薛乃祥，王艷麗，董晶晶，柏玉香,3*

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)3(江南大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫，214122)

淀粉及其衍生物中被應(yīng)用于包合領(lǐng)域的主要為環(huán)糊精、分支糖原和直鏈淀粉/糊精[1-5]。環(huán)糊精產(chǎn)品主要有α、β和γ-環(huán)糊精，能夠?qū)Χ喾N化合物進(jìn)行助溶性包合[1]。工業(yè)制造和應(yīng)用最多的為β-環(huán)糊精，其助溶效果受限于其較低的溶解度[2]。此外，環(huán)糊精的助溶功能主要體現(xiàn)在助溶后的藥物保護(hù)和緩釋方面，該特性使得其不適用于包合溶解度低又需要被快速降解的環(huán)境污染性物質(zhì)。同樣，分支糖原雖然得益于其較高的分支度從而具有較好的水溶性，但是功能性體現(xiàn)在緩釋和遞送方面[3-4]，并且它的生產(chǎn)需要多酶復(fù)配[6]，操作較為復(fù)雜。直鏈淀粉/糊精則是通過(guò)形成復(fù)合物的形式實(shí)現(xiàn)不飽和脂肪酸等的胃腸道遞送和緩釋功能[5]。以上3種常見(jiàn)淀粉衍生物不適用于難溶化合物助溶降解，需要一種既能助溶，又不阻礙難溶化合物生物降解的功能性多糖。

中聚合度(10～100)[7]的異麥芽/麥芽多糖(megalo isomalto/malto-polysaccharides，M-IMMPs)是由來(lái)自Limosilactobacillusreuteri121的4，6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GtfB-ΔN合成的新型水溶性多糖[8]，對(duì)難溶性的環(huán)境污染物質(zhì)具有新穎的助溶效果[9]。M-IMMPs能夠在不阻礙環(huán)境污染物的生物降解前提下，提高其溶解度，促進(jìn)其生物降解。偶氮染料是一種被應(yīng)用于食品包裝、塑料餐具染色的合成有機(jī)染料[10]，是潛在的致癌物質(zhì)，其核心結(jié)構(gòu)為連接有芳香基團(tuán)或雜環(huán)的顯色偶氮基團(tuán)[11]。由于偶氮染料溶解度低，生物降解度低，使得其在自然界中積累，進(jìn)一步增加了其危害[12-13]。現(xiàn)階段研究主要采用環(huán)糊精對(duì)偶氮染料進(jìn)行包合而提高其溶解度[14]，但是該情況下發(fā)色基團(tuán)進(jìn)入環(huán)糊精空腔的空間位阻抑制了偶氮還原酶對(duì)偶氮染料的降解[9]。因此，使用M-IMMPs提高偶氮類染料溶解度具有良好的現(xiàn)實(shí)意義。但現(xiàn)有M-IMMPs的制備底物為麥芽六糖和麥芽七糖混合物，成本高昂且產(chǎn)物聚合度在11～12[15]，其助溶效果遠(yuǎn)低于環(huán)糊精[9]。

針對(duì)該問(wèn)題，本研究以偶氮染料中的典型代表乙基紅作為助溶實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用4，6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GtfB-ΔN轉(zhuǎn)化直鏈糊精合成了較高聚合度的M-IMMPs，并通過(guò)添加受體底物合成了一系列具有梯度分子質(zhì)量的M-IMMPs，測(cè)定比對(duì)了其對(duì)乙基紅的助溶特性，并對(duì)乙基紅- M-IMMPs復(fù)合物進(jìn)行了系列表征，以期為后續(xù)M-IMMPs實(shí)際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 主要材料和儀器

L.reuteri121，實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；直鏈糊精(Mw=2.1 kDa)，實(shí)驗(yàn)室自制；胰蛋白胨、酵母提取物、麥芽糖、氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、右旋糖酐-20，上海生工生物有限公司；乙基紅、二甲基亞砜-d6(dimethyl sulfoxide-d6， DMSO-d6)、D2O，上海阿拉丁生化科技有限公司。

DAWN HELEOS 8+高效凝膠滲透色譜儀，美國(guó)Waters公司；Advance Ⅲ 400 MHz全數(shù)字化核磁共振波譜儀，美國(guó)Brucker公司；NEXUS傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器公司；SU8100冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)；Spectra Max 190酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；Starter 5000pH計(jì)，美國(guó)Ohaus公司；ZQZY-80BS恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；MTH-100恒溫混勻儀，杭州米歐儀器有限公司；Centrifuge 5424R離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 GtfB-ΔN分離及純化

參考BAI等[16]酶的表達(dá)、純化方法，并稍作修改。L.reuteri121菌種接種至含有0.15 g/L氨芐的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)10 h，吸取一定量培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)為1%)至含有0.15 g/L氨芐的LB培養(yǎng)基中中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)基OD600在0.4～0.6時(shí)，冰浴15 min后加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，18 ℃搖床培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液于8 000 r/min、4 ℃下離心15 min 收取沉淀部分并破碎。破碎后在12 000 r/min、4 ℃下離心15 min，上清液經(jīng)Ni+親和色譜柱純化得到酶液。酶活力測(cè)定參照BAI等[16]建立的碘顯色法。

1.3 不同分子質(zhì)量M-IMMPs的酶法制備

直鏈糊精(25 g/L)加入醋酸鈉緩沖液(25 mmol/L，pH 5.0，含1 mmol/L CaCl2)后沸水浴30 min，后在高壓滅菌鍋(121 ℃，15 min)中完全糊化[17]。冷卻至37 ℃后加入一定量的麥芽糖(0～2 000 mg/g)和GtfB-ΔN(0.6 mg/g)，反應(yīng)48 h后沸水浴15 min，8 000 r/min、4 ℃下離心15 min收集上清液干燥。

1.4 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

樣品(5 g/L)溶解于超純水后沸水浴15 min，用0.45 μm針頭式濾膜過(guò)濾。測(cè)試條件：UltrahydrogelTM柱(7.8 mm×300 mm)，流動(dòng)相100 mmol/L的 NaNO3溶液，流速0.5 mL /min。葡萄糖、右旋糖酐T-5(2 700 Da)、右旋糖酐T-10(9 750 Da)、右旋糖酐T-150(135 350 Da)和右旋糖酐T-300(300 600 Da)為標(biāo)樣，高效凝膠滲透色譜儀(high performance gel permeation chromatograph, HPGPC)測(cè)定分子質(zhì)量，數(shù)據(jù)均使用Empower 3處理。

1.5 乙基紅溶解度測(cè)定

過(guò)量乙基紅和M-IMMPs(0、10、30、50、100、150 g/L)/β-環(huán)糊精(0、2、6、10、15 mmol/L)/右旋糖酐-20(0、10、30、50、100、150 g/L)加入到水中，28 ℃下振蕩12 h。4 ℃、12 000 r/min下離心15 min，取上清液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(320～600 nm)，以450 nm處讀數(shù)計(jì)算相對(duì)溶解度[18]。

1.6 核磁共振波譜

樣品(20 g/L)于D2O中沸水浴1 h，凍干，以上操作重復(fù)2次完成置換后再次溶解，60 ℃下保溫。4.98、5.37 ppm處的峰分別對(duì)應(yīng)α1→6、α1→4鍵。M-IMMPs(0、10、30、50、100、150 g/L)與乙基紅(1 g/L)溶于體積分?jǐn)?shù)為70%、100% DMSO-d6溶液中，60 ℃下保溫[9]。乙基紅- M-IMMPs復(fù)合物中乙基紅質(zhì)子的化學(xué)位移(δ復(fù))與乙基紅的質(zhì)子的化學(xué)位移(δ0)作差計(jì)算復(fù)合物形成前后乙基紅質(zhì)子的化學(xué)位移變化(Δδ)。

核磁共振波譜儀測(cè)定一維氫譜，譜寬為8 000 Hz，數(shù)據(jù)均使用MestReNova 12.0.3處理。

1.7 掃描電子顯微鏡

所有樣品噴涂金層，并采用3.0 kV分析。

1.8 傅里葉紅外光譜

所有樣品從600～4 000 cm-1進(jìn)行掃描，數(shù)據(jù)均使用OMNIC 9.2處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子質(zhì)量的M-IMMPs的合成

GtfB-ΔN已經(jīng)被證實(shí)偏好作用于直鏈底物[19]，其酶學(xué)機(jī)制如圖1所示。GtfB-ΔN作用于麥芽七糖時(shí)，產(chǎn)物中聚合度在10以上的部分含量很低[20]，當(dāng)其作用于直鏈淀粉時(shí)，產(chǎn)物分子質(zhì)量高達(dá)106Da，因此中分子質(zhì)量的直鏈糊精是制備M-IMMPs的合適底物。GtfB-ΔN的最小作用底物是麥芽三糖，當(dāng)麥芽七糖作為反應(yīng)底物時(shí)，其最多只能提供5個(gè)葡萄糖基被用于轉(zhuǎn)糖基作用。麥芽糖既不會(huì)被GtfB-ΔN水解，也不能作為轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的供體底物，只能作為受體底物[21-22]。因此，當(dāng)向直鏈糊精中添加麥芽糖后，整個(gè)反應(yīng)體系中可被用作供體的葡萄糖基數(shù)目不變，但是受體底物增多，這導(dǎo)致了M-IMMPs的α1→6鏈長(zhǎng)度降低。因此，本研究采用GtfB-ΔN作用于直鏈糊精，并添加不同量麥芽糖，此時(shí)供體底物含量不變，受體底物增多，導(dǎo)致產(chǎn)物分子質(zhì)量下降，以此合成不同分子質(zhì)量的M-IMMPs。

圖1 GtfB-ΔN的酶學(xué)機(jī)制Fig.1 The enzymatic mechanism of GtfB-ΔN

通過(guò)添加不同量的麥芽糖，合成了Mw在3.6～12.5 kDa的M-IMMPs，產(chǎn)物分子質(zhì)量較直鏈糊精底物明顯上升。由圖2和表1可知，隨著麥芽糖添加量的不斷上升，產(chǎn)物前峰Mw和α1→6鍵含量不斷降低。當(dāng)麥芽糖添加量在0～160 mg/g時(shí)，產(chǎn)物分子質(zhì)量對(duì)添加量較為敏感。當(dāng)添加量達(dá)到160 mg/g時(shí)，產(chǎn)物的Mw降低至5.8 kDa；當(dāng)添加量從160 mg/g上升到656 mg/g時(shí)，產(chǎn)物的Mw降低至3.6 kDa。當(dāng)麥芽糖添加量達(dá)到896 mg/g后，前后峰已經(jīng)無(wú)法分開(kāi)，總產(chǎn)物中Mw為1.1 kDa，該產(chǎn)物已經(jīng)不能被定義為M-IMMPs。

a-HPGFC-RID圖譜;b-核磁共振圖譜圖2 不同麥芽糖添加量下GtfB-ΔN與直鏈糊精反應(yīng)產(chǎn)物的HPGFC-RID和核磁共振圖譜Fig.2 The HPGFC-RID and 1H NMR spectra of reaction products of GtfB-ΔN with linear dextrins under different maltose addition

表1 不同麥芽糖添加量下GtfB-ΔN與直鏈糊精反應(yīng)產(chǎn)物的Mw和α1→6鍵含量Table 1 Mw and α1→6 linkage content of reaction products of GtfB-ΔN with linear dextrins under different maltose addition

從中選擇分子質(zhì)量差異較大的2種M-IMMPs(12.5和5.8 kDa)用于后續(xù)助溶實(shí)驗(yàn)。

2.2 M-IMMPs助溶效果測(cè)定

乙基紅在450 nm波長(zhǎng)處存在最大吸收，以此處吸光度計(jì)算相對(duì)溶解度[18]。由圖3-e可得，β-環(huán)糊精、12.5 kDa M-IMMPs、5.8 kDa M-IMMPs溶液中乙基紅相對(duì)溶解度分別可高達(dá)3.18、4.50和1.30。在質(zhì)量濃度低于17 g/L時(shí)，高分子質(zhì)量M-IMMPs(12.5 kDa)的助溶效果與β-環(huán)糊精相近。β-環(huán)糊精溶解度較低(16 mmol/L)[23]，而高α1→6鍵含量使得M-IMMPs具有良好的水溶性，這使得M-IMMPs助溶上限更高。該助溶效果呈現(xiàn)出分子質(zhì)量依賴性，高分子質(zhì)量M-IMMPs(12.5 kDa)的效果顯著優(yōu)于低分子質(zhì)量M-IMMPs(5.8 kDa)，分子質(zhì)量是影響助溶效果的重要因素。值得注意的是，加入傳統(tǒng)的α1→6鍵含量高于90%的右旋糖酐-20(約20 kDa)[24]，乙基紅相對(duì)溶解度反而降低至0.10(圖3-e)。這表明，M-IMMPs的助溶效果并非簡(jiǎn)單來(lái)源于高α1→6鍵含量和分子質(zhì)量，其特異性結(jié)構(gòu)決定了助溶效果。

a-β-環(huán)糊精(2、6、10、15 mmol/L);b-M-IMMPs(12.5 kDa，10、30、50、100、150 g/L);c-M-IMMPs(5.8 kDa，10、30、50、100 g/L)d-右旋糖酐-20(20 kDa，10、30、50、100、150 g/L);e-相對(duì)溶解度圖3 乙基紅在不同溶液中吸收光譜和相對(duì)溶解度Fig.3 Absorption spectra and relative solubility of ethyl red in different solutions

當(dāng)復(fù)合物中乙基紅和M-IMMPs的濃度增加時(shí)，只有光譜強(qiáng)度變化，這表明復(fù)合物中的乙基紅并未發(fā)生基本形式的變化。雖然M-IMMPs沒(méi)有類似環(huán)糊精的空腔，但位于葡萄糖鏈兩側(cè)的羥基和甲基使得其可能具有兩親性[25]。α1→6鍵和α1→4鍵的共同存在有利于構(gòu)建兩親表面，從而能夠與通過(guò)疏水相互作用與各種非極性化合物形成復(fù)合物，但是右旋糖酐-20不能，這或許是由于其主要包含α1→6鍵和α1→3鍵所致。由此推測(cè)，M-IMMPs可以通過(guò)疏水相互作用提高乙基紅溶解度。此外，M-IMMPs可以通過(guò)提高溶解度的方式促進(jìn)腸道吸收槲皮素糖苷[26]，助溶效果的非特異性提供了其來(lái)自非特異性疏水相互作用的支撐與可能。

2.3 乙基紅- M-IMMPs復(fù)合物表征

2.3.1 核磁共振波譜

據(jù)上文推測(cè)，M-IMMPs的助溶作用是通過(guò)疏水相互作用實(shí)現(xiàn)的。為驗(yàn)證該推論，采用體積分?jǐn)?shù)分別為70%、100%的DMSO-d6作為核磁共振一維氫譜分析的溶劑。當(dāng)疏水相互作用起主要作用時(shí)，向溶液中添加有機(jī)溶劑會(huì)降低溶劑整體的極性，減小溶劑和宿主之間的疏水性差異，即疏水相互作用減弱[27]。且乙基紅的親油性決定了該濃度和溶解體系中乙基紅溶解度較高，核磁信號(hào)較強(qiáng)。由圖4-a和表2可得，70% DMSO-d6溶解體系中乙基紅質(zhì)子的化學(xué)位移變化高于100% DMSO-d6溶解體系中的。這表明，非特異性的疏水相互作用貢獻(xiàn)了M-IMMPs對(duì)乙基紅的助溶作用。

a-乙基紅和乙基紅-M-IMMPs復(fù)合物于70%、100% DMSO-d6;b-乙基紅-M-IMMPs復(fù)合物于70% DMSO-d6圖4 乙基紅結(jié)構(gòu)式和不同溶液中乙基紅、乙基紅-M-IMMPs復(fù)合物的核磁共振圖譜Fig.4 Structural form, 1H NMR spectra of ethyl red and ethyl red-M-IMMPs complexes in different solutions

表2 游離乙基紅和乙基紅- M-IMMPs復(fù)合物中乙基紅質(zhì)子的化學(xué)位移及變化Table 2 Chemical shifts and their change for the protons of ethyl red in the ethyl red and ethyl red-M-IMMPs complexes

由圖4-b和表3可得，乙基紅質(zhì)子的化學(xué)位移變化隨著M-IMMPs濃度的提高而提高，到達(dá)一定濃度后不再發(fā)生變化。這表明在特定體系下，M-IMMPs和乙基紅達(dá)到某一質(zhì)量比后，疏水相互作用飽和，即使繼續(xù)添加M-IMMPs，乙基紅也不會(huì)受到影響。

表3 乙基紅- M-IMMPs復(fù)合物中乙基紅質(zhì)子化學(xué)位移(70%DMSO-d6)變化Table 3 Chemical shifts change (70%DMSO-d6) for the protons of ethyl red in the ethyl red-M-IMMPs complexes

2.3.2 掃描電子顯微鏡

由圖5可得，乙基紅呈現(xiàn)出大小不一的菱狀結(jié)構(gòu)(圖5-a)，M-IMMPs呈現(xiàn)為不規(guī)則片塊狀結(jié)構(gòu)(圖5-b)。2種物質(zhì)的物理混合呈現(xiàn)出簡(jiǎn)單的疊加狀態(tài)(圖5-c)，即菱狀結(jié)構(gòu)和不規(guī)則片塊狀結(jié)構(gòu)同時(shí)存在，而乙基紅-M-IMMPs復(fù)合物呈現(xiàn)為無(wú)定形糊狀(圖5-e和圖5-f)，菱狀不規(guī)則片塊狀結(jié)構(gòu)完全消失，與物理混合態(tài)存在明顯差異，這證實(shí)了復(fù)合物的形成。此外，在高濃度M-IMMPs(圖5-d)助溶體系下，由于乙基紅在復(fù)合物中占比較低，復(fù)合物的顆粒形態(tài)、大小較原M-IMMPs未發(fā)生較大變化，但仍然呈現(xiàn)成糊趨勢(shì)，片塊狀M-IMMPs開(kāi)始發(fā)生連結(jié)。

a-乙基紅;b-M-IMMPs;c-物理混合; d-乙基紅-M-IMMPs(15%)復(fù)合物;e-乙基紅-M-IMMPs(10 g/L)復(fù)合物(×500);f-乙基紅-M-IMMPs(10 g/L)復(fù)合物(×2 000)圖5 乙基紅、M-IMMPs、物理混合和乙基紅-M-IMMPs復(fù)合物的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of ethyl red, M-IMMs, physical mixture, and ethyl red-M-IMMPs complexes

2.3.3 傅里葉紅外光譜分析

圖6 乙基紅、M-IMMPs、物理混合、乙基紅- M-IMMPs(10 g/L)復(fù)合物的傅里葉紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of ethyl red, M-IMMPs, physical mixture, and ethyl red-M-IMMPs (10 g/L) complex

3 結(jié)論

采用控制直鏈糊精和麥芽糖受體比例的方式合成了一系列具有梯度分子質(zhì)量的M-IMMPs，測(cè)定表征了其乙基紅的助溶效果和所形成的復(fù)合物。對(duì)于M-IMMPs，分子質(zhì)量越高，其助溶效果越好，且該助溶效果來(lái)自M-IMMPs的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，并非只來(lái)自于高α1→6鍵含量和分子質(zhì)量。M-IMMPs通過(guò)疏水相互作用實(shí)現(xiàn)助溶功能，同時(shí)，氫鍵可能也貢獻(xiàn)了助溶效果。隨著乙基紅-M-IMMPs復(fù)合物的形成，顆粒形態(tài)逐漸向無(wú)定形糊狀片層轉(zhuǎn)化。由于疏水相互作用的非特異性，M-IMMPs對(duì)其他偶氮染料具有助溶潛力，有助于難溶性食品包裝染料的生物降解。