劉青陽，黃曉寧，陸 瑋，劉 暢，張松祥，陳小雪，湯有宏，韓北忠*

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州 236820；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院中國輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

芽孢桿菌（Bacillus）是大曲中廣泛存在且豐度較高的微生物類群[5-6]，具有強(qiáng)大的水解酶系統(tǒng)，許多芽孢桿菌都具有較強(qiáng)的水解淀粉和蛋白質(zhì)的能力[7-8]。芽孢桿菌作為胞外蛋白酶的高產(chǎn)菌株，可以將原料中的蛋白質(zhì)類物質(zhì)分解成小分子的氨基酸從而被其他微生物所利用，或產(chǎn)生多肽類物質(zhì)[9-10]。同時(shí)，芽孢桿菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生如4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等對人體有益的功能性物質(zhì)[11-12]。愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)不但是白酒中的特征香氣物質(zhì)，同時(shí)具有細(xì)胞內(nèi)抗氧化的功能[13-14]。ZHANG W等[15]利用分離得到的高產(chǎn)四甲基吡嗪的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）強(qiáng)化麩曲生產(chǎn)；WANG P等[16]研究發(fā)現(xiàn)，接種地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）后，大曲中微生物的相對豐度發(fā)生了變化，芽孢桿菌、曲霉、畢赤酵母屬、糖桿菌屬和其他微生物的相對豐度增加；YAN Z等[17]研究發(fā)現(xiàn)，某些地衣芽孢桿菌菌株具有抗菌活性。同時(shí)在食品發(fā)酵過程中，不同微生物間的相互作用造就了終產(chǎn)品的風(fēng)味與品質(zhì)[4]。因此，分離和利用性能優(yōu)良的芽孢桿菌對白酒的釀造具有重要意義。

本研究首先采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從中高溫大曲中分離、鑒定芽孢桿菌，對其多樣性進(jìn)行分析；然后根據(jù)環(huán)境耐受性篩選優(yōu)良菌株；最后再通過液態(tài)接種發(fā)酵驗(yàn)證功能微生物在發(fā)酵體系中的作用，利用代謝組學(xué)方法研究功能菌株的代謝特性，以期了解功能菌對大曲品質(zhì)的影響，并為優(yōu)化大曲的質(zhì)量和穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中高溫大曲（粉末）：安徽古井貢酒股份有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶（5 U/μL）：日本TaKaRa公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB固（液）體培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：5 g麩皮，100 mL蒸餾水，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AG 223B1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國EPPENDORF公司；UV-2802紫外分光光度計(jì)：美國UNICO公司；Mutiskan酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；7890B-5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：安捷倫科技有限公司；AVANCE II 500MHz核磁共振儀：德國Bruker公司。

首先，假設(shè)港口群內(nèi)的各港口的干、支泊位的單位處理能力相同，以上海港碼頭泊位的單位處理能力為例，上海港各主要集裝箱碼頭的單位泊位處理能力數(shù)據(jù)見表2。假設(shè)港口群內(nèi)各港口的支線泊位的處理能力為3 TEU/(m·d)，干線泊位的處理能力為5 TEU/(m·d)，仿真過程中假設(shè)腹地貨物產(chǎn)生周期和觀察周期均為5 d。在其他因素不變，港口群內(nèi)各港口間干支泊位中轉(zhuǎn)時(shí)間差閾值λ,ω變化時(shí)的干支航線網(wǎng)絡(luò)仿真結(jié)果見圖1a)和圖1b)。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離及鑒定

分離：取5 g大曲樣品于95 mL無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，振蕩30 min后，按10倍梯度稀釋至10-6，選取稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液分別涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑選單菌落劃線于LB固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行多次分離純化。

鑒定：采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因（北京）有限公司進(jìn)行純化并測序，并將雙向測序結(jié)果應(yīng)用Vector NTI軟件處理，處理后將序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，最后得到鑒定結(jié)果。

1.3.2 環(huán)境耐受性測定

將分離得到的芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm值為1.0±0.2時(shí)作為種子液；以2%（V/V）的接種量將種子液接種至pH值分別為3.0和4.0、乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%和15%的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、160r/min條件下培養(yǎng)，每隔24h取樣測定培養(yǎng)液的OD600nm值。

1.3.3 液態(tài)接種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

以2%（V/V）的接種量將單株芽孢桿菌或兩株芽孢桿菌混合培養(yǎng)液（1∶1）（OD600nm值為1.0±0.2）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)6 d。

1.3.4 代謝物測定

參照文獻(xiàn)[19]，以4-甲基-2-戊醇（125 mg/L）為內(nèi)標(biāo)，采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合GC-MS對發(fā)酵液中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定。參照文獻(xiàn)[20]，采用核磁共振氫譜法（1hydrogen-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）測定發(fā)酵液中非揮發(fā)性代謝物含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

通過SPSSStatistics20.0軟件中單因素方差分析，比較不同數(shù)據(jù)之間差異的顯著性。通過Origin 8.0軟件對不同發(fā)酵液中代謝物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA），探究不同菌株發(fā)酵液代謝輪廓的相似和不同之處。

2 結(jié)果與分析

2.1 中高溫大曲中芽孢桿菌的多樣性

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法及16S rRNA基因序列分析從中高溫大曲中共分離鑒定到46株芽孢桿菌，結(jié)果見表1。

表1 中高溫大曲中芽孢桿菌的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of Bacillus strains in medium-high temperature Daqu

由表1可知，46株芽孢桿菌歸屬于10個(gè)種，分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、暹羅芽孢桿菌（Bacillussiamensis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、蠟狀芽孢桿菌（Bacil lus cereus）、假蕈狀芽孢桿菌（Bacillus pseudomycoides）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus），其中以貝萊斯芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌占比最高，分別占芽孢桿菌總數(shù)的21.74%和19.57%，其次是蠟狀芽孢桿菌（15.22%），大曲中最為常見的地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌分別占芽孢桿菌總數(shù)的6.52%、8.70%和13.04%。芽孢桿菌是中高溫大曲中的主要菌群[21]，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法可知，芽孢桿菌種類繁多，不同芽孢桿菌可能協(xié)同參與了白酒發(fā)酵過程，參與合成了白酒特征的風(fēng)味代謝物。

2.2 芽孢桿菌對釀酒環(huán)境的耐受性

在白酒釀造過程中，酸度（pH）和乙醇含量最高分別能達(dá)到3和12%[22]。測定46芽孢桿菌對釀酒環(huán)境的耐受性，以確保微生物可以在釀酒環(huán)境中仍然發(fā)揮優(yōu)良特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中10株菌株對釀酒環(huán)境具有較高的耐受性。將測定結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后繪制熱圖[23]，結(jié)果見圖1。由圖1可知，10株芽孢桿菌在pH 4.0酸性條件下，均表現(xiàn)出良好的耐受性，在體積分?jǐn)?shù)10%和15%的乙醇環(huán)境條件下耐受性均較弱，體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇已抑制多數(shù)芽孢桿菌的生長。其中，菌株BA-5、BS-7和BV-10對酸性和乙醇都表現(xiàn)出相對較強(qiáng)的耐受能力。

圖1 芽孢桿菌對釀酒環(huán)境的耐受性測定結(jié)果Fig.1 Determination results of tolerance of Bacillus strains to brewing environment

2.3 芽孢桿菌揮發(fā)性代謝輪廓特征

為了測定芽孢桿菌在釀酒環(huán)境中的代謝特征，對菌株BA-5、BS-7和BV-10的單菌株和不同芽孢桿菌混合菌株發(fā)酵液的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，共得到23種揮發(fā)性代謝物?；趽]發(fā)性代謝物對不同菌株發(fā)酵液進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于揮發(fā)性代謝物不同菌株發(fā)酵液的主成分分析結(jié)果Fig.2 Results of principal component analysis of fermentation broth of different strains based on volatile metabolites

由圖2可知，單菌株發(fā)酵液的揮發(fā)性代謝物PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為33.2%和31.9%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為65.1%，說明兩個(gè)主成分能夠解釋各樣品之間的絕大部分差異。主成分分析結(jié)果表明，單菌株發(fā)酵后揮發(fā)性代謝物得到了明顯的區(qū)分。菌株BA-5發(fā)酵液與1,2,4-三甲基苯、2,3-二甲基苯基己酯、2-乙基苯甲醛、1,3-二溴-5-硝基苯等表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)；菌株BS-7發(fā)酵液與四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)；菌株BV-10發(fā)酵液與苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二甲基吡嗪、均三甲苯和十六酸乙酯表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)，說明不同芽孢桿菌對對揮發(fā)性代謝物貢獻(xiàn)有所不同。

由圖2亦可知，混合菌株發(fā)酵液的揮發(fā)性代謝物PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為54.1%和28.3%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為81.4%，說明兩個(gè)主成分能夠解釋各樣品之間的絕大部分差異，主成分分析結(jié)果表明，混合菌株發(fā)酵后的揮發(fā)性代謝物得到了明顯的區(qū)分，說明混菌發(fā)酵對發(fā)酵液中的揮發(fā)性代謝物特征有一定影響。菌株BS-7和BA-5的混合發(fā)酵液與4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、3-羥基扁桃酸乙酯和十六酸乙酯表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)；菌株BV-10和BS-7的混合發(fā)酵液與苯甲醛、萘和吡嗪表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)。根據(jù)PCA圖中樣品分布，混合菌株BV-10和BA-5的代謝特征和混合菌株BS-7和BA-5較為相似。

綜上所述，菌株BS-7單獨(dú)發(fā)酵時(shí)能夠產(chǎn)生較多的愈創(chuàng)木酚、四甲基吡嗪、2,4-二叔丁基苯酚和2,4-二甲基苯甲醛，與ZHANG R等[24]的研究結(jié)果一致，說明芽孢桿菌在白酒固態(tài)發(fā)酵風(fēng)味產(chǎn)生方面有重要貢獻(xiàn)。由于愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)是白酒中重要的特征香氣及健康因子[11-14]，本研究進(jìn)一步對3種愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)（愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚）的含量進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 單菌株（A）及混合菌株（B）發(fā)酵液中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的測定結(jié)果Fig.3 Determination results of guaiacol contents in fermentation broth of single strain (A) and mixed strain (B)

由圖3可知，愈創(chuàng)木酚普遍存在于芽孢桿菌發(fā)酵液中，愈創(chuàng)木酚在菌株BS-7發(fā)酵液中含量最高，為8.56 mg/L，在菌株BS-7分別與菌株BV-10、BA-5的混合發(fā)酵液中含量有所下降。單菌發(fā)酵時(shí)，只在菌株BS-7發(fā)酵液中檢測到4-乙基愈創(chuàng)木酚（1.07 mg/L），混菌發(fā)酵時(shí)，在不同組間均檢測到4-乙基愈創(chuàng)木酚。在單菌和混菌發(fā)酵液中均檢出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，單菌發(fā)酵時(shí)，在菌株BS-7發(fā)酵液中含量最高（25.57 mg/L）；混菌發(fā)酵時(shí)，在菌株BV-10與BA-5的混合發(fā)酵液中含量最高（104.47 mg/L），而在菌株BV-10與BS-7的混菌發(fā)酵液中含量較低（41.67 mg/L），說明了菌株BV-10和BA-5之間存在協(xié)同作用。在復(fù)雜微生物群落中，微生物間相互作用類型和強(qiáng)度同時(shí)影響著功能微生物的作用[25]。結(jié)果表明，芽孢桿菌在酒精發(fā)酵過程中促進(jìn)了愈創(chuàng)木酚類功能物質(zhì)的產(chǎn)生，不同芽孢桿菌間的相互作用可能影響愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量。

2.4 芽孢桿菌非揮發(fā)性代謝輪廓特征

從單菌株和不同芽孢桿菌混合菌株發(fā)酵液中共檢測到52種非揮發(fā)性代謝物，包括11種糖類物質(zhì)、14種醇類物質(zhì)、12種氨基酸類物質(zhì)、15種有機(jī)酸及衍生物和其他物質(zhì)，結(jié)果見圖4。

圖4 單菌株（A）和混合菌株（B）發(fā)酵液中非揮發(fā)性代謝物含量測定結(jié)果Fig.4 Determination results of non-volatile metabolites contents in fermentation broth of single strain (A) and mixed strain (B)

由圖4可知，糖類物質(zhì)方面，單菌發(fā)酵時(shí)，菌株BV-10發(fā)酵液中的糖類物質(zhì)含量最高（4.2 mmol/L）；混菌發(fā)酵時(shí)，菌株BS-7和BA-5的混合發(fā)酵液中糖類物質(zhì)含量最高（8.6 mmol/L）。醇類物質(zhì)方面，單菌發(fā)酵時(shí)，菌株BV-10發(fā)酵液中的醇類物質(zhì)能力最高（12.1 mmol/L）；混菌發(fā)酵時(shí)，菌株BS-7和BA-5的混合發(fā)酵液中醇類物質(zhì)含量最高（16.2 mmol/L）。有機(jī)酸及衍生物方面，單菌發(fā)酵時(shí)，菌株BV-10發(fā)酵液中的有機(jī)酸及衍生物含量最高（147 mmol/L）；混菌發(fā)酵時(shí)，菌株BS-7和BV-10的混合發(fā)酵液中有機(jī)酸及衍生物含量最高（116 mmol/L），且所有發(fā)酵液中的有機(jī)酸及衍生物含量均顯著高于對照組CK（P＜0.05）。氨基酸及衍生物方面，單菌發(fā)酵時(shí)，菌株BV-10發(fā)酵液中的氨基酸及衍生物含量最高（14.6 mmol/L）；混菌發(fā)酵時(shí)，菌株BS-7和BA-5混合發(fā)酵液中氨基酸及衍生物含量最高（17.6mmol/L）?？傮w上看，單菌株BV-10產(chǎn)非揮發(fā)性代謝物能力最強(qiáng)，尤其在生成醇類物質(zhì)及有機(jī)酸類物質(zhì)的能力方面，菌株BS-7和BV-10在分解蛋白質(zhì)方面的能力較強(qiáng)?；旌暇臧l(fā)酵時(shí)，整體氨基酸形成能力增強(qiáng)。雖然單菌株BS-7和BA-5單菌株發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生醇類物質(zhì)含量較低，但其混合培養(yǎng)后，醇類物質(zhì)含量顯著增強(qiáng)。

根據(jù)非揮發(fā)性代謝物構(gòu)成，對各組發(fā)酵液樣品進(jìn)行PCA，結(jié)果見圖5。

圖5 基于非揮發(fā)性代謝物不同菌株發(fā)酵液的主成分分析結(jié)果Fig.5 Results of principal component analysis of fermentation broth of different strains based on non-volatile metabolites

由圖5可知，單菌株發(fā)酵液中非揮發(fā)性物質(zhì)PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為41.5%和25.3%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為66.8%，說明兩個(gè)主成分能夠解釋各樣品之間的絕大部分差異。其中菌株BS-7和BV-10兩組聚在一起，整體處于PC1的負(fù)方向上，與蘇氨酸、谷氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸等氨基酸類物質(zhì)以及蔗糖、葡萄糖呈現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)，氨基酸作為標(biāo)志性代謝物的特征較明顯，這可能與其所具有的分泌蛋白酶能力有關(guān)[8]。菌株BA-5與半乳糖、阿拉伯糖等糖類物質(zhì)以及阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、葡萄糖醇和木糖醇等多元醇類物質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)，多元醇作為標(biāo)志性代謝物的特征明顯，說明菌株BA-5產(chǎn)生多元醇的能力較強(qiáng)，此結(jié)果與WOLDEMARIAMYOHANNES K[26]所得結(jié)果一致，解淀粉芽孢桿菌對醇類物質(zhì)的產(chǎn)生有重要貢獻(xiàn)。

由圖5亦可知，混合菌株發(fā)酵液中非揮發(fā)性物質(zhì)PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為45.8%和29.5%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為65.3%，說明說明兩個(gè)主成分能夠解釋各樣品之間的絕大部分差異。菌株BV-10和BS-7的混合發(fā)酵液與菌株BS-7的單菌株發(fā)酵液較為相似。菌株BS-7和BA-5的混菌發(fā)酵液與脯氨酸、亮氨酸、蘇糖醇和肌醇呈較強(qiáng)的正相關(guān)。菌株BV-10和BS-7的混菌發(fā)酵液與甘氨酸、胱氨酸、蘇氨酸等氨基酸類物質(zhì)，葡萄糖、蔗糖、核糖等糖類物質(zhì)和酒石酸、原兒茶酸、苯乙酸等有機(jī)酸及其衍生物表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)。菌株BV-10和BA-5的混菌發(fā)酵液與甘油、半乳糖醇、赤蘚糖醇、葡萄糖醇等多元醇類物質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)，說明接種不同芽孢桿菌對非揮發(fā)性代謝物的貢獻(xiàn)不同，多菌株協(xié)同作用對白酒發(fā)酵起到重要作用。

3 結(jié)論

通過對中高溫大曲中芽孢桿菌多樣性及釀酒環(huán)境耐受性進(jìn)行篩選，從49株芽孢桿菌中得到3株耐受性優(yōu)良的芽孢桿菌菌株，分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliq-uefaciens）BA-5、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BS-7和貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BV-10。對其單菌株和混合菌株共培養(yǎng)時(shí)的代謝特性進(jìn)行初探，發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)普遍存在于芽孢桿菌發(fā)酵液中，其中以菌株BS-7單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)含量最高，為8.56 mg/L。同時(shí)芽孢桿菌混合發(fā)酵會導(dǎo)致4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生成量增多，在菌株BV-10和BA-5混合培養(yǎng)后，達(dá)到104.47 mg/L。結(jié)果表明，芽孢桿菌單菌株及種間協(xié)同作用對白酒釀造中的特征物質(zhì)形成具有重要影響。