田新民 廉明棟 宋雅祺 劉小慧 楊孟平 陳紅

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牡丹江 157011）

小飛鼠(Pteromys volans)隸屬哺乳綱(Mammalia)嚙齒目(Rodentia)鼯鼠科(Pteromyidae)飛鼠屬，為樹(shù)棲夜行滑行類(lèi)物種。在國(guó)外主要分布于歐亞大陸北部，我國(guó)主要分布在東北、華北、西北等北方林區(qū)(蔣志剛等，2015)。不合理的森林采伐，生境的喪失與破碎化，已導(dǎo)致全球許多地區(qū)的小飛鼠種群處于瀕危狀態(tài)(Leeet al.,2008a;Nummertet al.,2020)。小飛鼠作為森林可持續(xù)經(jīng)營(yíng)的重要指示和傘護(hù)物種(Hurmeet al.,2007)，我國(guó)也將其列為“易?！迸c“三有”的重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物(王志寶，2000；蔣志剛等，2016)。目前國(guó)外在小飛鼠巢址選擇、家域、擴(kuò)散、遺傳多樣性和分子系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域已開(kāi)展系列研究(Hanskiet al.,2000;Selonen and Hanski,2004;Nakama and Yanagawa,2009;Lampilaet al.,2009;Yalkovskayaet al.,2015)，而國(guó)內(nèi)僅在樹(shù)洞巢穴保溫機(jī)制方面有相關(guān)報(bào)道(陳亮，2018)，在生態(tài)學(xué)其他領(lǐng)域，特別是對(duì)這一物種的種群遺傳學(xué)研究還存在空白。

種群遺傳多樣性和歷史動(dòng)態(tài)是衡量物種生存與利用的重要指標(biāo)(Haiget al.,1990)，特別是遺傳多樣性的降低與近交衰退會(huì)導(dǎo)致物種滅絕，其遺傳信息評(píng)價(jià)結(jié)果可為物種實(shí)施科學(xué)的保護(hù)與管理(Frankhamet al.,2010；張于光等，2019)。我國(guó)東北地區(qū)曾受森林采伐、盜獵、氣候變化等因素的影響，使許多物種面臨生存威脅，導(dǎo)致物種的近交、遺傳多樣性喪失、種群遺傳分化等遺傳信息發(fā)生改變(魏輔文等，2021；田新民，2021；Chenet al.,2022)。黑龍江省張廣才嶺北部為長(zhǎng)白山脈與小興安嶺之間許多物種遷移的重要生態(tài)廊道區(qū)域，該區(qū)域的物種保護(hù)與生態(tài)修復(fù)備受關(guān)注(李維平等，2017；田新民，2021)。因此，本研究基于mtDNACyt b、控制區(qū)和nDNA的微衛(wèi)星3種分子標(biāo)記，分析小飛鼠的遺傳特性及系統(tǒng)進(jìn)化，從分子水平上揭示小飛鼠種群的動(dòng)態(tài)變化及其遺傳學(xué)機(jī)制，為該物種種群遺傳資源的保護(hù)與管理奠定基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 研究地區(qū)概況

研究地區(qū)位于黑龍江省張廣才嶺北部的賓縣林區(qū) (北緯 45°30′～ 46°01′，東經(jīng) 126°55′～ 128°19′)，地處松花江南岸(圖1)。該地區(qū)屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫3.9℃，年平均降雨量681 mm，無(wú)霜期130 d左右，屬長(zhǎng)白山植物區(qū)系。林區(qū)經(jīng)營(yíng)總面積1 110.81 km2，其中天然林面積675.76 km2，天然林中以闊葉林為主，針闊混交林和針葉林分布極少。人工林面積為272.72 km2，其中以落葉松林為主。分布的樹(shù)種有紫椴(Tilia amurensis)、胡桃楸 (Juglans mandshurica)、水曲柳(Fraxinus mandshurica)、白樺 (Betula platyphylla)和蒙古櫟(Quercus mongolica)等，這些樹(shù)種為小飛鼠提供了洞巢保障。該區(qū)域內(nèi)的紫貂(Martes zibellina)、黃喉貂(Martes flavigula)、黃鼬(Mustela sibirica)和豹貓(Prionailurus bengalensis)等食肉類(lèi)為小飛鼠的主要天敵。

圖1 本研究的采集樣點(diǎn)分布圖Fig.1 Sampling sites of this study

1.2 樣品采集及DNA提取

2018年與2019年10—12月，對(duì)研究地區(qū)的小飛鼠毛發(fā)樣本進(jìn)行采集。在野外尋找小飛鼠的樹(shù)洞巢，敲擊樹(shù)干發(fā)現(xiàn)個(gè)體后，采用網(wǎng)捕的方法在洞口處捕獲個(gè)體。在個(gè)體尾部取20根帶有毛囊的毛發(fā)樣本，收集于封口袋內(nèi)，標(biāo)號(hào)并GPS定位。在捕獲個(gè)體尾端剪掉部分毛發(fā)標(biāo)記，避免個(gè)體重復(fù)采樣，最后將個(gè)體放歸野外。用同樣的方法，兩年期間，共采集29份毛發(fā)樣本，-20℃保存?zhèn)溆谩４送?，在張廣才嶺中部的黑龍江省牡丹江市三道關(guān)林場(chǎng)采集3份毛發(fā)樣本；大興安嶺北部?jī)?nèi)蒙古根河市區(qū)域的金河林業(yè)局采集1份毛發(fā)樣本(陳亮、張子棟提供)，該4份樣本僅用于小飛鼠系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析。

DNA提取時(shí)，從毛發(fā)根部毛囊處取約0.5 cm長(zhǎng)的一段，用75%的乙醇清洗兩次以除菌，蒸餾水再清洗一次，棄廢液后于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)55℃干燥。將處理后的20根毛囊樣本，使用TIANamp Micro DNA Kit試劑盒(天根，北京)，并參考使用說(shuō)明書(shū)對(duì)樣本進(jìn)行DNA提取。為進(jìn)一步驗(yàn)證所用樣本來(lái)自不同個(gè)體，基于后續(xù)微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)，利用軟件Excel mircosatellite tool kit(Park,2001)，尋找數(shù)據(jù)中相匹配的基因型。不同樣本，所有位點(diǎn)的基因型相同或只有1個(gè)位點(diǎn)的1個(gè)等位基因存在差異，可判定為同一個(gè)體(Bellemainet al.,2005)。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)已發(fā)表小飛鼠mtDNA全序列(Ryuet al.,2013;Limet al.,2018)，利用Primer Premier v 5.0(Singhet al.,1998)設(shè)計(jì)引物用于mtDNACyt b和控制區(qū)全序列的擴(kuò)增。Cyt b擴(kuò)增引物，上游：5′-ACA TGG AAT CTAACC ATG ACC AA-3′，下游：5′-AGA CTT CAT TGT TGG TTT ACA AGA C-3′?？刂茀^(qū)擴(kuò)增引物，上游：5′-GTT CCA CCT TCA ACT CCC AAA-3′，下游：5′-CAT TTT CAG TGC TTT GCT TTG AT-3′。

根據(jù)GenBank中報(bào)道的微衛(wèi)星位點(diǎn)，結(jié)合Painter等 (2004)、Kiesow 等 (2011)、Zittlau 等(2000)、Jumpa等 (2015)、Hale等 (2001)和 Todd(2000)等文獻(xiàn)，選取鼯鼠科(Pteromyidae)小飛鼠指名亞種(P.v.volans)、北美飛鼠(Glaucomys sabrinus)、海南小飛鼠(Hylopetes phayrei)和赤頰林飛鼠 (Hylopetes sagitta)，松鼠科 (Sciuridae)北松鼠(Sciurus vulgaris)5個(gè)物種中擴(kuò)增效果較好的34對(duì)引物，以本研究中的小飛鼠DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)。最終獲得并使用擴(kuò)增穩(wěn)定、具多態(tài)性的12個(gè)位點(diǎn)，其上游引物5′端進(jìn)行熒光標(biāo)記 (Fam、Hex、Tamra或Rox)(表1)。

表1 本研究選取的12對(duì)微衛(wèi)星引物信息Table 1 Details of 12 microsatellite loci used for the study

三種分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系均為20 μL：5 U/μL Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa， Japan)0.1 μL， 10 × Buffer 2 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μL，模板 DNA 1.5 μL，PCR grade water(天根，北京)13.8 μL。PCR 反應(yīng)條件均為：94℃，2 min；(94℃，30 s；Ta，30 s；72℃，30 s)× 35 cycles；72℃，10 min。其中，Cyt b和控制區(qū)引物的退火溫度(Ta)均為55℃，微衛(wèi)星引物的退火溫度見(jiàn)表1。對(duì)于微衛(wèi)星位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增選擇3次重復(fù)，其中2次及以上重復(fù)均只獲得1條PCR產(chǎn)物帶的判定為純合子，3次重復(fù)均為2條PCR產(chǎn)物帶的判定為雜合子(張于光等，2019)。為了監(jiān)測(cè)污染，在擴(kuò)增的同時(shí)均附加一個(gè)不含DNA的陰性對(duì)照。所有的引物合成、雙向測(cè)序和基因分型均由上海生工完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

mtDNACyt b和控制區(qū)序列，首先利用Clustal X 2.1(Larkinet al.,2007)進(jìn)行序列比對(duì)。然后用DnaSP 5.10(Librado and Rozas,2009)計(jì)算種群的變異位點(diǎn)數(shù)(S)、單倍型數(shù)量(H)、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)，并進(jìn)行錯(cuò)配分布(Mismatch distributions)分析，以通過(guò)單倍型差異分布來(lái)估測(cè)種群歷史擴(kuò)張事件。通過(guò)Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗(yàn)來(lái)判斷種群是否顯著偏離中性突變，進(jìn)一步評(píng)價(jià)種群的歷史擴(kuò)張事件或瓶頸效應(yīng)。利用Network 4.6(Bandeltet al.,1999)，基于Median-joining算法，構(gòu)建小飛鼠的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，分析單倍型間的進(jìn)化關(guān)系。

為探討小飛鼠系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從GenBank下載小飛鼠Cyt b序列 (1 068 bp)共51條 (表2)，合計(jì)本研究的18個(gè)單倍型，其中賓縣樣本14個(gè)單倍型(代碼：CHB1～CHB14)、三道關(guān)樣本3個(gè)單倍型(代碼：CHS1～CHS3)和根河樣本1個(gè)單倍型(代碼：CHG)，共計(jì)69條序列。利用BEAST 1.6.1(Drummondet al.,2012)，基于貝葉斯法(Bayesian inference,BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；并通過(guò)jModelTest 2.1.10(Darribaet al.,2012)檢驗(yàn)選擇最優(yōu)替換模型及相關(guān)參數(shù)(HKY+G)。以日本小飛鼠(Pteromys momonga)(單倍型：PM01和PM02，GenBank登錄號(hào)：AB164675和AB164676)作為外群，以獲取發(fā)育樹(shù)的根。構(gòu)建BI樹(shù)時(shí)，以MCMC運(yùn)行3 000 000代，每100代抽樣1次，舍棄前25%的老化值，并用貝葉斯后驗(yàn)概率評(píng)估各節(jié)點(diǎn)的支持率。僅顯示50%以上的支持率，并對(duì)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行美化。

表2 GenBank下載的小飛鼠Cyt b基因信息Table 2 Mitochondrial cytochrome b gene of Siberian flying squirrel from GenBank

基于微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)，首先利用Microchecker 2.2.3(van Oosterhoutet al.,2004)檢測(cè)各位點(diǎn)是否存在無(wú)效等位基因(Null allele)，判斷位點(diǎn)是否存在嚴(yán)重的分型錯(cuò)誤及能夠滿(mǎn)足遺傳學(xué)分析要求。然后利用GenAlEx 6.0(Peakall and Smouse,2006)計(jì)算種群的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和近交系數(shù)(Fis)。用Excel mircosatellite tool kit(Park,2001)計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)，PIC＞0.5的位點(diǎn)判定為高多態(tài)性位點(diǎn)(Botsteinet al.,1980；田新民，2021)。再利用Genepop 4.0(Raymond and Rousset,1995)檢測(cè)種群和各位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡，以及位點(diǎn)間的連鎖不平衡，概率檢驗(yàn)采用馬可夫鏈法(Markov chain method)，參數(shù)為10 000 dememorization、20 batch和5 000 iteration。最后，兩個(gè)檢驗(yàn)以Bonferroni法對(duì)顯著性進(jìn)行修正。

此外，基于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)，利用Bottleneck 1.2(Piryet al.,1999)進(jìn)一步檢測(cè)小飛鼠種群是否經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)，選擇兩階變異模型(Two-phase model,TPM)和逐步突變模型(Stepwise mutation model,SMM)進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次，其中TPM被認(rèn)為是微衛(wèi)星分析的最適合模型(Ellegren,2004)。TPM選擇79%變異遵從SMM，變異系數(shù)為 9%(Piryet al.,1999)。利用 Structure 2.3.4(Pritchardet al.,2000)進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，參數(shù)為L(zhǎng)ength of Burnin Period 100 000，Number of MCMC Reps after Burnin 10 000，K=1～6，Number of Iterations 20。運(yùn)算結(jié)果上傳Structure Harvester Web v0.6.94(Earl and vonHoldt,2012)進(jìn)一步分析，以Ln Pr(X|K)曲線最大峰值來(lái)判斷種群遺傳結(jié)構(gòu)的最佳分組數(shù)K。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA序列分析

29個(gè)mtDNACyt b全序列(1 140 bp)中共檢測(cè)到變異位點(diǎn)34個(gè)，其中單變異位點(diǎn)11個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)23個(gè)。堿基含量為A 27.9%、T 31.0%、C 28.6%、G 12.4%，A+T含量(58.9%)高于C+G含量(41.0%)。堿基變異均為轉(zhuǎn)換和顛換，無(wú)缺失或插入，轉(zhuǎn)換(顛換)平均值為16.00。在29個(gè)樣本中得到26個(gè)控制區(qū)全序列(1 066 bp)，檢測(cè)到72個(gè)變異位點(diǎn)，其中單變異位點(diǎn)24個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)47個(gè)。堿基含量為A 31.9%、T 30.9%、C 26.0%、G 11.2%，A+T含量 (62.8%)高于C+G含量(37.2%)。堿基變異多為轉(zhuǎn)換和顛換，有1個(gè)缺失或插入，轉(zhuǎn)換(顛換)平均值為5.25。兩種序列，均存在明顯的AT偏倚性，且G含量最低(圖2，3)。

2.2 遺傳多樣性評(píng)價(jià)

對(duì)于mtDNA數(shù)據(jù)，在29條Cyt b序列中共檢測(cè)到14個(gè)單倍型，其中單倍型多樣性指數(shù)(Hd)為0.909±0.031，核苷酸多樣性指數(shù) (Pi)為(0.616±0.065)%。26條控制區(qū)序列中存在15個(gè)單倍型，其中Hd為0.945±0.024，Pi為(1.698±0.068)%(表3)。兩種序列中僅有1只個(gè)體的稀有單倍型均占多數(shù)，Cyt b和控制區(qū)都為9個(gè)，分別占各自所有單倍型的64.29%和60.00%(圖2～4)。

圖2 小飛鼠種群14個(gè)Cyt b單倍型變異位點(diǎn).N：具有相同單倍型的個(gè)體數(shù)量Fig.2 The variable sites of 14 cytochrome b haplotypes identified in Siberian flying squirrel population.N:Number of individuals with each haplotype

圖3 小飛鼠種群15個(gè)控制區(qū)單倍型變異位點(diǎn).N：具有相同單倍型的個(gè)體數(shù)量Fig.3 The variable sites of 15 control region haplotypes identified in Siberian flying squirrel population. N: Number of individuals with each haplotype

圖4 基于Cytb(A)與控制區(qū)(B)序列構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖.圓形面積代表單倍型頻次，空心點(diǎn)代表缺失的單倍型Fig.4 Median-joining network of haplotypes based on Cytb(A)and control region(B).The size of each circle represents the frequency of haplotypes,and small hollow dot represents missing haplotype

表3 基于Cyt b與控制區(qū)序列的種群遺傳多樣性分析Table 3 Analysis of population genetic diversity based on cytochrome b(Cyt b)and control region(CR)

基于微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)，證實(shí)29份毛發(fā)樣本DNA均來(lái)自不同個(gè)體。12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)經(jīng)過(guò)Microchecker檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有無(wú)效等位基因，位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡。29只個(gè)體均獲得12個(gè)位點(diǎn)的準(zhǔn)確基因型，其中種群平均等位基因數(shù)(Na)為(13.167±2.725)個(gè)，有效等位基因數(shù) (Ne)為(7.714±1.887)個(gè)，各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)顯著少于實(shí)際等位基因數(shù)(P＜0.01)。12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC為0.806～0.908，皆為高多態(tài)性位點(diǎn)(PIC＞0.5)。遺傳多樣性顯示，種群的觀測(cè)雜合度 (Ho)為0.727±0.175，期望雜合度 (He)為0.864 ± 0.033(表4)。

表4 基于12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的種群遺傳多樣性分析Table 4 Analysis of population genetic diversity based on 12 microsatellite loci

2.3 種群歷史動(dòng)態(tài)分析

mtDNACyt b基因和控制區(qū)序列構(gòu)建的錯(cuò)配分布圖呈明顯的多峰曲線狀態(tài)(圖5)?；谥行詸z驗(yàn)，Tajima’s D和Fu’s Fs的結(jié)果也均未顯著偏離零(P＞0.05)，種群沒(méi)有顯著偏離中性突變(表3)。兩種分析方法結(jié)果表明，小飛鼠種群經(jīng)歷了比較復(fù)雜的種群歷史，沒(méi)有發(fā)生過(guò)歷史擴(kuò)張事件。微衛(wèi)星的種群瓶頸效應(yīng)檢測(cè)顯示，TPM和SMM模型中均未發(fā)現(xiàn)顯著的雜合度過(guò)剩(P＞0.05)，同時(shí)等位基因頻率沒(méi)有顯著偏離正態(tài)L-shaped分布。再結(jié)合Cyt b和控制區(qū)的中性檢驗(yàn)結(jié)果，均未檢測(cè)到小飛鼠種群近期的遺傳瓶頸效應(yīng)。

圖5 基于Cyt b(A)和控制區(qū)(B)序列的小飛鼠種群錯(cuò)配分布圖Fig.5 Mismatch distribution for Siberian flying squirrel population based on Cyt b(A)and control region(B)

微衛(wèi)星數(shù)據(jù)顯示，種群觀測(cè)雜合度顯著小于期望雜合度(P＜0.05)，呈現(xiàn)一定程度的雜合度不足，種群的近交系數(shù)0.159，為極顯著偏離零的正值(P＜0.01)(表4)，表明小飛鼠種群存在近親繁殖情況。根據(jù)STRUCTURE軟件的種群遺傳結(jié)構(gòu)表明，當(dāng)K=1時(shí)，Ln Pr(X|K)具有最大平均值，且重復(fù)計(jì)算的波動(dòng)性最小(圖6)，說(shuō)明小飛鼠種群內(nèi)不存在顯著的遺傳分化。

圖6 基于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)STRUCTURE聚類(lèi)結(jié)果的Ln Pr(X|K)變化趨勢(shì)Fig.6 Changing trends of Ln Pr(X|K)from STRUCTURE clustering results for the microsatellite

2.4 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

基于69個(gè)mtDNACyt b單倍型構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，小飛鼠存在3個(gè)明顯的遺傳譜系，包括遠(yuǎn)東、歐亞大陸北部和日本北海道3個(gè)分支，本研究張廣才嶺和大興安嶺的樣本單倍型歸屬為遠(yuǎn)東譜系。俄羅斯東部、韓國(guó)與中國(guó)樣本單倍型共同形成遠(yuǎn)東譜系，3個(gè)地區(qū)之間無(wú)共享單倍型，并且俄羅斯、韓國(guó)與中國(guó)單倍型分別存在兩個(gè)獨(dú)立亞分支。俄羅斯中西伯利亞(歐亞大陸東北部)與俄羅斯西部(歐亞大陸西北部)的兩個(gè)亞分支構(gòu)成了歐亞大陸北部譜系，其中蒙古單倍型歸屬于歐亞大陸東北部亞分支。日本北海道地區(qū)的單倍型獨(dú)立形成北海道譜系(表2，圖7)。

圖7 基于Cyt b構(gòu)建的小飛鼠貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of Siberian flying squirrel obtained for cytochrome b gene in Bayesian inference

3 討論

遺傳多樣性的喪失會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力下降，甚至物種的滅絕，評(píng)價(jià)種群的遺傳多樣性，是物種保護(hù)的重要內(nèi)容(Frankhamet al.,2010)。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是衡量種群mtDNA遺傳變異程度的重要指標(biāo)，其中Pi值考慮了單倍型在種群中所占的比例，在評(píng)價(jià)遺傳多樣性時(shí)更為精確(Neigel and Avise,1993；馬英等，2019)。本研究控制區(qū)的Pi值(1.695%)明顯高于Cyt b(0.616%)，Nummert等(2020)對(duì)愛(ài)沙尼亞、芬蘭和俄羅斯的小飛鼠種群研究中也呈現(xiàn)此規(guī)律。mtDNA非編碼控制區(qū)的進(jìn)化速度較快、承受的選擇壓力較小 (Krojerová-Proke?ováet al.,2013；佐日古麗·伊斯馬伊力等，2019)，在許多動(dòng)植物和人類(lèi)中也普遍存在基因非編碼區(qū)多態(tài)性高于編碼區(qū)的現(xiàn)象(Crochet and Desmarais,2000)。微衛(wèi)星數(shù)據(jù)顯示，種群平均觀測(cè)雜合度 (Ho)和期望雜合度 (He)分別為0.727和0.864。本研究中Pi值與Lee等(2008a)關(guān)于黑龍江省小飛鼠種群(Pi=0.614%)和韓國(guó)種群(Pi=0.616%)的研究基本一致，僅低于俄羅斯濱海邊疆區(qū)(Pi=0.950%)；遠(yuǎn)高于愛(ài)沙尼亞、芬蘭、俄羅斯大部分地區(qū)和日本北海道地區(qū)。與其他地區(qū)相比，本研究的遺傳多樣性處于最高水平(表5)，同時(shí)參考Grant和Bowen(1998)、Yuasa等 (2007)種群高單倍型多樣性(Hd≥0.5)和高核苷酸多樣性(Pi≥0.5%)的標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為張廣才嶺北部小飛鼠種群的遺傳多樣性豐富。但是研究發(fā)現(xiàn)，種群中Cyt b和控制區(qū)的稀有單倍型均在60%以上，微衛(wèi)星各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)顯著少于實(shí)際等位基因數(shù)(P＜0.01)，說(shuō)明小飛鼠的基因頻率分布處于一個(gè)不穩(wěn)定的狀態(tài)，未來(lái)種群發(fā)展中存在等位基因丟失的風(fēng)險(xiǎn)。因此，應(yīng)加強(qiáng)張廣才嶺北部小飛鼠種群的保護(hù)與管理，防止種群遺傳多樣性的急劇下降。

表5 基于mtDNA和微衛(wèi)星位點(diǎn)的鼯鼠科主要物種種群遺傳多樣性參數(shù)比較Table 5 Comparison of population genetic diversity at mtDNA and microsatellite loci in the Pteromyidae

景觀格局和物種的遷移能力是影響種群遺傳結(jié)構(gòu)的最重要因素(Yuasaet al.,2007;Pérez-Esponaet al.,2008)。本研究的賓縣地區(qū)有高速G1011、國(guó)道G221和哈佳鐵路東西方向穿過(guò)，被分成南、北兩塊隔離區(qū)域，采樣的區(qū)域主要集中在南部，該林區(qū)無(wú)明顯的景觀阻隔。同時(shí)小飛鼠作為滑行類(lèi)物種，具有一定的遷移能力(Selonen and Hanski,2004,2012)，保證了個(gè)體間的基因交流，因此種群內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)顯著的遺傳分化。本研究的張廣才嶺北部區(qū)域、尚志和方正林區(qū)受多條高速、高鐵和國(guó)道，以及延壽農(nóng)田區(qū)等因素的阻隔，其森林生境呈現(xiàn)破碎化分布，未來(lái)待加大取樣范圍，進(jìn)一步評(píng)價(jià)北部區(qū)域小飛鼠種群的遺傳結(jié)構(gòu)?；趍tDNA和微衛(wèi)星，本研究均未檢測(cè)到小飛鼠種群的近期遺傳瓶頸效應(yīng)。由于小飛鼠種群歷史資料的匱乏，缺少數(shù)量變化的準(zhǔn)確信息。鑒于之前的大量森林采伐，據(jù)主管部門(mén)報(bào)道的多次濫捕行為，本研究地區(qū)小飛鼠種群數(shù)量可能較歷史時(shí)期下降，而數(shù)量下降的程度還未能表現(xiàn)遺傳上的種群瓶頸效應(yīng)。受森林采伐導(dǎo)致的生境破碎化，愛(ài)沙尼亞和芬蘭地區(qū)的小飛鼠種群數(shù)量一直呈下降趨勢(shì)，分別成為當(dāng)?shù)氐臑l危與易危物種，也未檢測(cè)到遺傳瓶頸效應(yīng)(Nummertet al.,2020)。

在Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，本研究共有6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)以及種群整體上偏離平衡。Hardy-Weinberg平衡是建立在自然種群隨機(jī)交配假設(shè)基礎(chǔ)上的，認(rèn)為在瀕危物種種群中出現(xiàn)不符合平衡的現(xiàn)象，主要原因有無(wú)效等位基因、種群亞結(jié)構(gòu)和近親繁殖導(dǎo)致的雜合度不足(Ladeet al.,1996；任鵬等，2017)。本研究未檢測(cè)到無(wú)效等位基因和種群亞結(jié)構(gòu)，因此排除這兩個(gè)因素導(dǎo)致其偏離Hardy-Weinberg平衡的可能。Fis是評(píng)價(jià)種群是否存在近親繁殖的一個(gè)重要參數(shù)，當(dāng)Fis為正值時(shí)表示群體內(nèi)存在近交(Weir and Cockerham,1984；任鵬等，2017)。本研究6個(gè)位點(diǎn)Fis均為正值，種群的Fis為0.159，也為顯著偏離零的正值，因此認(rèn)為種群內(nèi)的近親繁殖是導(dǎo)致微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡的主要原因。小飛鼠種群數(shù)量的下降，與尚志和方正等林區(qū)的隔離，可能是影響種群內(nèi)個(gè)體近親繁殖的重要因素。同樣在愛(ài)沙尼亞，因小飛鼠種群的生境破碎化和數(shù)量急劇下降也表現(xiàn)出了近親繁殖(Nummertet al.,2020)。本研究較高的種群遺傳多樣性表明，小飛鼠在其近期歷史中可能具有較大的有效種群規(guī)模(Balakrishnanet al.,2003)，而種群內(nèi)高比例的稀有單倍型和等位基因?yàn)閭€(gè)體近親繁殖的表現(xiàn)。近親繁殖可導(dǎo)致物種遺傳多樣性的降低與喪失，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性下降，最終可能面臨瀕?；驕缃^的威脅(Lampilaet al.,2009;Nummertet al.,2020)。基于上述分析認(rèn)為，亟待加強(qiáng)張廣才嶺北部小飛鼠種群的保護(hù)，連通破碎化生境增加種群間的基因交流，防止遺傳多樣性的下降與喪失。

本研究證實(shí)小飛鼠存在3個(gè)明顯的進(jìn)化分支，遠(yuǎn)東、歐亞大陸北部和日本北海道，結(jié)果與其他研究基本一致(Oshidaet al.,2005;Leeet al.,2008a;Nummertet al.,2020)。其中，Lee等(2008a)和Nummert等(2020)研究中僅包括中國(guó)黑龍江省5個(gè)樣本得到的5個(gè)單倍型，其中3個(gè)單倍型(CHJ3、CHJ4和CHJ5)分別與本研究賓縣單倍型(CHB12、CHB13和CHB4)為共享單倍型。在遠(yuǎn)東譜系中，韓國(guó)與俄羅斯東部單倍型分處兩個(gè)亞分支內(nèi)，兩個(gè)地區(qū)之間存在明顯的遺傳分化(Leeet al.,2008a)，而中國(guó)樣本單倍型在兩個(gè)亞分支中都有分布，說(shuō)明本研究地區(qū)的小飛鼠與這兩個(gè)區(qū)域之間存在一定的基因交流。與相似分布的花鼠(Tamias sibiricus)和北松鼠不同，在mtDNA研究中，韓國(guó)、俄羅斯東部和中國(guó)東北3個(gè)地區(qū)的花鼠存在明顯的遺傳分化(Leeet al.,2008b)，而北松鼠卻不存在(Leeet al.,2008a)，說(shuō)明3個(gè)物種存在不同的進(jìn)化歷史。俄羅斯中西伯利亞(歐亞大陸東北部)與俄羅斯西部(歐亞大陸西北部)的兩個(gè)亞分支共同形成了歐亞大陸北部譜系，兩個(gè)區(qū)域沒(méi)有顯示出更明顯的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)，說(shuō)明烏拉爾山脈(Ural Mountains)似乎不是小飛鼠明顯的遺傳屏障。北海道種群形成最為明顯的一個(gè)獨(dú)立分支，研究認(rèn)為北海道種群的系統(tǒng)地理分化可能是荷斯廷(Holsteinian)間冰期的結(jié)果，在歐亞種群內(nèi)部分化之前，該種群已經(jīng)與歐亞種群分離(Oshidaet al.,2005)。本研究中大興安嶺地區(qū)僅有1個(gè)根河樣本，并且單倍型與其中賓縣單倍型共享，未來(lái)應(yīng)增加取樣量和研究區(qū)域，進(jìn)一步探討我國(guó)東北地區(qū)及全國(guó)范圍內(nèi)種群的遺傳結(jié)構(gòu)和亞種分類(lèi)問(wèn)題，為小飛鼠的科學(xué)保護(hù)與管理提供參考。