張?jiān)蒲?，馬劉合一，陳敏怡，李有強(qiáng)，劉潤梅，羅冬元

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是臨床上常見的院內(nèi)感染條件致病菌。N-3-氧代十二烷酰-L-同型絲氨酸內(nèi)酯（N-3-oxododecanoyl-Lhomoserine lactone，3-O-C12-HSL）是PA 密度感應(yīng)系統(tǒng)分泌的重要的信號(hào)分子之一［1］，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的免疫功能，介導(dǎo)免疫逃逸［2-3］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）是細(xì)胞核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，由PPARγ C 末端的配體結(jié)合區(qū)域（ligand binding domain，LBD）與配體結(jié)合后形成二聚體而活化，將各種環(huán)境、炎癥等刺激轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)代謝、分化、免疫等［4］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)3-O-C12-HSL 可能通過結(jié)合PPARγ 抑制人單核細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞成熟和功能［5-6］，但3-O-C12-HSL結(jié)合PPARγ的具體特性尚不清楚。為此，本研究采用分子對(duì)接和表面等離子體共振技術(shù)探討3-O-C12-HSL 與PPARγ的結(jié)合及結(jié)合強(qiáng)度，為篩選兩者結(jié)合的抑制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 3-O-C12-HSL和對(duì)照分子2-氯-5-硝基-N-苯基 苯 甲 酰 胺（GW9662）購自Sigma 公 司；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix（-dye）購自TransGen Biotech；PET28b質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA Ligase和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TransGen Biotech；質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司；OpenSPRTM 儀器和芯片購自Nicoya。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、內(nèi)切酶、純化柱、His抗體購自普健生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 3-O-C12-HSL 與PPARγ 分子對(duì)接 將PPARγ、3-OC12-HSL 和GW9662 輸入Pubchem 數(shù)據(jù)庫（http://zinc.docking.org/），查詢獲得三者的成分結(jié)構(gòu)，優(yōu)化結(jié)構(gòu)并保存為mol 格式。從RCSB Protein Data Bank（PDB，https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)，保存為PDB 格式，使用PyMol軟件刪除蛋白結(jié)構(gòu)的水分子和小分子配體，并導(dǎo)入AutoDockTools進(jìn)行加氫等預(yù)處理。對(duì)接參數(shù)：ga_num_evals=1 200 000，ga_pop_size=120，ga_run=12，rmsd=2.0，分子對(duì)接采用軟件Autodock 4.2。結(jié)合能越低，表明結(jié)合力越強(qiáng)，結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol的分子與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性。

1.2.2 PPARγ-LBD 表達(dá)載體的構(gòu)建 通過uniprot（https://www.uniprot.org/uniprot/P37231#sequences）找 到PPARγ 的LBD 區(qū)（aa238-530），通過NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取目的基因序列，全基因合成獲得目的基因的cDNA，用Primer Premier 5.0 軟件添加酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)及合成引物，C 端添加6×His 標(biāo)簽，進(jìn)行目的基因的克隆，見圖1。將目的基因和載體酶切、回收、連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 細(xì)胞，涂板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取8 個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定，鑒定成功后挑選2 個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序。

Fig.1 PPARγ-LBD expression vector圖1 PPARγ-LBD表達(dá)載體

1.2.3 PPARγ-LBD肽段的表達(dá)形式分析 陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞、菌種活化及誘導(dǎo)表達(dá)后，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）驗(yàn)證表達(dá)情況。從平板上挑取含重組質(zhì)粒的單菌落，接種于含卡那霉素（50 mg/L）的5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。取200μL接種于含卡那霉素的20 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至培養(yǎng)液600 nm 吸光度值為0.6左右。菌液中加入IPTG，于37 ℃培養(yǎng)4 h進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)的優(yōu)化。超聲裂菌，離心后收集上清液，SDS-PAGE及抗His標(biāo)簽抗體通過Western blot檢測大腸桿菌感受態(tài)2號(hào)菌株和7號(hào)菌株中目的肽段。

1.2.4 PPARγ-LBD 肽段的表達(dá)與純化 在2 號(hào)菌株中加入1 mmol/L IPTG，37 ℃培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)200 mL菌液，離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌株，加入10 mL PBS，超聲處理。超聲時(shí)間2 s，間隔2 s，功率20 kHz，總計(jì)30 min。離心后收集上清液，Brandford 法檢測肽段濃度，SDS-PAGE 及抗His 標(biāo)簽通過Western blot檢測目的肽段。

1.2.5 表面等離子共振技術(shù)（SPR）檢測3-O-C12-HSL 與人PPARγ結(jié)合的動(dòng)力學(xué)特性 安裝NTA芯片，以150μL/min流速檢測緩沖液PBS信號(hào)。信號(hào)達(dá)到基線后，將咪唑和NiCl2溶液注入NTA 芯片，將1.00 g/L 的PPARγ-LBD 肽段200μL 注入NTA 芯片相互作用4 min。分別注入300 μmol/L 的3-OC12-HSL和GW9662，檢測兩者與PPARγ-LBD 肽段的最大結(jié)合力。將流速提高到150μL/min，注入再生緩沖液去除3-OC12-HSL和GW9662。分別將10、20、40、60、80、160μmol/L的GW9662 和25、50、100、200、300 μmol/L 的3-O-C12-HSL 以20μL/min上樣，肽段與配體結(jié)合時(shí)間240 s，自然解離420 s，用分析軟件TraceDrawer（Ridgeview Instruments ab，Sweden）和1∶1分析方法完成模型分析。

2 結(jié)果

2.1 3 -O-C12-HSL 與PPARγ 的對(duì)接構(gòu)象分析 3-O-C12-HSL 與PPARγ 結(jié)合能為-10.11 kJ/mol，低于對(duì)照分子GW9662 的-8.29 kJ/mol，3-O-C12-HSL 較GW9662 有更強(qiáng)的結(jié)合能力。對(duì)照分子GW9662 與Tyr327、Tyr473 以及Cys285 形成氫鍵，苯環(huán)側(cè)鏈與Leu330 形成疏水結(jié)合。3-O-C12-HSL 與PPARγ 的結(jié)合與GW9662 類似，也與Tyr473 和Tyr327 形成氫鍵，其末端柔性碳鏈與Met329、Leu330 等殘基形成疏水結(jié)合，見圖2。

Fig.2 Molecular docking analysis of 3-O-C12-HSL with PPARγ圖2 3-O-C12-HSL與PPARγ的分子對(duì)接

2.2 構(gòu)建PPARγ-LBD 表達(dá)載體 將PET28b-PPARγ-LBD 測序序列與NCBI 中PPARγ-LBD 序列進(jìn)行比對(duì)，顯示與PPARγ-LBD區(qū)aa238-530的基因序列（870 bp）完全一致，見圖3。成功構(gòu)建了PET28b-PPARγ-LBD表達(dá)載體。

2.3 PPARγ-LBD 肽段表達(dá)形式分析 SDS-PAGE分析2 號(hào)和7 號(hào)菌株中PPARγ-LBD 的表達(dá)形式，發(fā)現(xiàn)PPARγ-LBD 肽段在上清液和包涵體均有表達(dá)，以包涵體表達(dá)為主。Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2 號(hào)和7號(hào)菌株上清液和包涵體中25～35 ku均出現(xiàn)預(yù)期的蛋白印跡條帶，見圖4。

Fig.3 Results of positive clone sequencing圖3 陽性克隆測序序列的比對(duì)結(jié)果

Fig.4 Expression analysis of PPARγ-LBD peptide segment圖4 PPARγ-LBD肽段的表達(dá)形式分析

2.4 PPARγ-LBD 肽段的表達(dá)與純化 純化2 號(hào)菌株上清液中PPARγ-LBD 肽段，純化后肽段質(zhì)量濃度為1 g/L。SDS-PAGE及Western blot檢測抗His標(biāo)簽的抗體發(fā)現(xiàn)在25～35 ku 均有一條蛋白的印跡，見圖5，與PPARγ-LBD的分子質(zhì)量一致。

2.5 3 -O-C12-HSL 與PPARγ-LBD 的親和常數(shù) 3-O-C12-HSL與PPARγ-LBD結(jié)合的親和常數(shù)為1.65×10-4mol/L，結(jié)合速率常數(shù)為1.06×102/ms，解離速率常數(shù)為1.75×10-2/s。GW9662 與PPARγ-LBD 結(jié)合的親和常數(shù)為1.06×10-4mol/L，結(jié)合速率常數(shù)為1.19×102/ms，解離速率常數(shù)為1.27×10-2/s，見圖6。3-O-C12-HSL可與PPARγ-LBD結(jié)合，與分子對(duì)接結(jié)果一致。

Fig.5 Analysis of purified PPARγ-LBD protein by SDS-PAGE and Western blot assay圖5 純化PPARγ-LBD肽段SDS-PAGE及Western blot結(jié)果

Fig.6 Dynamic binding curves of PPARγ-LBD with 3-O-C12-HSL,GW9662圖6 PPARγ-LBD與3-O-C12-HSL、GW9662濃度梯度結(jié)合曲線

3 討論

3-O-C12-HSL 是PA 群體密度感應(yīng)系統(tǒng)分泌的一種重要的病原體相關(guān)分子模式。3-O-C12-HSL可調(diào)節(jié)宿主樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等功能［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)3-O-C12-HSL 可通過與PPARγ 結(jié)合來調(diào)節(jié)人單核細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞的成熟和功能［5-6］，提示PPARγ可作為治療PA感染的靶點(diǎn)，但3-O-C12-HSL與PPARγ結(jié)合的具體特性尚未明確。

PPARγ 是核受體中的一個(gè)重要的成員，在細(xì)胞免疫、脂質(zhì)代謝等方面具有重要功能。PPARγ-LBD是PPARγ的一個(gè)重要激活區(qū)域，該區(qū)域由12個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域組成，LBD 通過與配體結(jié)合來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活［8-9］。LBD 被組裝在一個(gè)三層反向平行的螺旋形“三明治”里，構(gòu)成疏水腔，稱為配體結(jié)合袋。PPARγ的配體結(jié)合袋較大，允許結(jié)合不同大小的配體。3-O-C12-HSL 分子式為C16H27NO4，相對(duì)分子質(zhì)量297.39。本研究用生物信息學(xué)預(yù)測3-O-C12-HSL 與PPARγ 的分子對(duì)接位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)3-O-C12-HSL 疏水的尾巴深入到PPARγ 的配體結(jié)合袋中，與Tyr473 和Tyr327 形成氫鍵，末端柔性碳鏈與Met329、Leu330等殘基形成疏水結(jié)合。氫鍵的形成增強(qiáng)了3-O-C12-HSL與PPARγ的結(jié)合能力，能更好地激活PPARγ。

SPR 是一項(xiàng)利用生物傳感芯片進(jìn)行分析的技術(shù)，該技術(shù)將分析樣品固定在SPR傳感器上，利用光學(xué)測量的折射率變化來檢測分子的結(jié)合情況。SPR可以實(shí)時(shí)并快速對(duì)蛋白、小分子等進(jìn)行定性和定量分析，可以連續(xù)監(jiān)測吸附和解離過程，進(jìn)行成分間相互作用的研究［10］。本實(shí)驗(yàn)使用SPR 實(shí)時(shí)監(jiān)測了3-O-C12-HSL與PPARγ-LBD的結(jié)合和解離的過程，測得兩者結(jié)合的親和力常數(shù)為1.65×10-4mol/L，結(jié)合速率常數(shù)為1.06×102/ms，解離速率常數(shù)為1.75×10-2/s，顯示兩者具有較好的親和力，與分子對(duì)接的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究成功制備獲得了PPARγ-LBD肽段，應(yīng)用SPR 證實(shí)3-O-C12-HSL 與PPARγ-LBD結(jié)合能力強(qiáng)，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，為臨床預(yù)防和治療PA 感染提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。下一步本課題組擬篩選3-O-C12-HSL 與PPARγ-LBD 結(jié)合抑制劑，阻斷兩者結(jié)合，以指導(dǎo)PA感染的預(yù)防和治療用藥。

志謝

感謝廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒研所劉明博士給予對(duì)接構(gòu)象分析實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)。