沈世明，張嬌嬌，張高瑜，劉金龍，薛新新，何猛超，顏家慶，郭松波，韓興林*

（1.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；3.國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京 100015；4.貴州釣魚臺國賓酒業(yè)有限公司，貴州 遵義 564500）

釀酒大曲是一種以小麥或小麥、大麥和豌豆混合為原料，粗粉成粒后加水混勻，經(jīng)機(jī)器壓制（或人工踩曲）制成磚狀曲（平板曲或包包曲），送入曲房后，在一定溫濕度條件下發(fā)酵形成的粗酶及微生物制劑，是白酒釀造中的重要一環(huán)[1-2]。根據(jù)培曲期間曲塊的頂溫差異，大曲可分為高溫大曲、中高溫大曲和中溫大曲[3]，又由于曲房中不同空間溫度和水分等因素的差異[4]，同一曲房的高溫大曲也會形成顏色和風(fēng)味各異的白曲、黃曲和黑曲。在大曲生產(chǎn)過程中，原輔料、溫度等因素都對大曲質(zhì)量產(chǎn)生影響[5]，其中貯存是大曲使用前的重要步驟，在貯存過程中大曲中的微生物、酶系和風(fēng)味物質(zhì)受外界條件影響不斷演替而趨于平衡，這些風(fēng)味物質(zhì)在進(jìn)入酒醅后，經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾后顯著影響白酒的香味風(fēng)格特征[6-7]。因此，解析大曲風(fēng)味物質(zhì)在貯存過程中的變化規(guī)律，有利于調(diào)控白酒香氣和提高品質(zhì)[8]。

目前，對貯存過程中醬香型大曲的理化、微生物變化的研究較多，對風(fēng)味物質(zhì)變化的研究較少。陶敏等[9]對不同貯存時(shí)間下中高溫大曲風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著貯存時(shí)間的延長，大曲的風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)和含量整體呈下降趨勢，其中乙酸戊酯等39種風(fēng)味物質(zhì)在貯存30 d后減少，這些變化可能與物質(zhì)揮發(fā)等原因有關(guān)。柳習(xí)月等[10]通過多組學(xué)解析醬香型大曲，發(fā)現(xiàn)吡嗪、醇和酸在黑曲、黃曲和白曲中均占主要成分，白曲中吡嗪濃度顯著高于黃曲和黑曲，黃曲中醇和酸含量顯著高于其余曲種，將乙酸、戊酸和3-辛醇視為黃曲的特征物質(zhì)，將四甲基吡嗪視為白曲的特征物質(zhì)，將2,3-丁二醇視為黑曲的特征物質(zhì)。李登勇等[11]對不同地域醬香型大曲的曲表和曲心進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)延長三個(gè)月陳曲時(shí)間，曲皮和曲表組分不斷形成和消失，其中曲心的酯、酸、酚組分略增加，含氮化合物減少，曲表的醇、醛類增加，酯類和含氮量化合物減少。目前研究者對白曲、黃曲和黑曲三種高溫大曲中的揮發(fā)性物質(zhì)有所研究，但針對貯存過程中三種大曲中曲香風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律的研究較少，且三種醬香型大曲的最佳貯存時(shí)間也尚未定論。

因此，本研究以端午人工踩制的醬香型大曲（黑曲、黃曲、白曲）為對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（headspace-solid phase micro extraction-gas chromatograph-mass spectrometer，HS-SPME-GC-MS）檢測不同貯存期白曲、黃曲和黑曲的風(fēng)味物質(zhì)，并通過多組學(xué)分析大曲間風(fēng)味物質(zhì)差異及在貯存過程中變化，為酒廠選擇大曲合適的貯存時(shí)間及在釀造中對大曲的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型大曲：白曲、黃曲和黑曲，均由貴州釣魚臺國賓酒業(yè)有限公司提供。

無水乙醇（色譜純）、超純水：Thermo Fisher Scientific公司；乙酸戊酯（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子分析天平：德國Sartorius公司；GenPure UV/UF超純水系統(tǒng)：美國Thermo Fisher Scientific公司；固相微萃取頭（2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美國Supelco公司；Clarus 680-Clarus 600T型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Perkin Elmer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取樣方式

以貯存期醬香型大曲（黑曲、黃曲、白曲）為取樣對象，選擇貯存0 d、60 d、120 d、180 d的大曲進(jìn)行取樣。白曲取自上層和表層，黑曲取自中間層，黃曲取自下層。

白曲取樣方式：每次從三個(gè)曲房隨機(jī)各取一個(gè)白曲，編為一組。黃曲和黑曲取樣方式同上，共得12組。每組大曲均勻粉碎，過40目篩，置于4 ℃冰箱保藏。樣品編號見表1。

表1 不同貯存時(shí)間及不同類別醬香型曲樣Table 1 Sauce-flavor Daqu samples with different storage time and types

1.3.2 大曲揮發(fā)性物質(zhì)測定

前處理?xiàng)l件：從1.3.1的每組大曲樣品中各取1.00 g放入20 mL頂空瓶，加入7.5 μL乙酸正戊酯內(nèi)標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度為0.836 5 mg/g），萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stableflex（2 cm），在70 ℃條件下振搖15 min，萃取45 min，然后直接進(jìn)樣。

GC條件：色譜柱為Elite WAX ETR（30 m×0.25 mm×0.5μm）；升溫程序：35 ℃保留2min，以3 ℃/min升溫至120℃，保留2 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，以10 ℃/min升溫至230 ℃，保留5 min，載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%）；載氣流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間1 min。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度230 ℃。

定性分析方法：未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索的同時(shí)與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）20標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比鑒定，保留正負(fù)匹配度＞800的組分。根據(jù)內(nèi)標(biāo)峰面積與風(fēng)味物質(zhì)峰面積的比值，計(jì)算風(fēng)味物質(zhì)的相對濃度。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2019、IBM SPSS Statistics 25.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，利用Origin pro 2021、Excel 2019和網(wǎng)站https：//www.omicstudio.cn/tool.進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測了不同貯存時(shí)間白曲、黃曲和黑曲共十二組樣品的揮發(fā)性物質(zhì)，通過計(jì)算機(jī)譜庫查詢，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)檢索[2，6，12]，確定3種大曲12個(gè)樣本中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及含量，部分結(jié)果見表2。

由表2可知，揮發(fā)性物質(zhì)共分為8類，其中醇類14種、酸類10種、醛類6種、酮類5種、吡嗪類8種、酯類19種、芳香類7種、醚類1種。其中黑曲中揮發(fā)性物質(zhì)種類最多為57種，白曲次之為53種，黃曲為49種，白曲中揮發(fā)性物質(zhì)總含量范圍在10.61～51.84 μg/g，黃曲揮發(fā)性物質(zhì)總含量范圍在14.59～54.04 μg/g，黑曲中揮發(fā)性物質(zhì)總含量范圍在8.71～39.47 μg/g，白曲在貯存0 d和120 d時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，為28種，在貯存60 d和180 d時(shí)最少為27種，黃曲在貯存期60 d時(shí)達(dá)到最多為30種，在貯存180 d時(shí)達(dá)到最少為21種，黑曲在貯存120 d時(shí)達(dá)到最多為31種，在貯存180 d時(shí)最少為25種，造成三種大曲風(fēng)味物質(zhì)間差異的原因可能與各自獨(dú)特的微生物菌落有關(guān)[12-13]。分析大曲間風(fēng)味物質(zhì)差異發(fā)現(xiàn)，在14種醇類物質(zhì)中，壬醇、十一烷醇和十六烷醇僅存在于白曲中，丁二醇和3-甲基-2丁醇僅存在于黑曲中；其中白曲中正戊醇、黃曲中異戊醇在貯存過程中含量減少，這可能是由于參與了酯化反應(yīng)導(dǎo)致的，同時(shí)說明醇類物質(zhì)不僅是大曲的重要呈香物質(zhì)，也是形成香味的前體物質(zhì)，賦予了白酒水果和花香類氣味[15]。在10種酸類物質(zhì)中，丙炔酸是白曲的獨(dú)有成分，草莓酸是黃曲的獨(dú)有成分，異丁酸是黑曲的獨(dú)有成分，壬酸和花生四烯酸則分別不存在于黃曲和黑曲中，其中三種大曲中亞油酸、壬酸在貯存過程中含量減少，這可能是脂肪酸類氧化、分解、參與酯化反應(yīng)等原因?qū)е碌?。?種醛類物質(zhì)中，香草醛僅存在于黑曲中，糖醛僅存在于貯存180 d的白曲、黃曲和黑曲中。在8種吡嗪類物質(zhì)中，6-乙基-2,3,5三甲基吡嗪僅存在于黃曲中，2-乙基-3,5,6三甲基吡嗪僅存在于黑曲中，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪在貯存過程中含量增加，在貯存180 d白曲中含量最高為24.80 μg/g，這些吡嗪類物質(zhì)可能是在貯存過程中通過美拉德反應(yīng)合成[14]，并賦予三種大曲烘烤香或焦香[17]。在19種酯類物質(zhì)中，2-甲基十一烷酸甲酯和辛酸乙酯僅存在于貯存180 d白曲中，5-甲基壬酸乙酯、二十酸乙酯和丁內(nèi)酯僅存在于黑曲中，丁內(nèi)酯等酯類物質(zhì)的合成可能與乙酰輔酶A途徑、酯化反應(yīng)有關(guān)[18]。芳香類物質(zhì)的產(chǎn)生與原料中芳香族氨基酸的降解及釀酒酵母等酵母屬菌種代謝有關(guān)[19-20]，其中苯乙腈和苯乙酸僅存在于白曲中。鄰苯二甲醚僅存在于黑曲中，其120 d時(shí)含量最高為0.08 μg/g。其中首次在貯存180 d的在白曲、黃曲和黑曲中檢測到環(huán)丁醇，并且首次在貯存60 d黑曲中檢測到1-乙酮。

表2 12個(gè)大曲樣本中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Table 2 Volatile flavor substances contents in 12 Daqu samples

2.2 白曲、黃曲和黑曲貯存過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化

2.2.1 大曲風(fēng)味物質(zhì)韋恩圖分析

不同貯存時(shí)間大曲風(fēng)味物質(zhì)韋恩圖結(jié)果見圖1。由圖1可知，分別在貯存0 d、60 d、120 d和180 d進(jìn)行取樣并對比分析，白曲在不同貯存階段獨(dú)有的揮發(fā)性物質(zhì)分別為6種、5種、4種、13種，共28種，黃曲在不同貯存階段獨(dú)有的揮發(fā)性物質(zhì)分別為4種、4種、6種、4種，共18種，黑曲在不同貯存階段獨(dú)有的揮發(fā)性物質(zhì)分別為8種、5種、7種、8種，共28種，其中不同貯存階段白曲、黃曲和黑曲中共有成分分別為10種、8種和8種。在貯存過程中白曲、黃曲和黑曲的揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)最多時(shí)僅占各自種類總數(shù)的50.9%、61.2%和54.4%，這說明在貯存過程中大曲內(nèi)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致了不同貯存時(shí)間大曲間揮發(fā)性物質(zhì)的差異，這可能與貯存期大曲中的微生物轉(zhuǎn)化等因素有關(guān)[13，21]。由不同貯存時(shí)間白曲、黃曲和黑曲中各自獨(dú)有的揮發(fā)性物質(zhì)種類可知，在貯存過程中白曲和黑曲中揮發(fā)性物質(zhì)在貯存過程中更易轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，新物質(zhì)形成較快，而黃曲的揮發(fā)性物質(zhì)最多時(shí)（60 d）占其種類總數(shù)62%，說明黃曲中揮發(fā)性物質(zhì)的形成更集中于0 d到貯存60 d，相對穩(wěn)定，這可能與白曲、黃曲和黑曲間微生物群落的構(gòu)成差異、環(huán)境差異等因素有關(guān)[7，22]。

圖1 不同貯存時(shí)間大曲風(fēng)味物質(zhì)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of flavor substances of Daqu with different storage time

2.2.2 大曲風(fēng)味物質(zhì)熱圖分析

根據(jù)從3種大曲12組樣本中檢出的70種揮發(fā)性物質(zhì)作熱圖分析，結(jié)果見圖2。由圖2-a可知，貯存0 d、60 d和120 d的白曲聚為一類，貯存180 d白曲單獨(dú)聚為一類。戊醇、十一烷醇、十六烷醇等高級醇在貯存0 d時(shí)的白曲中含量較多，2,3-丁二醇等雜油醇在貯存180 d的白曲中含量較高。異戊酸、壬酸、癸酸和亞油酸等酸類物質(zhì)在貯存0 d的白曲中含量較高，在貯存過程中呈現(xiàn)非單調(diào)減少，辛酸在貯存180 d白曲中含量較高。2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪類物質(zhì)在白曲貯存過程中逐漸增加，在180 d時(shí)含量最高。4-羥基丁酸乙酰酯、月硅酸乙酯和十五烷酸-2,6,10,14-四甲基甲酯在貯存過程中含量增加，在120 d時(shí)含量最高。苯乙酸、苯乙醇、3,5-二叔丁基苯酚和苯甲醛在貯存0 d的白曲中含量較高，在貯存過程中下降。整體上看，風(fēng)味物質(zhì)含量在0～180 d內(nèi)呈現(xiàn)先減后增趨勢，180 d時(shí)最高。

由圖2-b可知，四種不同貯存時(shí)間的黃曲可以很好地聚為兩類：貯存0 d和貯存60 d的黃曲聚為一類，貯存120 d和貯存180 d的黃曲聚為另一類。花生四烯酸等5種物質(zhì)在貯存0 d的黃曲中含量較高，草莓酸、苯甲醛和亞油酸等23種物質(zhì)在貯存60 d的黃曲中含量較高，壬酸乙酯等6種物質(zhì)在貯存120 d的黃曲中含量較高，環(huán)丁醇、糖醛和辛酸等5種物質(zhì)在貯存180 d黃曲中含量較高。整體上看，風(fēng)味物質(zhì)含量在60 d時(shí)最高，其中醇類、酸類、醛類、芳香類和酯類等26種物質(zhì)在貯存60 d后減少。

由圖2-c可知，貯存60 d、120 d和180 d的黑曲聚為一類，貯存0 d的黑曲單獨(dú)聚為一類。3-甲基-2-丁醇、仲戊醇、異丁酸等9種物質(zhì)在貯存0 d的黑曲中含量較高，正戊醇、1-乙酮和月桂酸乙酯等9種物質(zhì)在貯存60 d的黑曲中含量較高，2,3-丁二醇、亞油酸和硬脂酸乙酯等12種物質(zhì)在貯存120 d黑曲中含量較高，這些酯類物質(zhì)的生成可能與黑曲中脂質(zhì)分解有關(guān)[23]，環(huán)丁醇、糖醛和苯乙醇等14種物質(zhì)在貯存180 d的黑曲中含量較高，其中苯乙醇則是在貯存過程中被轉(zhuǎn)化又被合成的組分[24-25]?？傮w看來，黑曲的風(fēng)味物質(zhì)含量在貯存120 d時(shí)最高，其中醇類含量非單調(diào)遞減，其余風(fēng)味物質(zhì)含量呈先減后增趨勢。

圖2 白曲（a）、黃曲（b）及黑曲（c）貯藏過程中風(fēng)味物質(zhì)熱圖分析Fig.2 Heat map analysis of flavor substances of Baiqu (a),Huangqu (b) and Heiqu (c) during storage

2.2.3 不同貯存時(shí)間大曲風(fēng)味物質(zhì)整體差異分析

由圖3可知，三種大曲揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量在貯存期均具有差異，大曲中醇類等七類風(fēng)味物質(zhì)總含量及占比在貯存過程中呈非線性變化，不同貯存時(shí)間白曲、黃曲和黑曲中主要風(fēng)味物質(zhì)前三位分別為吡嗪類、酯類、醇類，占總含量的80%以上。在0～120 d期間白曲中醇類、酯類、吡嗪類、芳香類等風(fēng)味物質(zhì)含量占比下降，且白曲中醇類、酸類、醛類、吡嗪類、芳香類含量占比在120 d時(shí)達(dá)到最低值。在整個(gè)貯存過程中黃曲和黑曲中的醇類和酯類含量占比都非單調(diào)下降，芳香類和吡嗪類含量占比非單調(diào)增加，其中黃曲的醇類含量占比在120 d時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，黑曲的醇類含量占比在60 d時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)。貯存180 d白曲、貯存120 d黃曲和貯存180 d黑曲中吡嗪類含量較高，貯存60 d黃曲中酯類含量較高，貯存120 d黑曲中醇類含量較高，因此選擇不同貯存時(shí)間的白曲、黃曲和黑曲合理搭配，用以發(fā)酵過程，有利于調(diào)控白酒中風(fēng)味物質(zhì)的組成。

圖3 大曲風(fēng)味物質(zhì)相對百分比Fig.3 Relative percentage of flavor substances of Daqu

2.3 不同貯存時(shí)間大曲風(fēng)味物質(zhì)的重要影響因素分析

采用SPSS25.0軟件對12個(gè)不同貯存時(shí)間的白曲、黃曲和黑曲中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果見圖4。由圖4可知，第1～3主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為46.3%、23.6%和17.0%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.9%，能夠反映樣品的整體信息量，可用來進(jìn)行后續(xù)分析。主成分的載荷系數(shù)反映了樣品與樣品中各揮發(fā)性物質(zhì)對主成分的影響，第一主成分反映的指標(biāo)主要有油酸乙酯、亞油酸、苯乙酸乙酯、壬醛，主要指向成分為酯類、醛類、酸類和芳香類；第二主成分反映的主要指標(biāo)有2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、癸酸，主要指向吡嗪類和酸類物質(zhì)；第三主成分主要反映的指標(biāo)有硬脂酸乙酯、花生四希酸和3,5-二叔丁基苯酚，主要指向?yàn)轷ヮ?、酸類、芳香類。因此可以初步判斷不同貯存時(shí)間白曲、黃曲和黑曲中的主要風(fēng)味物質(zhì)主要指向酯類、酸類、芳香類、吡嗪類。

圖4 不同貯存時(shí)間白曲、黃曲和黑曲風(fēng)味物質(zhì)主成分分析結(jié)果Fig.4 Principle components analysis results of flavor substances in Baiqu,Huangqu and Heiqu with different storage time

由圖4可知，貯存180 d的白曲落在PC1、PC2的正半軸，PC3的負(fù)半軸，其中苯乙酸乙酯、壬醛、棕櫚酸乙酯等9種風(fēng)味物質(zhì)與其呈正相關(guān)；在PC1的正半軸，PC2、PC3的負(fù)半軸上貯存60 d和120 d的白曲、貯存0 d的黃曲、貯存0 d和60 d的黑曲五種大曲空間距離相對較近，其中十五烷酸2,6,10,14-四甲基-甲酯、2-吡咯甲醛與其呈正相關(guān)；在PC3的負(fù)半軸，PC1、PC2的正半軸上貯存120 d的黃曲和黑曲相距較近，貯存180 d的黃曲和黑曲相距較近，整體風(fēng)味相似度較高，這說明黃曲和黑曲在貯存后期風(fēng)味較接近，其中亞油酸、棕櫚酸乙酯等11種物質(zhì)與其呈正相關(guān)；貯存0 d的白曲落在PC1、PC3的正半軸，其中香葉基丙酮、癸酸等5種物質(zhì)與其呈正相關(guān)。貯存60 d黃曲落在PC1、PC2的正半軸，PC3負(fù)半軸，其中亞油酸、苯乙醛等12種物質(zhì)與其呈正相關(guān)。整體而言，三種大曲在貯存初期均與十五烷酸2,6,10,14-四甲基-甲酯、2-吡咯甲醛呈正相關(guān)，這兩種物質(zhì)可能與大曲的新曲香有關(guān)，在貯存后期白曲與壬醛、棕櫚酸乙酯相關(guān)性較強(qiáng)，黃曲和黑曲與棕櫚酸乙酯、異戊酸、N-甲基-2-吡咯甲醛相關(guān)性較強(qiáng)，這些物質(zhì)可能與三種大曲各自的陳曲香香氣特征有關(guān)。

3 結(jié)論

通過對不同貯存時(shí)間白曲、黃曲和黑曲風(fēng)味物質(zhì)變化的分析發(fā)現(xiàn)，三種大曲的曲香風(fēng)味物質(zhì)在貯存中發(fā)生變化，風(fēng)味物質(zhì)種類和含量均有增加，從而導(dǎo)致不同貯存時(shí)間大曲間香氣特征的差異，并得出以下結(jié)論：三種大曲內(nèi)曲香風(fēng)味物質(zhì)均以吡嗪類、酯類和醇類為主，占總含量的70%以上。三種大曲共有風(fēng)味物質(zhì)43種，其中白曲獨(dú)有壬醇、糖醛等10種風(fēng)味物質(zhì)，黃曲獨(dú)有2,3-二甲基-5-乙基吡嗪，黑曲獨(dú)有3-甲基-2-丁醇等8種風(fēng)味物質(zhì)。從曲香風(fēng)味物質(zhì)含量角度建議白曲、黃曲和黑曲最佳貯存時(shí)間分別為180 d、60 d及120 d。因此，根據(jù)不同貯存時(shí)間大曲風(fēng)味物質(zhì)的特性，在白酒釀造的不同階段中選擇合適的大曲，對于調(diào)控白酒中風(fēng)味物質(zhì)的組成和提高白酒品質(zhì)有重要作用。