詹雯靜，梁銘杰，劉媛，黃遠(yuǎn)鳳，王瑋璇

肝癌是我國最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均位居前列［1］。作為機(jī)體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和糖代謝等多種生物過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中被過度激活［2］。因此，對(duì)STAT3 的活性進(jìn)行抑制是一種有效的潛在抗癌策略。Stattic和S3I-201是2種常用的STAT3抑制劑，通過干擾STAT3 的二聚化，使其不能進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制STAT3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性［3］。然而，在實(shí)際應(yīng)用中需要高濃度的藥物才能較好地抑制STAT3活性，但這會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷。目前尚無獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的直接靶向STAT3 的藥物［4］。煙酰胺（nicotinamide，Nam）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的前體。作為細(xì)胞生命活動(dòng)的重要分子，NAD 參與了包括糖酵解、三羧酸循環(huán)和β-氧化等在內(nèi)的重要生物過程［5］。補(bǔ)充NAD 前體Nam 具有包括防治癌癥在內(nèi)的多種有益作用［6］且可以下調(diào)肺癌細(xì)胞中STAT3 Y705 位的磷酸化水平［7］。但Nam 及其與STAT3 抑制劑聯(lián)合用藥對(duì)肝癌的影響及機(jī)制仍不明確。本研究以肝癌細(xì)胞HepG2為模型，從細(xì)胞凋亡、EMT及糖酵解角度探討STAT3 抑制劑、Nam 以及兩者聯(lián)合用藥對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制，以期為肝癌臨床治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。STAT3 抑制劑S3I-201 和Stattic 購自Selleck 公司；Nam購自Sigma-Aldrich 公司；青/鏈霉素購自維森特生物技術(shù)（南京）有限公司；胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自Thermo Fisher Scientific 公司；PVDF 膜購自Millipore 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠IgG以及p-STAT3兔單克隆抗體、β-actin鼠單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司；STAT3 鼠單克隆抗體購自ProteinTech 公司；ECL 發(fā)光液購自Bio-Rad 公司；RNAiso-Plus 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自Takara公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶抑制劑cocktail 和磷酸酶抑制劑購自Selleck 公司。Centrifuge 5810R 離心機(jī)購自Eppendorf 公司；NanoDrop 2000 核酸濃度測(cè)定儀購自Thermo Fisher Scientific 公司；Eon微孔板分光光度計(jì)購自BioTek 公司；LightCycler 480 熒光定量PCR 儀購自Roche 公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2 Western blot檢測(cè)STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá) HepG2用含有1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6 孔板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)文獻(xiàn)中使用的藥物濃度，設(shè)置對(duì)照組（Ctrl）、單用藥組（100μmol/L S3I-201［8］、1.5μmol/L Stattic［9］和5 mmol/L Nam［7］）與聯(lián)合用藥組（100 μmol/L S3I-201+5 mmol/L Nam 組和1.5 μmol/L Stattic+5 mmol/L Nam組）。藥物處理24 h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞后加入適量的RIPA裂解液（添加1%蛋白酶抑制劑cocktail和1%磷酸酶抑制劑），冰上靜置30 min裂解細(xì)胞。在4 ℃，12 000 r/min離心20 min 后收集上清液。用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定濃度后，用12%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。使用5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉，一抗STAT3（稀釋比例1∶1 000）、p-STAT3（稀釋比例1∶1 000）和β-actin（稀釋比例1∶3 000）4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗（稀釋比例1∶2 000）室溫孵育1.5 h后，將ECL化學(xué)發(fā)光顯影液均勻地滴在PVDF 膜上，在全自動(dòng)凝膠成像儀中進(jìn)行顯影，結(jié)果使用Image Lab軟件進(jìn)行分析。

1.3 RNA的提取和qPCR 將對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按照1.2所述設(shè)置對(duì)照組（Ctrl）、單用藥組與聯(lián)合用藥組，處理24 h后收集細(xì)胞提取RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RNA的提取以及qPCR過程根據(jù)Takara公司的說明書進(jìn)行。具體反應(yīng)體系如下：TB Green Premix Ex TaqⅡ（2×）5 μL，cDNA（1 g/L）2 μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.6μL，ddH2O 1.8μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)基因相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。引物由北京睿博興科生物技術(shù)公司合成，見表1。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按照1.2 所述設(shè)置對(duì)照組（Ctrl）、單用藥組與聯(lián)合用藥組，處理36 h 后，細(xì)胞長至80%～90%時(shí)，收集細(xì)胞，用0.4%的臺(tái)盼藍(lán)試劑染色，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與做圖，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3 抑制劑及Nam 對(duì)STAT3 Y705 磷酸化水平的影響 S3I-201、Stattic 及Nam 均可顯著降低HepG2細(xì)胞STAT3 Y705 的磷酸化水平，且聯(lián)合用藥（Nam+S3I-201 和Nam+Stattic）比單用藥對(duì)STAT3 Y705磷酸化抑制效果更強(qiáng)，見圖1。

2.2 STAT3 抑制劑及Nam 對(duì)STAT3 下游靶基因的影響 相比Ctrl組，S3I-201、Stattic及Nam單用藥與聯(lián)合用藥組STAT3 下游靶基因SNAIL1、VEGFA和ZEB1的mRNA 表達(dá)水平顯著降低；與S3I-201 單藥相 比，Nam 和S3I-201 聯(lián) 合 用 藥 組 中SNAIL1和VEGFAmRNA 表達(dá)水平顯著降低；與Stattic 單藥相比，Nam 和Stattic 聯(lián) 合 用 藥 組 中VEGFA和ZEB1mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖2。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

Fig.2 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of STAT3 downstream target genes圖2 STAT3抑制劑及Nam對(duì)STAT3下游靶基因mRNA表達(dá)水平的影響

2.3 STAT3 抑制劑及Nam 對(duì)細(xì)胞增殖的影響 相比于Ctrl 組，Nam 單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥可以顯著抑制細(xì)胞增殖，并且Nam 與Stattic 聯(lián)合用藥對(duì)于細(xì)胞增殖的抑制效果比Stattic單獨(dú)用藥更明顯，見圖3。

2.4 STAT3 抑制劑及Nam 對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響 相比Ctrl 組，單用藥組和聯(lián)合用藥組MCM7和MYCmRNA 表達(dá)水平顯著降低，且聯(lián)合用藥組中MCM7的表達(dá)水平均低于單用藥組；相比Ctrl組，除S3I-201 及Stattic 處理組，其余各組MKI67mRNA表達(dá)水平顯著降低。見圖4。

2.5 STAT3 抑制劑及Nam 對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 相比Ctrl 組，單用藥組和聯(lián)合用藥組中促凋亡基因BAXmRNA 表達(dá)量顯著升高，抗凋亡基因BCL-2和MCL-1mRNA 表達(dá)量顯著降低。且Nam 和Stattic 聯(lián)合用藥組中BAXmRNA 表達(dá)水平顯著高于單用藥組，Nam 和S3I-201 聯(lián)合用藥組中BCL-2mRNA表達(dá)水平顯著低于單用藥組，見圖5。

2.6 STAT3 抑制劑及Nam 對(duì)EMT 相關(guān)基因表達(dá)的影響 相比Ctrl 組，除Stattic 外的用藥組中TJP1mRNA 表達(dá)水平顯著升高，各用藥組SMAD3mRNA表達(dá)水平顯著降低。Nam 和Stattic 聯(lián)合用藥組中TJP1mRNA 表達(dá)水平顯著高于單獨(dú)用藥組，SMAD3mRNA表達(dá)水平顯著低于單獨(dú)用藥組，見圖6。

2.7 STAT3 抑制劑及Nam 對(duì)糖代謝相關(guān)基因的影響 相比Ctrl 組，單用藥組和聯(lián)合用藥組中糖酵解相關(guān)基因HK2、PFKL和PKMmRNA表達(dá)水平顯著降低；與S3I-201 單獨(dú)用藥組相比，Nam 和S3I-201 聯(lián)合用藥組中HK2、PFKL和PKMmRNA表達(dá)水平顯著降低；與單獨(dú)用藥組相比，Nam和Stattic 聯(lián)合用藥組中PKMmRNA 表達(dá)水平顯著降低。見圖7。相比Ctrl 組，單用藥組和聯(lián)合用藥組中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1mRNA表達(dá)水平顯著降低，除S3I-201外的用藥組中乳酸脫氫酶LDHAmRNA 表達(dá)水平顯著降低。且Nam 和S3I-201 聯(lián)合用藥組中LDHAmRNA表達(dá)水平顯著低于S3I-201單用藥組，Nam 和Stattic聯(lián)合用藥組中LDHAmRNA 表達(dá)水平顯著低于Stattic單用藥組。見圖8。

Fig.3 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on cell proliferation圖3 STAT3抑制劑及Nam對(duì)細(xì)胞增殖的影響

Fig.4 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of cell proliferation-related genes圖4 STAT3抑制劑及Nam對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

Fig.5 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of apoptosis-related genes圖5 STAT3抑制劑及Nam對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

Fig.6 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of EMT-related genes圖6 STAT3抑制劑及Nam對(duì)EMT相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

Fig.7 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of glycolysis-related genes圖7 STAT3抑制劑及Nam對(duì)糖酵解相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

Fig.8 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of GLUT1 and LDHA圖8 STAT3抑制劑及Nam對(duì)GLUT1和LDHA mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

相關(guān)研究表明，Stattic 和S3I-201 可以降低肺癌［7］、前列腺癌［10］和鼻咽癌［11］細(xì)胞中STAT3 Y705位的磷酸化水平，同時(shí)Nam可以降低肺癌細(xì)胞中Y705位的磷酸化水平［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用STAT3抑制劑或Nam均可以降低肝細(xì)胞癌HepG2中STAT3 Y705 位的磷酸化水平，抑制細(xì)胞增殖，且聯(lián)合用藥效果更顯著。

肝癌的發(fā)生與發(fā)展受多種因素的影響，細(xì)胞增殖和凋亡的失控是其中重要的環(huán)節(jié)。癌細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)志是具有無限的增殖能力。MCM7、MKI67和MYC是3 個(gè)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的基因，MCM7 是ATP依賴的DNA解旋酶，在DNA復(fù)制起始發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物［12］。MCM7 過表達(dá)可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖，其高表達(dá)與肝細(xì)胞癌不良的預(yù)后相關(guān)［13］。MKI67 是一個(gè)核蛋白，其在肝細(xì)胞癌中表達(dá)量升高［14-15］，敲低MKI67 可以抑制肝細(xì)胞癌的增殖［16］。MYC 在包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種類型腫瘤中表達(dá)量上調(diào)［17］，在肝癌發(fā)生和肝細(xì)胞增殖中起著重要作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)STAT3抑制劑或者Nam 處理可以降低MCM7、MKI67和MYCmRNA表達(dá)水平，且聯(lián)合用藥效果更顯著。細(xì)胞凋亡是有機(jī)體為了維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而啟動(dòng)的細(xì)胞程序性死亡的過程，這一過程受到BCL-2蛋白家族的調(diào)控，包括抗凋亡蛋白（如BCL-2、BCL-XL和MCL-1）以及促凋亡蛋白（如BAX和BAK）［19］。研究表明，肝癌組織中BCL-2 和MCL-1 高表達(dá)，BAX 低表達(dá)，腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 抑制劑或者Nam 處理后，促凋亡基因BAXmRNA 表達(dá)量升高，抗凋亡基因BCL-2和MCL-1mRNA 表達(dá)量降低，且聯(lián)合用藥效果更顯著，提示STAT3抑制劑以及Nam可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制肝癌細(xì)胞增殖。

EMT是指上皮細(xì)胞向具有遷移和侵襲能力的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3抑制劑或者Nam處理后，與EMT相關(guān)基因SNAIL1、VEGFA、ZEB1和SMAD3mRNA 表達(dá)量降低，TJP1mRNA 表達(dá)量升高，且聯(lián)合用藥效果更顯著。這些基因不僅在EMT 過程中發(fā)揮重要作用，還影響腫瘤細(xì)胞的增殖。TJP1是將跨膜的緊密連接蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連的支架蛋白［23］，肝癌組織中TJP1 表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)TJP1 可以降低肝癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞遷移［24］。SMAD3是EMT過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以被轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 激活，從而啟動(dòng)下游一系列與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［25］。Snail1是EMT和細(xì)胞增殖的重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過下調(diào)E-鈣黏蛋白，上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)EMT 過程［26］。研究表明，過表達(dá)Snail1 可以通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D1 和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)水平來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，反之亦然［27］。VEGFA是一種促進(jìn)血管生成的生長因子，可以促進(jìn)細(xì)胞遷移。研究表明，VEGFA在肝癌組織與肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)［28］。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，VEGFA過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖［29］。在小鼠體內(nèi)，VEGFA 過表達(dá)可促進(jìn)肝癌生長，而抑制VEGFA 活性可以抑制肝癌生長［30］。ZEB1 是EMT 過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)EMT 過程。研究表明，ZEB1 在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)［31］，敲低ZEB1可以抑制肝癌細(xì)胞增殖［32］。因此，筆者認(rèn)為STAT3抑制劑及Nam 可能通過調(diào)控EMT 相關(guān)基因的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞增殖。

正常細(xì)胞主要依賴線粒體的氧化磷酸化來產(chǎn)生細(xì)胞所需的能量，而大部分的腫瘤細(xì)胞依賴于有氧糖酵解，即無論是否存在氧氣，腫瘤細(xì)胞都傾向于將大部分的葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，這一現(xiàn)象被稱為Warburg 效應(yīng)［33］。Warburg 效應(yīng)不僅可以為快速增殖的腫瘤細(xì)胞提供合成核酸、脂質(zhì)以及蛋白的原料，還可以調(diào)節(jié)活性氧水平和腫瘤微環(huán)境，從而賦予腫瘤細(xì)胞生長上的優(yōu)勢(shì)、耐藥性和轉(zhuǎn)移性［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 抑制劑及Nam 可以抑制糖酵解過程關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，并抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1以及乳酸脫氫酶LDHA的表達(dá)，且聯(lián)合用藥效果更顯著。這提示STAT3 抑制劑及Nam 處理會(huì)導(dǎo)致糖酵解過程被抑制，減少乳酸生成，抑制Warburg 效應(yīng)，從而影響肝癌細(xì)胞的能量代謝，抑制肝癌細(xì)胞增殖。

綜上，STAT3抑制劑及NAD 前體Nam 可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，并且聯(lián)合用藥效果更顯著，進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、EMT及糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，提示STAT3 抑制劑和Nam 聯(lián)合用藥可作為潛在的肝癌治療方案。