李建軍，吳素方，白豐璽

肺結(jié)核（pulmonary tuberculosis，PTB）是一種由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性呼吸系統(tǒng)傳染病［1-2］。肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage，AM）是肺內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，可對(duì)Mtb進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)和免疫清除［3-4］。AM與肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞存在密切聯(lián)系，特別是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（type Ⅱalveolar epithelial cell，AECⅡ）能夠以接觸依賴性或非接觸依賴性方式調(diào)節(jié)肺中AM的免疫反應(yīng)［5］；AECⅡ和AM之間的相互作用可調(diào)節(jié)和（或）塑造AM 的 表 型，以 應(yīng) 對(duì) 損 傷［6］。另 外，外 泌 體（exosomes，Exos）在細(xì)胞間信號(hào)的傳遞中起著關(guān)鍵作用。近年來(lái)，Exos 中的微小RNA（microRNA，miRNA 或miR）成為研究熱點(diǎn)［7］。研究顯示，用脂多糖處理AEC 可上調(diào)AEC 來(lái)源Exos 中miR-92a-3p的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)將炎癥信號(hào)傳遞給活化的AM 來(lái)引發(fā)肺內(nèi)炎癥反應(yīng)［8］。Exos介導(dǎo)的miRNA遞送是一種治療肺部炎癥反應(yīng)的新方法［9］。本研究使用miRNA 測(cè)序?qū)φECⅡ來(lái)源的Exos（AEC-Exos）和Mtb 感染AECⅡ來(lái)源的Exos（Mtb-AEC-Exos）中差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行鑒定，并篩選出與炎癥反應(yīng)有關(guān)的miR-145，進(jìn)一步評(píng)估了miR-145 在Mtb-AEC-Exos中的表達(dá)及其對(duì)AM極化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Mtb 毒株H37Rv 購(gòu)自中國(guó)獸藥檢驗(yàn)所；FITC標(biāo)記的抗CD86抗體和PE標(biāo)記的抗CD163抗體均購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson 公司；綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自南京雙領(lǐng)生物科技有限公司；CD63、CD81和熱休克蛋白70（HSP70）抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、DiO（細(xì)胞膜綠色熒光探針）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA 裂解液購(gòu)自碧云天生物科技公司；TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（粉末）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；miRNA cDNA 合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 和miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa 公司；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。Leica confocal 118 SP5共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；Hitachi H-600 透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；ZetaView 納米顆粒跟蹤分析儀（德國(guó)Particle Metrix公司）；Coulter Optima TM L-80XP 超速離心機(jī)、Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；iMark680 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383（CL-0172）和大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞RLE-6TN（CP-R003）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)1 Mtb-AEC-Exos的鑒定

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NR8383培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的Ham's F-12K培養(yǎng)基中，RLE-6TN在含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，當(dāng)細(xì)胞密度融合至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 Mtb毒株H37Rv培養(yǎng) 所有與Mtb H37Rv菌株相關(guān)的實(shí)驗(yàn)均在生物安全三級(jí)（BSLⅢ）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。Mtb H37Rv細(xì)菌在含有10%Middlebrook ADC 增菌液和0.05%Tween 80 的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基中于37 ℃下培養(yǎng)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收取細(xì)菌，并以1×108個(gè)桿菌/mL 的濃度在DMEM/F-12 培養(yǎng)基中沉淀并重懸。然后將其等分成6 份，并儲(chǔ)存在-80 ℃作為工作原液備用。

1.2.3 Mtb感染AECⅡ 為了可視化Mtb感染，將AECⅡ接種在蓋玻片上，并以1∶50感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）感染GFP標(biāo)記的Mtb（Mtb-GFP），命名為Mtb-AECⅡ組，另設(shè)AECⅡ組（正常培養(yǎng)不進(jìn)行感染），并在37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h 后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌AECⅡ3 次并用4%多聚甲醛固定20 min，再次用PBS 洗滌AECⅡ3次，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，在共聚焦顯微鏡下觀察。此外，在感染72 h后，使用EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒在Mtb 感染的AECⅡ中檢測(cè)細(xì)胞增殖水平［10］，使用共聚焦顯微鏡拍攝圖像。

1.2.4 Mtb-AEC-Exos 的分離與鑒定 AEC Ⅱ于無(wú)血清DMEM 中在Mtb 存在的情況下培養(yǎng)72 h后，收集來(lái)自AECⅡ的細(xì)胞培養(yǎng)基，并在4 ℃下以300×g離心10 min、2 000×g離心20 min（棄沉淀，除去細(xì)胞）和10 000×g離心30 min（棄沉淀，除去亞細(xì)胞成分）；收集上清液用0.22μm 規(guī)格過(guò)濾器過(guò)濾，在超速離心機(jī)中4 ℃100 000×g離心70 min，沉淀Exos；Exos顆粒用無(wú)菌PBS洗滌，繼續(xù)在4 ℃，100 000×g離心70 min；沉淀的Exos在無(wú)菌PBS中重懸，并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中，命名為Mtb-AECⅡ組。從正常AECⅡ培養(yǎng)上清液中提取的Exos（AEC-Exo）用作對(duì)照，命名為AECⅡ組。隨后使用透射電子顯微鏡（TEM）和納米粒子追蹤分析（NTA）觀察Exos形態(tài)，檢測(cè)Exos 的數(shù)量和大小；并使用流式細(xì)胞術(shù)鑒定Exos 表面特征標(biāo)志物CD63、CD81和HSP70，3個(gè)指標(biāo)同時(shí)有表達(dá)即表示Exos的存在；使用RIPA裂解液分離Exos中的蛋白質(zhì)，并使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒檢測(cè)Exos的蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 Exos的miRNA微陣列檢測(cè) miRNA微陣列研究Mtb-AEC-Exos 和AEC-Exo 之間差異表達(dá)的miRNA。使用miRNeasy Mini Kit 提取和純化總RNA。Exos miRNA 微陣列雜交、數(shù)據(jù)生成和歸一化由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。為了全面分析微陣列數(shù)據(jù)，篩選出兩者中基因變化倍數(shù)≥2 的miRNA。在miRNA 微陣列檢測(cè)后，使用miRNA cDNA 合成試劑盒合成cDNA 樣本并采用miRNA 熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算歸一化為U6后miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Mtb-AEC-Exos 在巨噬細(xì)胞中的作用 為了評(píng)估Mtb-AEC-Exos 對(duì)AM 活化的影響，用親脂性染料DiO 標(biāo)記Exos，用TRITC-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記AM 的細(xì)胞骨架。AM（1×105個(gè)）接種在蓋玻片上，分為AECⅡ組和Mtb-AECⅡ組，分別與標(biāo)記的Exos（AEC-Exos、Mtb-AEC-Exos）共培養(yǎng)24 h后，將用Exos 處理的巨噬細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定，用0.1%Triton X-100滲透，用3%胎牛血清白蛋白封閉。然后，取200μL現(xiàn)配的TRITC-鬼筆環(huán)肽染色工作液，完全覆蓋蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30 min。用DAPI 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色?？篃晒獯銣鐒┓馄?，在共聚焦顯微鏡下觀察。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6和IL-10的水平。

1.3 實(shí)驗(yàn)2 Mtb-AEC-Exos對(duì)AM極化的影響及分子機(jī)制

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 由上海GenePharma 公司合成miR-145 模擬物（mimic）、miR-145 沉默序列（inhibitor）及其相應(yīng)的陰性對(duì)照（mimic-NC和inhibitor-NC）慢病毒載體。為了獲得過(guò)表達(dá)或沉默miR-145的Exos，用過(guò)表達(dá)或沉默miR-145的慢病毒以20 MOI 轉(zhuǎn)染AECⅡ。實(shí)驗(yàn)分為：對(duì)照組、mimic-NC 組、miR-145 mimic 組、inhibitor-NC 組、miR-145 inhibitor 組。然后，參照1.2.3 和1.2.4 步驟用Mtb 感染AECⅡ并分離Exos，qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染的Mtb-AECⅡExos 中miR-145mRNA 水平。最后，將NR8383細(xì)胞分別與上述各組中的Exos（含終濃度為80 mg/L Exos的培養(yǎng)基）共同孵育24 h，以誘導(dǎo)M1或M2巨噬細(xì)胞極化。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)志物（CD86）、M2型標(biāo)志物（CD163）表達(dá) 采用流式細(xì)胞術(shù)分析CD163 和CD86陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的百分比。NR8383細(xì)胞重懸于PBS中并調(diào)整濃度為1×106個(gè)/mL，加入5 μL FITC-CD86 抗體或5 μL PECD163 抗體，在室溫下孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀分析CD86和CD163巨噬細(xì)胞的百分比。

1.3.3 qPCR 檢測(cè)巨噬細(xì)胞中miR-145、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶1（Arg-1）和IL-10的mRNA 水平 使用TRIzol試劑從細(xì)胞中分離總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在Prism?7500 熒光定量PCR 儀上使用SYBR Green PCR Master Mix 進(jìn)行qPCR。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。U6用作miR-145的內(nèi)參，mRNA水平用β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）的mRNA水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并表示為倍數(shù)變化。引物序列見(jiàn)表1?；虻南鄬?duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt法表示。

Tab.1 The primer sequence of qPCR表1 qPCR的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)1

2.1.1 Mtb感染AECⅡ與Exos的鑒定 共聚焦顯微鏡成像結(jié)果顯示，Mtb 被AECⅡ吸收，見(jiàn)圖1。EdU檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的AECⅡ相比，Mtb感染不影響AECⅡ的增殖（P＞0.05），見(jiàn)表2，圖2。Exos分離后，TEM 和NTA 分析結(jié)果顯示，Mtb-AEC 組和AECⅡ組均分泌直徑約為100 nm 的球形囊泡，見(jiàn)圖3；Mtb-AECⅡ組Exos 的數(shù)量高于AECⅡ組（P＜0.01），見(jiàn)表2。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Exos中CD63、CD81、HSP70 均呈陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖4。此外，與AECⅡ組相比，Mtb-AECⅡ組Exos 中蛋白質(zhì)含量增加（P＜0.01），見(jiàn)表2。

Fig.1 Image showing that Mtb was absorbed by AECⅡ圖1 Mtb被AECⅡ吸收

Tab.2 Comparison of AECⅡproliferation activity,Exos quantity and protein content between the two groups表2 2組間AECⅡ增殖活性、Exos數(shù)量和蛋白質(zhì)含量的比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of AECⅡproliferation activity,Exos quantity and protein content between the two groups表2 2組間AECⅡ增殖活性、Exos數(shù)量和蛋白質(zhì)含量的比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別AECⅡ組Mtb-AECⅡ組t Edu陽(yáng)性細(xì)胞（%）42.36±5.27 45.29±5.67 0.656 Exos數(shù)量（×105/cell）1.39±0.20 2.28±0.25 4.815＊＊Exos蛋白質(zhì)含量（mg/L）0.35±0.05 0.71±0.08 6.609＊＊

Fig.2 The effect of Mtb infection on the proliferation of AECⅡ圖2 Mtb感染對(duì)AECⅡ增殖的影響

Fig.3 Morphology and particle size distribution of Mtb-infected AECⅡ-derived Exos圖3 Mtb感染的AECⅡ來(lái)源Exos的形態(tài)和粒徑分布

Fig.4 Flow cytometry showing positive expression of Exos surface markers CD63,CD81 and HSP70圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示Exos表面標(biāo)志物CD63、CD81、HSP70陽(yáng)性表達(dá)

2.1.2 Exos 的miRNA 微陣列檢測(cè) 總共評(píng)估了3 604 個(gè)Exos miRNA（圖5A），并鑒定了一組差異表達(dá)的miRNA（倍數(shù)變化＞2）。前5 個(gè)差異表達(dá)的Exos miRNA 分 別 為miR-574-5p、miR-145、miR-6124、miR-6165、miR-6760-5p（圖5B），通過(guò)qPCR驗(yàn)證了4個(gè)上調(diào)miRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-145的表達(dá)水平增加最多，見(jiàn)圖5C。

2.1.3 Mtb-AEC-Exos 促進(jìn)AM 活化 共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，AECⅡ組和Mtb-AECⅡ組中均可見(jiàn)綠色DiO 標(biāo)記的Exos 被巨噬細(xì)胞內(nèi)化，見(jiàn)圖6。與AECⅡ組相比，Mtb-AECⅡ組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10 水平增加，TNF-α 和IL-6 的水平降低（均P＜0.01），見(jiàn)表3。

2.2 實(shí)驗(yàn)2

2.2.1 轉(zhuǎn)染后各組Mtb-AECⅡExos 中miR-145水平比較 與對(duì)照組相比，mimic-NC 組和inhibitor-NC 組Mtb-AECⅡExos 中miR-145水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-145 mimic 組miR-145水平升高，miR-145 inhibitor 組miR-145水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.2.2 各組CD86 和CD163 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比的比較 與對(duì)照組相比，mimic-NC 組和inhibitor-NC組的CD86 陽(yáng)性和CD163 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-145 mimic組CD86陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比降低，CD163 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比升高（P＜0.05），miR-145 inhibitor組CD86陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比升高，CD163 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比降低（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖7。

2.2.3 各組巨噬細(xì)胞中miR-145、TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-10的mRNA 水平比較 與對(duì)照組相比，mimic-NC 組 和inhibitor-NC 組miR-145、TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-10的mRNA 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-145 mimic組TNF-α、iNOSmRNA表達(dá)水平降低，miR-145、Arg-1和IL-10mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），miR-145 inhibitor 組TNF-α、iNOSmRNA 表達(dá)水平升高，miR-145、Arg-1和IL-10mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表5。

Fig.5 Exos miRNA microarray detection圖5 Exos的miRNA微陣列檢測(cè)

Fig.6 Images showing that Mtb-AEC-Exos were internalized by macrophages圖6 Mtb-AEC-Exos被巨噬細(xì)胞內(nèi)化

Tab.3 Comparison of TNF-α,IL-6 and IL-10 levels in macrophages between the two groups表3 2組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平的比較 （n=3，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of TNF-α,IL-6 and IL-10 levels in macrophages between the two groups表3 2組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平的比較 （n=3，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01。

組別AECⅡ組Mtb-AECⅡ組t TNF-α 27.40±3.39 15.56±2.61 4.793＊＊IL-6 50.62±6.45 29.14±3.38 5.109＊＊IL-10 46.81±6.23 115.20±11.04 9.344＊＊

Tab.4 Comparison of miR-145 levels and the percentages of CD86-positive and CD163-positive macrophages between the five groups表4 各組miR-145 水平與CD86陽(yáng)性和CD163陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of miR-145 levels and the percentages of CD86-positive and CD163-positive macrophages between the five groups表4 各組miR-145 水平與CD86陽(yáng)性和CD163陽(yáng)性巨噬細(xì)胞百分比比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與mimic-NC組比較，c與inhibitor-NC組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組mimic-NC組miR-145 mimic組inhibitor-NC組miR-145 inhibitor組F miR-145 1.00±0.00 1.02±0.11 3.48±0.42ab 1.03±0.10 0.35±0.06ac 108.869＊＊CD86陽(yáng)性（%）40.70±5.58 41.26±5.23 22.14±3.56ab 40.95±5.18 62.43±7.02ac 21.045＊＊CD163陽(yáng)性（%）55.62±7.39 57.34±8.12 80.61±9.75ab 56.59±7.26 32.28±5.03ac 14.935＊＊

Tab.5 Comparison of mRNA levels of miR-145,TNF-α,iNOS,Arg-1 and IL-10 between the five groups of macrophages表5 各組巨噬細(xì)胞中miR-145、TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-10的mRNA水平比較 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of mRNA levels of miR-145,TNF-α,iNOS,Arg-1 and IL-10 between the five groups of macrophages表5 各組巨噬細(xì)胞中miR-145、TNF-α、iNOS、Arg-1和IL-10的mRNA水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與mimic-NC組比較，c與inhibitor-NC組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組mimic-NC組miR-145 mimic組inhibitor-NC組miR-145 inhibitor組F iNOS 1.00±0.00 1.01±0.13 0.62±0.08ab 1.03±0.10 2.28±0.24ac 66.299＊＊Arg-1 1.00±0.00 1.01±0.10 2.87±0.31ab 1.03±0.12 0.51±0.08ac 98.544＊＊IL-10 1.00±0.00 1.02±0.15 3.25±0.27ab 1.01±0.11 0.46±0.07ac 158.444＊＊組別對(duì)照組mimic-NC組miR-145 mimic組inhibitor-NC組miR-145 inhibitor組F miR-145 1.00±0.00 1.01±0.14 2.60±0.25ab 1.04±0.13 0.52±0.10ac 86.639＊＊TNF-α 1.00±0.00 1.03±0.12 0.54±0.09ab 1.02±0.11 3.15±0.20ac 212.628＊＊

Fig.7 CD86 and CD163 positive expression of macrophages in each group(flow cytometry)圖7 各組巨噬細(xì)胞CD86陽(yáng)性和CD163陽(yáng)性表達(dá)（流式細(xì)胞術(shù)）

3 討論

Mtb 感染可激活宿主的免疫防御，涉及先天免疫細(xì)胞，導(dǎo)致IL-1β 和TNF-α 等各種炎性細(xì)胞因子的分泌增加［11］。巨噬細(xì)胞是抵抗Mtb感染的第一道屏障，了解Mtb-巨噬細(xì)胞相互作用的潛在機(jī)制可能為結(jié)核病治療提供新的策略。除了AM，AEC最近也被認(rèn)為是Mtb 感染的主要目標(biāo)，其不僅具有上皮屏障功能，還可作為非專業(yè)性免疫細(xì)胞在感染反應(yīng)中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［12］。AEC可通過(guò)對(duì)感染的直接反應(yīng)或調(diào)節(jié)專業(yè)免疫細(xì)胞（如AM）免疫反應(yīng)的間接作用，在宿主對(duì)Mtb 感染的保護(hù)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［13-14］。另有研究認(rèn)為，AM極化參與結(jié)核病的發(fā)病過(guò)程［15-16］。AM 極化具有M1 和M2 兩個(gè)階段：M1 型的特征是炎癥反應(yīng)激活，包括但不限于TNF-α類的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平升高；M2型的特點(diǎn)是通過(guò)增加抗炎細(xì)胞因子（如IL-10）的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用。研究已證實(shí)，在外部刺激（包括Mtb）下，AEC可通過(guò)分泌細(xì)胞因子和介質(zhì)，調(diào)節(jié)AM表型或活化［17］。目前，有關(guān)源自AEC 的Exos 對(duì)AM 極化的影響研究少見(jiàn)。本研究結(jié)果顯示，與AECⅡ組相比，Mtb感染AECⅡ促進(jìn)了Exos 的產(chǎn)生，但對(duì)AECⅡ的增殖水平?jīng)]有影響；Mtb-AECⅡ被巨噬細(xì)胞吸收后可通過(guò)增加IL-10 水平，減少TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生來(lái)誘導(dǎo)AM 的抗炎反應(yīng)；表明Mtb 刺激AEC 來(lái)源的Exos 可誘導(dǎo)AM 向M2 極化，但其對(duì)AM 極化的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

Exos 可攜帶lncRNA、miRNA、mRNA 和其他分子，是不同細(xì)胞之間的重要信使，在包括結(jié)核病在內(nèi)的許多疾病的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，感染Mtb 會(huì)導(dǎo)致Exos 中部分miRNA 表達(dá)水平發(fā)生顯著 變 化［18-19］。然而，目前有關(guān)Mtb-AEC-Exos 和Mtb-AEC-Exos miRNA 在AM 極化中的作用尚不明確。研究顯示，在結(jié)核病患者血清和Mtb 感染后人類巨噬細(xì)胞中miR-145 表達(dá)水平下調(diào)，且其表達(dá)水平與炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；Mtb 感染后巨噬細(xì)胞中miR-145的過(guò)表達(dá)可抑制感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［20-21］。本研究結(jié)果亦顯示，Mtb感染AECⅡ來(lái)源的Exos 中，其miR-145的表達(dá)水平與正常AECⅡ來(lái)源的Exos 相比存在差異，表明Mtb-AEC-Exos 的作用可能是通過(guò)miR-145 介導(dǎo)的，提示Mtb-AECExos對(duì)AM極化的影響可能與miR-145有關(guān)。

為了進(jìn)一步闡述miR-145 在AM 響應(yīng)Mtb 感染中的作用，本研究采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染AECⅡ以上調(diào)或抑制Exos 中miR-145 表達(dá)。CD86 和CD163 分別是M1 巨噬細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，TNF-α和iNOS是M1極化巨噬細(xì)胞的代表性指標(biāo)，Arg-1和IL-10 是M2 極化巨噬細(xì)胞的代表性指標(biāo)。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-145 后，Mtb-AECⅡExos 和巨噬細(xì)胞中miR-145水平均升高，同時(shí)CD163陽(yáng)性細(xì)胞、Arg-1和IL-10的mRNA 表達(dá)升高，CD86陽(yáng)性細(xì)胞、iNOS和TNF-α的mRNA 表達(dá)降低，而下調(diào)miR-145 表現(xiàn)出相反的作用，表明Mtb-AECⅡExos中miR-145的高表達(dá)促進(jìn)了M2 巨噬細(xì)胞極化，限制了M1 巨噬細(xì)胞極化，提示Mtb 刺激AECⅡ衍生的Exos 可能通過(guò)miR-145 促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化并抑制M1 極化而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，Mtb 感染AECⅡ來(lái)源Exos 可能通過(guò)miR-145刺激巨噬細(xì)胞向M2型極化，對(duì)抗炎癥。本研究表明Mtb感染AECⅡ來(lái)源Exos中的miR-145介導(dǎo)了AEC 和巨噬細(xì)胞之間的作用，但具體的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。