石柳柳，許振，吳志意，趙金龍，雷佳琦，吳艷△

經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI）是治療冠心病的有效手段之一，但術(shù)后再狹窄是影響其長期療效的重要因素，新生內(nèi)膜形成是PCI術(shù)后再狹窄的主因［1］。近年有研究發(fā)現(xiàn)，在動脈血管壁外膜特別是中外膜交界處存在c-kit 陽性（c-kit+）細胞，當(dāng)血管受到損傷刺激時，這些c-kit+細胞可向內(nèi)皮下層遷移并合成大量細胞外基質(zhì)，參與新生內(nèi)膜形成［2-3］。因此，探索c-kit+細胞向新生內(nèi)膜遷移的機制將有助于了解PCI術(shù)后再狹窄的機制及尋找新的靶點和治療策略。研究發(fā)現(xiàn)，通過刺激迷走神經(jīng)減弱交感神經(jīng)活性，可改變血管內(nèi)皮功能紊亂，激活膽堿能抗炎系統(tǒng)，抑制動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［4-5］。但是迷走神經(jīng)在血管損傷后新生內(nèi)膜形成中的作用還不明確，電刺激迷走神經(jīng)能否通過調(diào)控血管壁c-kit+細胞的遷移而影響新生內(nèi)膜的形成，值得探究。因此，本研究采用大鼠頸總動脈球囊損傷所致血管狹窄模型，觀察電刺激迷走神經(jīng)對血管壁c-kit+細胞遷移到血管損傷處并參與新生內(nèi)膜形成的作用及機制，為尋求血管狹窄及PCI術(shù)后再狹窄的新的治療靶點和治療策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 42只SPF級雄性SD大鼠購自湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心，其中24只12周齡大鼠用于動物模型實驗，18只6～8周齡大鼠用于提取原代c-kit+細胞。大鼠由專人飼養(yǎng)，在溫度（23±2）℃、相對濕度（55±10）%、晝夜交替各12 h的受控條件下自由進食和飲水。所有動物實驗均按照實驗動物的飼養(yǎng)和護理的指南進行，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院機構(gòu)動物護理和使用委員會審查并批準后，根據(jù)機構(gòu)規(guī)定進行實驗。

1.1.2 實驗材料及試劑 乙酰膽堿（Ach）、DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Sigma-Aldrich；c-kit一抗、平滑肌22α（SM22α）蛋白一抗、α7 煙堿樣乙酰膽堿受體（α7nAChR）一抗、內(nèi)參（GAPDH）一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗、Alexa Fluor 488 偶聯(lián)二抗和Alexa Fluor 594 偶聯(lián)二抗均購自英國Abcam；c-kit+細胞篩選磁珠購自德國Miltenyi Biotec；α7nAChR拮抗劑購自美國Selleck；大鼠白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自中國欣博盛；異氟烷購自中國瑞沃德；戊巴比妥鈉購自美國Sigma-Aldrich?；A(chǔ)培養(yǎng)基：100 mL 無酚紅的DMEM/F-12培養(yǎng)基含有胎牛血清10 mL、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、100 U/mL青鏈霉素和2 mmol/L 谷氨酰胺。干細胞培養(yǎng)基：100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入白血病抑制因子，其終濃度為10μg/L。血小板衍生因子-BB（PDGF-BB）誘導(dǎo)平滑肌細胞（SMC）分化培養(yǎng)基：在100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入PDGF-BB，終濃度為20μg/L。細胞培養(yǎng)所用的T25培養(yǎng)瓶和24孔板等耗材購自美國Thermo 公司。熒光顯微鏡拍照系統(tǒng)（BX53+DP74）購自日本奧林巴斯（Olympus）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 24只大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組（左頸總動脈球囊損傷組）和迷走神經(jīng)刺激組（左頸總動脈球囊損傷+左側(cè)迷走神經(jīng)刺激組），每組8只。

1.2.2 大鼠左頸總動脈球囊損傷模型制備 模型組和迷走神經(jīng)刺激組大鼠行異氟烷麻醉后，仰臥位固定。去除頸部被毛后，于胸骨上端至頜下皮膚做2～3 cm切口。經(jīng)鈍性分離肌層后，游離出一段3～5 cm長的左頸總動脈，再沿左頸總動脈遠心端繼續(xù)鈍性分離，以暴露頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉，在頸外動脈靠頭部的位置打結(jié)，近心端用動脈夾夾閉左頸總動脈。然后用血管剪在頸外動脈近心端上做一個垂直切口，用血管擴張器將動脈切口輕輕擴開，用鑷子輕輕夾住準備好的球囊桿部，將球囊插入動脈切口。取下動脈夾，無出血后繼續(xù)插入導(dǎo)管，直至導(dǎo)管標記位置（距離球囊端約4 cm）。打開三通開關(guān)，經(jīng)導(dǎo)管向球囊內(nèi)注入約0.02 mL的無菌生理鹽水，關(guān)閉三通開關(guān)，使球囊保持膨脹狀態(tài)。轉(zhuǎn)動導(dǎo)管的同時，將其慢慢拉出，至動脈切口位置，重復(fù)3次。最后，打結(jié)以封閉動脈切口，取下動脈夾，恢復(fù)血供，縫合筋膜和皮膚。假手術(shù)組大鼠經(jīng)麻醉、頸部去毛、分離出左頸外動脈后，直接縫合筋膜和皮膚，不進行球囊損傷操作。

1.2.3 電刺激迷走神經(jīng) 因左側(cè)迷走神經(jīng)發(fā)出支配心臟的傳出纖維較少，且以支配房室結(jié)為主，刺激時對心率及血壓影響相對較小，故選擇刺激左側(cè)迷走神經(jīng)。迷走神經(jīng)刺激組在左側(cè)頸總動脈球囊損傷后72 h 開始刺激，刺激儀（北京眾實迪科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號：YLS-9A）參數(shù)設(shè)置如下：電流0.5 mA，電壓2 V，單向波，波寬0.3 ms，波間隙49.7 ms，頻率20 Hz，間斷時間270 s（即每5 min刺激30 s，休息270 s），持續(xù)4 h。模型組僅連接刺激儀，但不通電刺激。假手術(shù)組既不連接刺激儀，也不通電刺激。

1.2.4 HE染色及免疫組織化學(xué)染色 術(shù)后14 d，各組均取3只大鼠，麻醉，開胸暴露游離心臟，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，剪開右心耳，生理鹽水沖洗，再灌注4%多聚甲醛進行前固定，大鼠在此過程中死亡。之后取左頸總動脈損傷處血管，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，選血管中段位置的切片，HE染色觀察血管內(nèi)膜平均增厚情況，利用Image J軟件計算內(nèi)膜厚度，通過免疫組織化學(xué)染色觀察c-kit+細胞在血管壁中的分布，利用Image-Pro plus軟件計算光密度值。

1.2.5 大鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-6的含量測定 術(shù)后14 d，各組3 只大鼠心臟取血，全血4 ℃靜置30 min 后，1 000 r/min于4 ℃離心10 min，分離得到血清，通過ELISA檢測血清中TNF-α和IL-6含量。

1.2.6 血管壁c-kit+細胞的分離、純化及鑒定 利用外膜組織貼塊法獲取血管壁外膜細胞［6］。取另外18 只SD 大鼠，以2.5 mL/kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。仰臥位固定后，打開胸腹腔，分離主動脈后迅速置于預(yù)冷的D-Hank’s液中。加入0.2%（約2 mL）Ⅱ型膠原酶浸泡血管，37 ℃恒溫搖床120 r/min消化15 min。擦除內(nèi)皮細胞，用鐘表鑷小心仔細地剝離中膜，并舍棄。將剩余的血管外膜用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊，將其均勻地平鋪至T25 培養(yǎng)瓶底部，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)倒置，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。3 h后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，小心加入干細胞培養(yǎng)基3 mL覆蓋組織塊，正置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h 后，于相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。待大部分組織塊邊緣有細胞遷移萌出，更換培養(yǎng)基，此后每72 h更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細胞生長融合達到約80%時，胰酶消化后按照磁珠篩選說明書，分選得到c-kit+細胞，并經(jīng)c-kit+免疫細胞化學(xué)染色鑒定。

1.2.7 篩選后c-kit+細胞純度分析及α7nAChR 在細胞中的表達 將磁珠篩選后的細胞按1×104/孔的密度接種在24 孔板中，在干細胞培養(yǎng)基中生長至60%～80%融合時，通過免疫熒光法檢測c-kit 標志物的表達。每孔隨機讀取5 個視野拍照，統(tǒng)計c-kit 陽性細胞的百分率。另外，將磁珠篩選后的c-kit+細胞按1×104/孔的密度接種在24 孔板中，在干細胞培養(yǎng)基中增殖融合至60%～80%時，通過免疫熒光法檢測α7nAChR在c-kit+細胞中的表達。

1.2.8 Transwell 實驗觀察Ach 對c-kit+細胞遷移的影響 取在干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的c-kit+細胞，分組進行Ach干預(yù)，包括對照組（不加入Ach）、1×10-5mol/L Ach 組、1×10-8mol/L Ach組及1×10-5mol/L Ach+α7nAChR拮抗劑組，每24 h換液1次，共培養(yǎng)5 d。c-kit+細胞處理48 h后，Transwell小室放置于預(yù)先準備好的24 孔板中，按上述條件培養(yǎng)箱中過夜，向Transwell 小室下室中加入600μL 含體積分數(shù)10%胎牛血清的干細胞培養(yǎng)基。用無血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液重懸各組細胞，取200 μL 細胞懸液（細胞總數(shù)約1×105個）加至Transwell 的上室。48 h后去除下室中的培養(yǎng)液，將小室置于4%多聚甲醛中固定15 min，擦去小室內(nèi)室膜上的細胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，PBS 漂洗后，顯微鏡下觀察，每孔隨機讀取5個視野拍照，統(tǒng)計并分析。

1.2.9 Western blot檢測Ach對c-kit+細胞分化的影響 c-kit+細胞在SMC 分化培養(yǎng)基條件下，給予Ach 處理，具體細胞分組同1.2.8。取c-kit+細胞裂解液進行SDS-PAGE 電泳，24 V恒壓轉(zhuǎn)PVDF 膜45 min。5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，1×TBST洗膜3次，每次5 min。內(nèi)參GAPDH和SM22α抗體分別按照1∶5 000 和1∶1 000 稀釋。室溫孵育2 h，1×TBST 洗3 次后，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育30 min，1×TBST 洗3 次后進行顯影。通過Image J 軟件進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，Graphpad Prism 8.0 軟件作圖。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，2 組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡情況 納入24只大鼠，最終死亡3只大鼠，模型組死亡1只，迷走神經(jīng)刺激組死亡2只。

2.2 各組大鼠新生內(nèi)膜增厚程度的變化 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組和迷走神經(jīng)刺激組的內(nèi)膜與中膜厚度比分別為（5.27±2.41）%、（211.87±12.47）%和（127.00±19.78）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=175.734，P＜0.05）。與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠新生內(nèi)膜厚度增加；與模型組相比，迷走神經(jīng)刺激組新生內(nèi)膜增厚程度減小，見圖1。

Fig.1 Comparison of neointimal thickness in the injured carotid artery between the three groups of rats(HE staining)圖1 各組大鼠頸總動脈損傷處血管新生內(nèi)膜厚度比較（HE染色）

2.3 各組大鼠c-kit+在血管壁中分布及數(shù)量變化 免疫組織化學(xué)染色顯示，假手術(shù)組無新生內(nèi)膜形成，ckit+細胞主要分布于血管壁外膜及中外膜交界處；模型組新生內(nèi)膜及外膜中均有c-kit+細胞分布，見圖2。模型組和迷走神經(jīng)刺激組新生內(nèi)膜中的c-kit+平均光密度值分別為0.057±0.010 和0.019±0.001。與模型組相比，迷走神經(jīng)刺激組新生內(nèi)膜中c-kit+細胞表達數(shù)量減少（t=6.184，P＜0.05）。

Fig.2 Expression of c-kit+in the injured carotid artery between the three groups of rats(DAB staining)圖2 各組大鼠頸總動脈損傷處c-kit+細胞（DAB染色）

2.4 各組大鼠血清中炎性因子TNF-α 和IL-6 的水平變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6 的水平均升高；與模型組比較，迷走神經(jīng)刺激后TNF-α和IL-6水平均降低，見表1。

Tab.1 The serum levels of TNF-α and IL-6 in the three groups表1 各組血清TNF-α和IL-6水平（ng/L，±s）

Tab.1 The serum levels of TNF-α and IL-6 in the three groups表1 各組血清TNF-α和IL-6水平（ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組迷走神經(jīng)刺激組F n3 3 3 TNF-α 77.24±0.80 111.03±0.67a 90.11±0.76b 1 587.493＊＊IL-6 160.11±1.80 314.86±2.39a 233.72±2.46b 3 590.572＊＊

2.5 篩選后c-kit+細胞純度分析及α7nAChR在細胞中的表達 免疫熒光染色顯示，篩選后的血管壁外膜細胞大多數(shù)均表達c-kit（圖3A），c-kit+細胞占比達89%，α7nAChR在c-kit+細胞胞質(zhì)內(nèi)表達（圖3B）。

2.6 各組c-kit+細胞遷移能力變化 Transwell 實驗表明，對照組、1×10-8mol/L Ach 組、1×10-5mol/L Ach組和1×10-5mol/L Ach+α7nAChR 拮抗劑組細胞遷移數(shù)目（單位：個/視野）分別為102±7、66±4、57±4 和83±8，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=28.929，P＜0.05）。與對照組比較，Ach各組c-kit+細胞遷移能力均降低，且以1×10-5mol/L Ach 抑制c-kit+細胞遷移效果最明顯，給予α7nAChR 拮抗劑處理后，細胞遷移能力較1×10-5mol/L Ach組升高，見圖4。

2.7 各組c-kit+細胞分化能力的變化 Western blot結(jié)果顯示，ACh 處理后，SM22α 的表達量高于對照組，給予α7nAChR 拮抗劑處理后，SM22α 的表達量較1×10-5mol/L ACh 組降低（F=354.144，P＜0.05），見圖5。

3 討論

PCI 是目前臨床上治療冠心病的一個重要手段［7］。然而，術(shù)后再狹窄問題嚴重影響療效［8］。自主神經(jīng)系統(tǒng)由交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)（迷走神經(jīng)）組成，兩者相互拮抗，在維持血管的結(jié)構(gòu)、功能方面發(fā)揮重要作用［9］。迷走神經(jīng)張力降低是各種心血管疾病的共同特點，電刺激迷走神經(jīng)已在心力衰竭等心血管疾病治療中發(fā)揮重要作用［10］。目前在臨床上，神經(jīng)電刺激憑借安全、經(jīng)濟、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢成為一種新的物理治療手段［11］。本研究發(fā)現(xiàn)電刺激迷走神經(jīng)可減輕血管損傷后的狹窄程度。

Fig.3 Characteristics of c-kit+cells and α7nAChR detected by immunofluorescence staining圖3 免疫熒光鑒定c-kit+細胞和α7nAChR表達特征

Fig.4 Changes of c-kit+cell migration in each groups(crystal violet staining,×100)圖4 各組c-kit+細胞遷移能力變化（結(jié)晶紫染色，×100）

Fig.5 The expression levels of SM22α detected by Western blot assay in different groups圖5 Western blot檢測各組細胞SM22α表達情況

目前研究表明，PCI 術(shù)后由于動脈損傷導(dǎo)致的平滑肌細胞增殖及新內(nèi)膜形成是血管再狹窄的重要因素之一［12-13］。已有研究發(fā)現(xiàn)，在血管壁內(nèi)（特別是外膜和中膜與外膜交界處）存在著能分化成平滑肌細胞的血管壁干細胞，這些細胞在受到損傷刺激時可向內(nèi)皮下層遷移、增殖，并合成大量細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致新內(nèi)膜形成［14-16］。c-kit+細胞是一種重要的血管壁干細胞，在血管受到損傷刺激時，可向內(nèi)皮下層遷移，參與新生內(nèi)膜形成［17-18］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)刺激組的新生內(nèi)膜中c-kit+細胞數(shù)量較模型組減少，表明電刺激迷走神經(jīng)抑制c-kit+細胞向新生內(nèi)膜遷移，進而減輕新生內(nèi)膜厚度。體外分離純化的原代c-kit+細胞，給予迷走神經(jīng)遞質(zhì)Ach處理后，細胞遷移能力下降，這一結(jié)論與體內(nèi)動物實驗吻合。大量研究表明，Ach 可作用于α7nAChR 受體依賴的信號途徑激活抗炎系統(tǒng)［19-21］。為進一步研究Ach 抑制c-kit+細胞遷移的機制，本研究利用α7nAChR 拮抗劑探討Ach 對ckit+細胞遷移的影響是否也與α7nAChR 有關(guān)。首先證實c-kit+細胞能夠表達α7nAChR，并發(fā)現(xiàn)Ach+α 7nAChR 拮抗劑組的c-kit+細胞遷移數(shù)較Ach 組增多，表明Ach 可作用于α7nAChR 受體抑制c-kit+細胞的遷移。本研究中的迷走神經(jīng)刺激組血清中炎性因子TNF-α和IL-6的表達明顯低于模型組，進一步證實電刺激迷走神經(jīng)促進Ach 釋放，而Ach 可進一步與α7nAChR 結(jié)合，從而達到激活抗炎系統(tǒng)［22］，抑制血管損傷后新生內(nèi)膜形成。

有研究表明，小鼠股動脈損傷后，血管壁外膜處的Sca-1+干細胞從外膜遷移至內(nèi)膜，參與血管重塑，并在到達內(nèi)膜前發(fā)生向平滑肌細胞的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象［14］。本研究體外觀察Ach 對c-kit+細胞向平滑肌細胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)Ach促進c-kit+細胞向平滑肌細胞分化，同時給予α7nAChR 拮抗劑能抑制c-kit+細胞向平滑肌細胞的分化。這一結(jié)果表明，Ach 是通過與α7nAChR結(jié)合而促進c-kit+細胞向平滑肌細胞分化的。結(jié)合Ach 能夠直接抑制c-kit+細胞遷移的作用，筆者推測，電刺激迷走神經(jīng)使得c-kit+細胞遷移至新內(nèi)膜的數(shù)量減少可能與Ach促進血管壁ckit+細胞在到達新生內(nèi)膜之前已分化為收縮型平滑肌細胞有關(guān)。

綜上所述，電刺激迷走神經(jīng)可通過抑制c-kit+細胞向血管損傷新生內(nèi)膜遷移而減輕PCI術(shù)后內(nèi)膜增生的不良癥狀。其作用機制與Ach 結(jié)合α7nAChR激活抗炎系統(tǒng)、促進其向平滑肌細胞分化有關(guān)。但本研究的局限在于體內(nèi)動物實驗中僅觀察了動脈損傷時c-kit+細胞在血管壁的分布，未對外膜c-kit+細胞向新內(nèi)膜遷移給予示蹤標記，也未對體內(nèi)給予Ach 與電刺激迷走神經(jīng)效果的比較；且機制方面僅檢測了α7nAChR 這一種Ach 的受體，未檢測Ach 的另外一種受體（M 型受體）是否也參與其中。此外，今后仍需進一步對血管損傷后電刺激迷走神經(jīng)對c-kit+細胞遷移和分化的信號通路的研究，為電刺激迷走神經(jīng)應(yīng)用于PCI 術(shù)后再狹窄提供新的理論基礎(chǔ)。