升高

用HFHCD 飼料喂養(yǎng)SD 大鼠24 周后，大鼠肝組織出現(xiàn)了明顯的脂肪堆積、肝細胞氣球樣變，并可見部分纖維化，表明NASH 動物模型構(gòu)建成功，見圖1A～C。大鼠肝組織免疫熒光染色可見HFHCD 組CD68CD86細胞數(shù)較Control 組增多（t = 2.990，P = 0.017），表明NASH 肝臟內(nèi)M1 型巨噬細胞發(fā)生活化，見圖1D、E。

圖1 NASH 動物模型中M1 型巨噬細胞標志物的表達

二、脂肪變性肝細胞通過分泌EV 促進M1 型巨噬細胞活化

分別用0～0.5 mmol/L 的PA 干預(yù)HepG2 細胞24 h 后進行油紅O 染色，結(jié)果顯示0.3 mmol/L 以上的PA 可使HepG2 細胞發(fā)生明顯脂肪變性，即成功構(gòu)建了脂肪變性肝細胞模型，見圖2A。由于高濃度的PA 干預(yù)會導(dǎo)致細胞活力下降，通過分別測定0～0.5 mmol/L PA 干預(yù)后的HepG2 細胞活力（結(jié)果依次為100.0%、95.8%、93.4%、90.6%、86.8%和81.7%），表明0.3 mmol/L 最為合適（不低于90%），見圖2B。將脂肪變性肝細胞與M0 型巨噬細胞共培養(yǎng)，同時加或不加GW4869，RTqPCR 結(jié)果可見PA 組M1 型巨噬細胞標志物IL-1β（q = 10.360，P ＜ 0.001）、IL-18（q = 6.441，P =0.008）較Con 組升高，而PA+GW4869 組的M1 型巨噬細胞標志物與Con+GW4869 組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞ 0.05），見圖2C。通過流式細胞術(shù)可見PA 組CD86細胞比例較Con 組升高（q= 4.428，P = 0.038），而PA+GW4869 組CD86細胞比例與Con+GW4869 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05），表明脂肪變性肝細胞能通過分泌EV促進M1 型巨噬細胞活化，而EV 抑制劑可阻斷這種促進作用，見圖2D、E。

圖2 脂肪變性肝細胞分泌的EV 對M1 型巨噬細胞活化的影響

三、脂肪變性肝細胞分泌的EV 特征

用0.3 mmol/L PA 干預(yù)HepG2 細胞24 h 后，收集細胞上清，提取EV 進行鑒定。電鏡觀察可見Con組與PA組的EV 均呈典型的茶托杯狀囊泡結(jié)構(gòu)，見圖3A。粒徑分析結(jié)果顯示2 組的EV 大小主要為30～150 nm，但PA組EV 的直徑稍大于Con組（t = 7.631，P = 0.003），且濃度也高于Con組，見圖3B、C。另外，蛋白免疫印跡法顯示2 組提取物均表達EV 的標志物CD63、CD81 和TSG101，表明脂肪變性肝細胞的上清液存在EV，并且能夠被提取，見圖3D。

圖3 脂肪變性肝細胞分泌的EV 特征

四、脂肪變性肝細胞來源的EV 促進M1 型巨噬細胞活化

用紅色熒光染料PKH26 標記EV，并添加至M0 型巨噬細胞培養(yǎng)基后，在熒光顯微鏡可觀察到紅色信號出現(xiàn)在M0 型巨噬細胞內(nèi)，表明M0 型巨噬細胞可成功吸收脂肪變性肝細胞來源的EV，見圖4A。進一步RT-qPCR 結(jié)果可見PA組M1 型巨噬細胞標志物IL-1β（t = 21.280，P ＜ 0.001）、IL-18（t = 13.830，P ＜ 0.001）、TNF-α（t =20.840，P ＜ 0.001）均高于Con組，見圖4B。流式細胞術(shù)檢測可見PA組CD86細胞比例高于Con組（t = 46.680，P ＜ 0.001），表明脂肪變性肝細胞分泌的EV 能促進M1 型巨噬細胞活化，見圖4C、D。

圖4 脂肪變性肝細胞來源的EV 對M1 型巨噬細胞活化的影響

討 論

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD 患病率明顯升高，已成為嚴重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。NASH 是NAFLD 啟動向嚴重肝損害進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前仍然缺乏有效的藥物治療NASH，如何預(yù)防NASH 發(fā)生并尋找潛在治療靶點是臨床關(guān)注的熱點。盡管從NAFL 發(fā)展為NASH 的潛在機制尚不明確，但越來越多的研究表明，巨噬細胞的活化是NASH 發(fā)生和發(fā)展的重要事件。在NAFLD 進展過程中，肝細胞的脂肪變性往往早于巨噬細胞的活化，脂肪變性肝細胞的分泌物質(zhì)可能會促進巨噬細胞的活化。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EV 可以作為細胞間的通信媒介，在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮極其重要的作用。作為細胞間的通信媒介，EV 可以有效保護mRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到受體細胞中發(fā)揮其生物學(xué)功能。已有研究者發(fā)現(xiàn)EV 可作為NAFLD 肝臟內(nèi)多種細胞間交流的重要媒介。例如巨噬細胞可將具有抗纖維化作用的EV 轉(zhuǎn)移到肝實質(zhì)細胞內(nèi)，抑制 NAFLD 相關(guān)的纖維化。脂毒性肝細胞釋放的EV 可以促進肝星狀細胞的活化和增殖，從而加速代謝相關(guān)性脂肪肝疾病的進展。

本研究在HFHCD 飲食構(gòu)建的NASH 動物模型中發(fā)現(xiàn)，HFHCD 組大鼠肝臟內(nèi)肝細胞發(fā)生脂肪變性，M1 型巨噬細胞的標志物表達上升。進一步構(gòu)建脂肪變性肝細胞模型并分離鑒定其分泌的EV，然后通過共培養(yǎng)實驗?zāi)M肝內(nèi)環(huán)境，證實脂肪變性肝細胞分泌的EV 可以促進M1 型巨噬細胞的活化。而在施以EV 抑制劑之后，這種促進作用則會受到阻斷。

綜上所述，脂肪變性肝細胞在NASH 進展中的炎癥反應(yīng)，部分是其分泌的EV 導(dǎo)致的。脂肪變性肝細胞分泌的EV 被肝巨噬細胞攝取之后，釋放其中的促炎物質(zhì)，導(dǎo)致M1 型巨噬細胞活化。而活化的M1 型巨噬細胞分泌各種促炎因子，加重NASH 的炎癥反應(yīng)，甚至?xí)碳れo止的肝星狀細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨母涡菭罴毎?，從而?dǎo)致纖維化的發(fā)生，推動了NASH 的進展。本研究進一步說明脂肪變性肝細胞分泌的EV 在促進M1 型巨噬細胞活化加重NASH 進展的潛在機制，為預(yù)防NASH 發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。