張秉華，杜亞俊，衷紅梅，牛龍青，趙蒲中

（陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065）

伊曲康唑為三唑類抗真菌藥物，主要通過干擾真菌細胞膜麥角固醇的生物合成來抑制真菌增殖、促進真菌死亡，具有抗菌譜廣、毒性低的特點，臨床適用于淺表真菌感染和深部真菌引起的系統(tǒng)感染，及其他抗真菌藥物不適用或無效的系統(tǒng)性感染［1?4］。伊曲康唑膠囊為我院2021年國家評價性抽驗品種，抽驗執(zhí)行2015年版《中國藥典（第一增補本）》［5］和2020 年版《中國藥典（二部）》［6］中有關(guān)物質(zhì)檢查方法。在實際檢驗中發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)適用性溶液制備困難，難以達到系統(tǒng)適用性要求；部分樣品相鄰雜質(zhì)峰分離效果欠佳，影響結(jié)果。查閱文獻［7］發(fā)現(xiàn)，藥典中有關(guān)物質(zhì)檢測方法為2010 年前起草，雜質(zhì)E峰的相對保留時間可能存在偏差，企業(yè)反映該相對保留時間的雜質(zhì)峰無法通過強制降解試驗得到，造成在未達到系統(tǒng)適用性要求的情況下開展檢驗。此外，隨著伊曲康唑生產(chǎn)工藝的變化和對其雜質(zhì)譜研究的深入，藥典中相關(guān)物質(zhì)檢測方法僅對單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量進行控制，難以真實反映各企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量。本研究中采用高效液相色譜法對現(xiàn)行有關(guān)物質(zhì)檢測方法進行改進，以期建立靈敏度高、分離效果好、檢測效率高、對環(huán)境友好的測定方法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、Shimadzu LC ?2030 3D 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；XPE205 型、ME204 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli ?Q 高純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

伊曲康唑?qū)φ掌罚ㄅ?00631 ?201402，含量99.2%）、雜質(zhì)A 對照品（批號130686 ?201501，含量99.5%）、雜質(zhì)B 對照品（批號130687 ?201501，含量97.5%）、雜質(zhì)C 對照品（批號130688 ?201501，含量96.3%）、雜質(zhì)D 對照品（批號130689 ?201501，含量95.1%）、雜質(zhì)E 對照品（批號130690 ?201501，含量97.1%）、雜質(zhì)F 對照品（批號130691 ?201501，含量98.0%）、雜質(zhì)G 對照品（批號130692 ?201501，含量95.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；伊曲康唑雜質(zhì)H 對 照 品（企 業(yè)D，批 號WVLA_0062_003_1，含 量97.2%）。伊曲康唑膠囊為2021年國家評價性抽驗樣品，此次抽樣涉及A，B，C，D 4個生產(chǎn)企業(yè)，各3批。原輔料為生產(chǎn)企業(yè)A，B，C提供；四氫呋喃、甲醇、乙腈均為色譜純，四丁基硫酸氫銨、乙酸銨均為分析純，水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Proshell 120 EC ?C18柱（150 mm ×4.6 mm，2.7 μm）；流動相：0.01 mol/L乙酸銨溶液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min 時62%A，3～6 min 時62%A→45%A，6～11 min 時45%A；11～19 min 時45%A→34%A，19～36 min 時34%A；36～38 min 時34%A→62%A，38～40 min時62%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

稀釋劑：稀釋劑Ⅰ為甲醇?乙腈（3∶1，V/V）；精密量取稀釋劑Ⅰ700 mL，加0.01 mol / L 乙酸銨溶液300 mL，混勻，即得稀釋劑Ⅱ。

對照品溶液：取雜質(zhì)B 對照品0.012 79 g、雜質(zhì)F 對照品0.0129 2 g、雜質(zhì)G 對照品0.011 98 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ70 mL 使溶解，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，即得雜質(zhì)B，F(xiàn)，G 的混合對照品溶液。取雜質(zhì)H對照品0.004 30 g，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ14 mL 使溶解，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，即得雜質(zhì)H 對照品溶液。分別取雜質(zhì)A 對照品、雜質(zhì)B對照品、雜質(zhì)C 對照品、雜質(zhì)D 對照品、雜質(zhì)E 對照品、雜質(zhì)F對照品、雜質(zhì)G對照品、雜質(zhì)H對照品約12 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ70 mL使溶解，再加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻；精密量取1 mL，加入伊曲康唑?qū)φ掌?0 mg，置100 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ70 mL使溶解，再加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，制成每1 mL中含各雜質(zhì)1.2 μg和含伊曲康唑0.4 mg的混合對照品溶液。

供試品溶液：取伊曲康唑膠囊內(nèi)容物適量（約相當于伊曲康唑100 mg），精密稱定，置250 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ175 mL 使溶解，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ17.5 mL，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻；精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，加稀釋劑Ⅰ14 mL，加稀釋劑Ⅱ定容，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：按輔料用量最多的生產(chǎn)企業(yè)的處方工藝及比例制備缺伊曲康唑的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2項下混合對照品溶液和陰性對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖?？梢?，雜質(zhì)C與雜質(zhì)D為異構(gòu)體，保留時間相同，其余各峰之間分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：分別取伊曲康唑、雜質(zhì)B 對照品、雜質(zhì)C 對照品、雜質(zhì)D 對照品、雜質(zhì)F 對照品、雜質(zhì)G 對照品、雜質(zhì)H 對照品適量，精密稱定，加入70%體積的稀釋劑Ⅰ使溶解，再加入稀釋劑Ⅱ定容，倍比稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.3，0.6，1.2，1.8，2.4 μg/mL 的系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，以斜率計算相對校正因子。結(jié)果見表1。

1.雜質(zhì)H 2.雜質(zhì)A 3.雜質(zhì)B 4.雜質(zhì)C（或雜質(zhì)D） 5.雜質(zhì)E 6.伊曲康唑 7.雜質(zhì)F 8.雜質(zhì)GA.混合對照品溶液 B.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Impurity H 2.Impurity A 3.Impurity B 4.Impurity C/D 5.Impurity E 6.Itraconazole 7.Impurity F 8.Impurity GA.Mixed reference solution B.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=5）Tab.1 Results of the linear relation test（n=5）

定量限與檢測限考察：取線性關(guān)系考察項下的系列混合對照品溶液，倍比稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比為3∶1 和10∶1 時的質(zhì)量濃度分別作為檢測限和定量限。結(jié)果伊曲康唑、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H 的檢測限分別為0.38，0.37，0.35，0.37，0.38，0.57，1.25 ng，定量限分別為1.27，1.25，1.16，1.23，1.27，1.37，3.76 ng。

重復性試驗：取企業(yè)D 同一批樣品適量，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。由于樣品中單個雜質(zhì)含量較低（均小于0.05%），6 份樣品中單個雜質(zhì)含量測定結(jié)果的RSD均小于3.85%，雜質(zhì)總量的RSD為0，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：參考歐洲藥典和美國藥典相關(guān)標準及文獻［8］，以0.3%為各雜質(zhì)限度，制備樣品中檢出率較高的雜質(zhì)B、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H 的回收率溶液。稱取各雜質(zhì)含量已知的同一批樣品適量（約相當于伊曲康唑100 mg），精密稱定，置250 mL容量瓶中，分別加入雜質(zhì)B，F(xiàn)，G 的混合對照品溶液和雜質(zhì)H 對照品溶液適量，制成雜質(zhì)含量分別為0.12%，0.3%，0.5%的溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率［9］。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品檢測

取4個企業(yè)的12批樣品適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別加入對照溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并采用主成分自身對照法計算雜質(zhì)B，C，D，F(xiàn) 和其他單個雜質(zhì)含量，雜質(zhì)G 和雜質(zhì)H含量按加校正因子的主成分自身對照法計算，含量低于0.05%的雜質(zhì)忽略不計。結(jié)果見表3。

表3 伊曲康唑膠囊有關(guān)雜質(zhì)檢測結(jié)果（%）Tab.4 Results of content determination of related substance in Itraconazole Capsules（%）

2.5 不同測定方法結(jié)果比較

采用藥典［5?6］中有關(guān)物質(zhì)檢查方法，對4 個企業(yè)同批號的12 批樣品進行含量測定，并與本研究中新建方法結(jié)果進行比較。結(jié)果表明，2 種方法檢測的企業(yè)B，C，D 樣品含量的結(jié)果基本一致，采用新建方法測得企業(yè)A 3 批樣品的雜質(zhì)總量（0.31%，0.43%，0.21%）高于藥典中的方法（0.25%，0.28%，0.15%）。比較企業(yè)A 同批號樣品色譜圖（圖2）發(fā)現(xiàn)，新建方法的雜質(zhì)檢出個數(shù)更多。

1.雜質(zhì)B 2.質(zhì)雜C和D 3.雜質(zhì)F與未知雜質(zhì) 4.未知雜質(zhì)5.雜質(zhì)H 6.雜質(zhì)GA.現(xiàn)行標準方法（主藥質(zhì)量濃度2 mg/mL） B.新建方法（主藥質(zhì)量濃度0.4 mg/mL）圖2 不同方法測定同批號伊曲康唑膠囊有關(guān)物質(zhì)色譜圖1.Impurity B 2.Impurity C/D 3.Impurity F and unknown impurity 4.Unknown impurity 5.Impurity H 6.Impurity GA.Current standard method（the mass concentration of main drug is 2 mg/mL） B.New method（the mass concentration of main drug is 0.4 mg/mL）Fig.2 Chromatograms of related substances in Itraconazole Capsules with same batch number determined by different methods

3 討論

3.1 檢測波長選擇

預試驗中對混合對照品溶液和供試品溶液進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑、雜質(zhì)A～G 在（260 ± 2）nm波長處、雜質(zhì)H 在（248 ± 2）nm 波長處有最大吸收峰，為保證多數(shù)雜質(zhì)的檢出靈敏度，選擇260 nm 作為檢測波長。

3.2 耐用性考察

取混合對照品溶液和供試品溶液，通過更換不同型號高效液相色譜儀（Agilent 1260 型、島津LC2030C 3D 型），不同色譜柱［Aglient Proshell 120 EC ?C18柱（150 mm × 4.6 mm，2.7 μm）、Welch Boltimate EXT ?C18柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）］，以及改變柱溫（±3 ℃），各雜質(zhì)均可有效分離，表明方法耐用性良好。

3.3 出峰情況

藥典中有關(guān)物質(zhì)檢測采用甲酸破壞法制備系統(tǒng)適用性溶液，檢驗中發(fā)現(xiàn)主峰前后的雜質(zhì)峰難以強制降解得到，生產(chǎn)企業(yè)均反映受此問題困擾。本研究中嘗試多種方法制備系統(tǒng)適用性溶液效果均不佳，建議采用雜質(zhì)C（或雜質(zhì)D）、雜質(zhì)E、伊曲康唑、雜質(zhì)F 制備系統(tǒng)適用性溶液，雜質(zhì)C（或雜質(zhì)D）峰與雜質(zhì)E峰、伊曲康唑峰與雜質(zhì)F峰分離度應符合要求。

綜上所述，本研究前期對4 個生產(chǎn)企業(yè)131 批樣品的雜質(zhì)進行含量測定，結(jié)果雜質(zhì)B、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H 的檢出率較高，故本研究中主要對這4 種雜質(zhì)的含量測定進行方法學考察。結(jié)果顯示，所建有關(guān)物質(zhì)檢測方法靈敏度高、分離效果好，運行時間短，流速低，有機溶劑用量少，對環(huán)境更友好，可滿足4 個生產(chǎn)企業(yè)的伊曲康唑膠囊產(chǎn)品質(zhì)量控制要求。