尚鵬遠(yuǎn)，曹業(yè)東，李和平，郭心雨，王月影，鐘凱

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000）

0 引言

外泌體，是直徑在30～150 nm的膜性小囊泡，其內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸分子等物質(zhì)。外泌體通過(guò)將其內(nèi)容物傳遞給受體細(xì)胞從而影響受體細(xì)胞的生理功能[1]。外泌體的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)特征較特殊，例如具有脂雙層膜結(jié)構(gòu)，密度為1.10～1.21 g/mL，通常在負(fù)染條件下呈現(xiàn)典型的“杯盤(pán)狀”結(jié)構(gòu)[2]。研究表明，外泌體已經(jīng)在許多生物液中鑒定出，例如：血液，唾液和尿液[3-4]。在人類(lèi)母乳和牛乳中也已鑒定出外泌體，乳汁中的外泌體大多為哺乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞（MEC）所釋放的[5-8]。這些來(lái)自母乳的外泌體被母乳接受者系統(tǒng)地吸收，其在嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。它們有助于調(diào)節(jié)新生嬰兒的生長(zhǎng)、組織成熟、代謝和免疫程序[10-11]。因此，外泌體系統(tǒng)或許是為母嬰之間的信息交流而發(fā)展起來(lái)的，在哺乳動(dòng)物幼崽出生后對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

牛乳由于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，成為人類(lèi)重要的飲食來(lái)源，因此牛乳外泌體是我們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|較多的外源外泌體。由于原料乳不是無(wú)菌的，而且可能含有病原體，為了使人們能夠安全飲用牛乳，需要對(duì)牛乳進(jìn)行滅菌[12]。目前，商品乳常用的滅菌方式有巴氏滅菌法和超高溫瞬間滅菌法，巴氏滅菌法是在72～78℃，加熱至少15 s[12]；UHT是135℃以上加熱時(shí)間不少于1 s[13]。所有這些工業(yè)處理步驟都會(huì)對(duì)乳中生物活性成分產(chǎn)生影響，進(jìn)而可能會(huì)影響它們的功能[14]。

研究報(bào)道，牛乳外泌體對(duì)初生幼仔具有免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)腸道發(fā)育等功能，還可以作為一些疾病治療藥物的載體[15]，目前，尚不清楚熱處理等工業(yè)加工步驟對(duì)牛乳外泌體會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響。因此，選取市場(chǎng)常見(jiàn)的巴氏滅菌乳和UHT乳，超速差速離心法提取外泌體，采用透射電鏡（transmission electron microscopy,TEM），納米顆粒示蹤（nanosight analysis,NTA）法，以及western blotting法檢測(cè)外泌體形態(tài)、粒徑范圍及標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況，探索工業(yè)加工對(duì)牛乳中外泌體的基本特征及生物活性的影響。

1 材料和方法

1.1 乳樣采集

本試驗(yàn)所用商品乳均采購(gòu)于本地超市，分別購(gòu)買(mǎi)了3個(gè)品牌的巴氏滅菌乳（n=3）及超高溫滅菌乳（n=3），生產(chǎn)日期相近，儲(chǔ)存方式相同。生牛乳來(lái)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場(chǎng)（n=6）。

1.2 主要試劑

Phosphate Buffered Saline緩沖液,HyClong；濃鹽酸、氫氧化鈉、雙蒸水、SDS聚丙烯酰胺凝膠試劑（去離子水，30%Arc-Bis，1.5 mol/L Tris-HCL(pH：8.8)、10%AP，TEMED，1 mol/L Tris-HCL,10%SDS）、BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒（試劑A：BCA堿性溶液，試劑B：硫酸銅溶液，試劑C：標(biāo)準(zhǔn)BCA蛋白：1 mg/mL)，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；一抗：小鼠Anti-CD63抗體、小鼠Anti-TSG101抗體,abcam；二抗：HRF-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；吐溫-20、牛血清白蛋白，Solarbio；Omni-ETLTM超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，雅酶、ECL Femtolight Substrate、ECL Femtolight Oxidant等。

1.3 主要器材

HT-7700透射電鏡，日本Hitachi；Nanosight NS300，Malvern；超速離心機(jī)（型號(hào)Optima XE-100 Ultracentrifuge,轉(zhuǎn)子型號(hào)SW 40 Ti Rotor），BECKAMAN COULYER；pH儀，中國(guó)TIMEPOWER；高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；0.22μm針頭式過(guò)濾器，中國(guó)biosharp；1、50、20 mL注射器，中國(guó) 曙光健士；BBA124S天平，中國(guó)OLABO；-80℃冰箱，日本SANYO；4℃立式冷藏柜;-20℃低溫保存箱，中國(guó)Haier；微量移液器，德國(guó)Eppendorf；漩渦振蕩器，IKA；恒溫?fù)u床，德國(guó)Eppendorf；電泳槽，轉(zhuǎn)膜儀，GenScript；顯影儀，Amersham Imager 600；酶標(biāo)儀，Thermo等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 差速超速離心法提取牛乳外泌體

離心機(jī)預(yù)冷至4℃，3 000g，離心10 min，棄去沉淀；上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，2 000g，離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，重復(fù)一次；HCL和NaOH將樣品pH調(diào)至4.7左右，4℃冰箱靜置1 h；靜置之后，10 000g，離心30 min，棄去沉淀，收集上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，重復(fù)兩次；將得到的透明乳清用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾后，進(jìn)行超高速離心，120 000g，4℃，離心70 min，將得到的外泌體富集于一個(gè)離心管，重復(fù)一次；將得到的外泌體用約500μL PBS吹打混勻，－80℃冰箱中冷凍保存。

1.4.2 透射電鏡觀察(TEM)外泌體形態(tài)

差速超速離心法分離組分用60～110μL 2%多聚甲醛重懸（4℃可保存一周）；然后滴5μL的外泌體懸液至銅網(wǎng)上，室溫靜置20 min；用PBS漂洗，5 min，3次；1%戊二醛固定5 min；雙蒸水漂洗，2 min，10次；4%醋酸雙氧軸負(fù)染5 min；濾紙吸取殘液，室溫晾干；上機(jī)觀察。

“沒(méi)錯(cuò)，是丁達(dá)。他沒(méi)事，壺天曉和鏡心羽衣也沒(méi)事，都在他肚子里裝著呢！”宴西園乘著他的棕色翼龍，低空盤(pán)旋著，向丁達(dá)飛去。

1.4.3 納米顆粒示蹤法（NTA）檢測(cè)外泌體粒徑范圍

300μL的1×PBS進(jìn)行重懸外泌體，得到外泌體重懸液；然后打開(kāi)儀器電源、打開(kāi)NTA 2.1 Analytical Software電腦軟件；向外泌體重懸液加入10 mL的1×PBS溶液，得到二次稀釋液；進(jìn)行樣品測(cè)試前，用純水沖洗樣品池；然后把樣品打入樣品池中，上機(jī)觀察。

1.4.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)提取的外泌體濃度進(jìn)行測(cè)定；外泌體溶液中加入5×SDS震蕩混勻；99℃，10 min進(jìn)行變性；樣品進(jìn)行10%聚丙烯凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜；BSA封閉；加入一抗孵育，TSG101（1∶2 000），CD63（0.5μg/mL）；洗膜；二抗（1∶5 000）孵育；洗膜；顯影。

2 結(jié)果分析

2.1 不同滅菌方式商品乳中外泌體的形態(tài)學(xué)觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，生牛乳、UHT牛乳及巴氏滅菌乳中的外泌體均邊緣清晰，部分有凹陷，近似球形，都有典型“杯盤(pán)”形態(tài)，如圖1所示。不同的工業(yè)加工方式對(duì)透射電鏡觀察到的牛乳中外泌體的形態(tài)幾乎沒(méi)有影響。

圖1 牛乳外泌體透射電鏡觀察

2.2 不同滅菌方式對(duì)商品乳中外泌體粒徑范圍的影響

生牛乳的外泌體粒徑范圍在70～300 nm，如圖2所示，超出了正常外泌體地30～150 nm粒徑范圍，如圖2所示。商品乳的外泌體粒徑范圍都在30～150 nm之間，如圖3所示。不同牛乳外泌體的平均粒徑和濃度如表1所示。從表中可以看出，生牛乳外泌體的平均粒徑要極顯著的大于巴氏滅菌乳和超高溫滅菌乳外泌體的平均粒徑（P＜0.0001）；兩種滅菌方式的商品乳外泌體的平均粒徑之間沒(méi)有差異（P＞0.05），如圖4（a）。巴氏滅菌乳和超高溫滅菌乳的外泌體的濃度都要顯著大于生牛乳外泌體的濃度（P＜0.05），不同滅菌方式的商品乳的外泌體濃度之間沒(méi)有差異（P＞0.05），如圖4（b）。由于生牛乳中存在許多微生物，他們可以吸附外泌體，導(dǎo)致外泌體發(fā)生了團(tuán)聚現(xiàn)象，而經(jīng)過(guò)滅菌之后，外泌體團(tuán)散開(kāi)成為單個(gè)的外泌體，所以生牛乳外泌體與滅菌乳外泌體相比，平均粒徑偏大，濃度偏小。

圖4 外泌體平均粒徑和濃度分析

表1 不同品牌商品乳外泌體的平均粒徑和濃度

圖2 生牛乳外泌體的粒徑分布

圖3 不同品牌商品乳外泌體的粒徑分布

2.3 Western blot分析

圖5 WB條帶圖

3 結(jié)果與討論

牛乳是哺乳動(dòng)物幼仔最主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，牛乳中富含生物活性成分對(duì)新生幼仔的腸道發(fā)育和自身免疫的建立具有重要作用。外泌體是新近發(fā)現(xiàn)的牛乳中有一種具有生物活性的成分，有研究表明，外泌體在新生兒的胃腸道和免疫系統(tǒng)的發(fā)育中同樣發(fā)揮重要作用[16-18]。但是，在流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)成人過(guò)多的攝入巴氏滅菌牛乳可能會(huì)增加肥胖[19-20]、Ⅱ型糖尿病[21]、骨質(zhì)疏松癥[22-23]、常見(jiàn)癌癥（直腸癌[24]、乳腺癌[25]等）以及帕金森等疾病[26]的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),其原因很可能是牛乳中富含的外泌體所導(dǎo)致的，因此，有研究者提出，巴氏滅菌牛乳中的外泌體也許是不應(yīng)該到達(dá)人類(lèi)食物鏈的新的病原體[27]。

牛乳中的外泌體對(duì)于人類(lèi)，特別是成人健康的影響是利還是弊目前存在分歧[27]。人們?nèi)粘ｏ嬘玫呐Ｈ槎际墙?jīng)過(guò)工業(yè)加工的商品乳。商品乳中的外泌體是否受到了工業(yè)加工的影響，是否仍具有生物學(xué)活性目前仍無(wú)定論[28-29]。因此，本研究從生牛乳、巴氏滅菌乳、UHT乳中分離的外泌體，比較其基本生物學(xué)特征的的差異，推測(cè)其生物活性可能改變。

本實(shí)驗(yàn)采用稍加改進(jìn)的差速超速離心法分離牛乳中的外泌體，由于牛奶中含有大量的蛋白，我們利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀法，先將牛奶的pH調(diào)至4.7左右，使乳中含量最多的酪蛋白沉淀，然后對(duì)乳清進(jìn)行差速超速離心從而得到外泌體。

通過(guò)透射電鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)從生牛乳和兩種滅菌方式的商品乳中分離的外泌體形態(tài)上沒(méi)有差異，都呈現(xiàn)典型的“杯盤(pán)”狀外觀。但是之前有研究者報(bào)道，運(yùn)用冷凍電鏡對(duì)不同滅菌方式的商品乳中的外泌體進(jìn)行觀察，生牛乳中分離的外泌體呈“杯盤(pán)”狀，脂質(zhì)雙層清晰；而巴氏滅菌牛乳中分離的外泌體呈不完全球形，膜完整性受到影響；在UHT乳中已經(jīng)觀察不到完整的外泌體[30]。這表明采用不同實(shí)驗(yàn)手段對(duì)外泌體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果將產(chǎn)生影響。

對(duì)不同滅菌方式商品乳外泌體的粒徑范圍和濃度的研究中，我們發(fā)現(xiàn)商品乳的外泌體粒徑都在30～150 nm之間，平均粒徑都在72 nm左右，結(jié)果提示我們不同加工方式對(duì)于牛乳外泌體粒徑范圍沒(méi)有影響。但是，本研究中生牛乳外泌體的粒徑范圍在70～300 nm，超出了正常外泌體30～150 nm的范圍，原因可能使因?yàn)樯Ｈ橹泻休^多微生物，微生物可以吸附外泌體，使外泌體出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。通過(guò)比較巴氏滅菌乳和UHT乳中外泌體的濃度，我們發(fā)現(xiàn)UHT乳外泌體的濃度都要比巴氏滅菌乳外泌體的濃度高，不同品牌的商品乳趨勢(shì)一致，這與粒徑范圍的變化相一致。

通過(guò)檢測(cè)商品乳和生牛乳外泌體進(jìn)行標(biāo)志性蛋白，我們發(fā)現(xiàn)商品乳中外泌體的蛋白信號(hào)與生牛乳外泌體蛋白信號(hào)相比，下降許多。外泌體相關(guān)蛋白的信號(hào)減弱可能是由于檢測(cè)抗體缺乏對(duì)表位的識(shí)別所致。事實(shí)上，一些牛奶蛋白是熱敏性的，加熱會(huì)導(dǎo)致這些蛋白的變性、聚集和糖基化，可能會(huì)阻礙抗體結(jié)合，從而限制了在蛋白質(zhì)印跡分析中的檢測(cè)[30-31]。但是結(jié)果顯示TSG101的信號(hào)強(qiáng)度要明顯比CD63的信號(hào)強(qiáng)，推測(cè)可能由于TSG101蛋白的熱穩(wěn)定要比CD63蛋白好。有研究表明，商品乳外泌體中的大部分的含量有所減少[30]。本實(shí)驗(yàn)因提出的商品乳外泌體中的miRNA濃度太低，未能對(duì)miRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，這也說(shuō)明了工業(yè)加工將對(duì)乳中外泌體產(chǎn)生影響。

本研究對(duì)不同滅菌方式的牛乳外泌體進(jìn)行形態(tài)，粒徑，數(shù)量和一些標(biāo)志蛋白的檢測(cè)，結(jié)果表明，工業(yè)加工對(duì)乳中外泌體的完整性產(chǎn)生影響，進(jìn)而將影響外泌體的生物活性。不同乳制品對(duì)人類(lèi)健康的影響是復(fù)雜多樣的，需要更進(jìn)一步的深入研究。