李 容 楊淑婷 潘 潔 劉春花 陸 苑 王永林 孫 佳*

1.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004

葒草為蓼科植物葒草PolygonumorientaleL. 的干燥果穗及帶葉莖枝，收載于2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，具有活血、消積、止痛的功效,用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痢疾、瘡腫等，貴州省民間常用于治療胸痛、胸悶、中風(fēng)偏癱(嘴角歪斜)等疾病[1-3]。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道[4-9]表明黃酮類、木質(zhì)素類、甾體皂苷類、二苯乙烯類等為葒草藥材中的主要化學(xué)成分，其具有抗急性心肌缺血、擴(kuò)張血管、抗菌、抗血栓、抗腫瘤等多種藥理活性，課題組在藥理篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葒草水溶性部位具有較好的抗心肌缺血和抗缺氧作用，其中含量較高的黃酮類和酚酸類為葒草抗心肌缺血作用的主要活性成分[10]。因此，有必要對(duì)葒草中化學(xué)成分進(jìn)行深入研究。近年來，葒草的研究工作主要集中在化學(xué)成分的分離鑒定、含量測(cè)定及藥理作用等方面，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行葒草化學(xué)成分鑒別的報(bào)道較少，其中黃勇等[11]采用高效液相色譜-低分辨質(zhì)譜的方法鑒別得到了葒草中的 12個(gè)成分。

超高壓液相色譜-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-ESI-Q-TOF-MS)技術(shù)，用于化學(xué)成分快速分析鑒定，具有快速高效、質(zhì)量范圍寬、離子傳輸效率高、分辨率高及靈敏度高等特點(diǎn)，目前已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于天然產(chǎn)物及復(fù)方多成分的結(jié)構(gòu)鑒定[12-14]。本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)，以葒草為研究對(duì)象，對(duì)葒草提取物的化學(xué)成分進(jìn)行研究，通過結(jié)合對(duì)照品、查閱相關(guān)文獻(xiàn)及相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對(duì)葒草提取物中化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)準(zhǔn)分子離子以及二級(jí)碎片離子，總結(jié)其質(zhì)譜裂解規(guī)律，為葒草的化學(xué)成分快速鑒定和下一步研究開發(fā)控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ESI-Q-TOF-MS(布魯克道爾頓電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，包括Metabolite ToolsTM、MDF技術(shù)等)；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統(tǒng)(配有1290 Infinity二元泵，高性能自動(dòng)進(jìn)樣器，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，柱溫箱)；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥 葒草素、異葒草素、牡荊素對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)分別為：wkq16041301、wpk16080404、wkq16031003)。乙腈(德國(guó)Merck 公司，色譜純)；甲酸(美國(guó)TEDIA有限公司，色譜純)；純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；其他試劑均為分析純。

葒草藥材購(gòu)買自貴州省六盤水、貴州省盤州市、貴州省貴陽(yáng)市藥用植物園種植基地，由貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為蓼科植物葒草(PolygonumorientaleL.)的干燥全草。標(biāo)本存于貴州省中藥民族藥研究開發(fā)中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備 稱取葒草藥材1.2 g，加入70%乙醇50 mL加熱回流提取4 h，過濾，合并濾液，15000 r/min 離心5 min 取上清液，即得供試品。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別精密稱取葒草素、異葒草素、牧荊素各20 mg，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度處，搖勻。配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至濃度為0.5 mg/mL濃度，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫：45 ℃，流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)。梯度洗脫(0～5 min，95%～95% A；5～15 min，95%～85% A；15～25 min，85%～75% A；25～30 min，75%～95% A，30～32 min，95%～95% A，32～34 min，95%～5% A)，流速：0.25 mL/min，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，掃描方式為正、負(fù)離子掃描(ESI+、ESI-，m/z 50～1000)，毛細(xì)管電壓(正離子模式4 kV, 負(fù)離子模式3.5 kV)，錐孔電壓：80 V，離子源溫度：110 ℃，霧化氣：N2，壓力：1.3 bar，流速：6.0 L /min，溫度180 ℃，脫溶劑氣溫度：300 ℃，氣體體積流量：50 L/h，脫溶劑氣體積流量：550 L/h，準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用甲酸鈉校正標(biāo)準(zhǔn)液，校正模式選用：Enhanced Quadratic，數(shù)據(jù)分析：Data Analysis軟件、Metabolite ToolsTM (包括Metabolite Predict及Metabolite Detect)軟件、質(zhì)量虧損過濾(MDF)。

3 結(jié)果

利用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS對(duì)其中化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)分析，(+)ESI-MS的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)如圖1所示。由圖1可以看出葒草樣品在正模式下共同的39個(gè)色譜峰，分離較好。通過Data Analysis軟件得到70%甲醇提取的葒草中各化學(xué)成分的保留時(shí)間及其質(zhì)譜信息，結(jié)合基峰圖與對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)所報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行了推測(cè)確認(rèn)，初步從葒草提取物中鑒定了21個(gè)化學(xué)成分，其中異葒草素、葒草素、牡荊素與對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)，木犀草素、蘆丁、異鼠李素等與相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)確認(rèn)，相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。

圖1 葒草ESI+模式TIC圖

表1 葒草中化學(xué)成分分析

續(xù)表1 表1 葒草中化學(xué)成分分析

3.1 葒草化學(xué)成分的鑒定 化合物4：在tR3.6 min時(shí)，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 449.0935，保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子與對(duì)照品一致(圖2)，二級(jí)圖譜碎片離子為m/z 395.0707、353.0654、329.0675、299.0464、182.1656、102.6239，分別對(duì)應(yīng)[M+H-3H2O]+、[M+H-CH8O2]+、[M + H-120]+為[M+H]+失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)為120的中性粒子，產(chǎn)生的一個(gè)在葡萄糖基上2位和 O 位斷裂所得到的碎片離子、[M+H-150]+為[M+H]+失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)為150的中性粒子，產(chǎn)生一個(gè)在葡萄糖基上1位和 O 位斷裂所得到的碎片離子，工作站推測(cè)其分子式為C21H20O11(err 6.6 ppm)，因此根據(jù)保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子確定為異葒草素。

圖2 異葒草素的質(zhì)譜圖

化合物5：在tR4.0 min時(shí)，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 449.1254，保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子與對(duì)照品一致(圖3)，二級(jí)圖譜碎片離子為m/z 413.0957、383.0682、329.0606、299.0578、259.0608、211.3284、142.7938、73.6635,分別對(duì)應(yīng)[M+H-H2O]+、[M+H-CH6O2]+、[M+H-120]+為[M+H]+失去1個(gè)120為質(zhì)量數(shù)的中性粒子，產(chǎn)生的1個(gè)在葡萄糖基上2位和 O 位斷裂所得到的碎片離子、[M + H-150]+為[M+H]+失去1個(gè)質(zhì)量數(shù)為150的中性粒子，產(chǎn)生1個(gè)在葡萄糖基上1位和 O 位斷裂所得到的碎片離子，工作站推測(cè)其分子式為C21H20O11(err 8.3 ppm)，因此根據(jù)保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子確定為葒草素。

圖3 葒草素的質(zhì)譜圖譜

化合物8：在tR 5.5 min時(shí)，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 433.1131，保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子與對(duì)照品一致(圖4)，二級(jí)圖譜碎片離子為m/z 397.0932、337.0842、313.0719、283.0644、235.0394、76.0835,分別對(duì)應(yīng)[M+H-2H2O]+、[M+H-C2H4O2]+、[M+H-120]+為[M+H]+失去1個(gè)質(zhì)量數(shù)為120的中性粒子，產(chǎn)生的1個(gè)在葡萄糖基上2位和 O 位斷裂所得到的碎片離子、[M+H-150]+為[M+H]+失去1個(gè)質(zhì)量數(shù)為150的中性粒子，產(chǎn)生1個(gè)在葡萄糖基上1位和 O 位斷裂所得到的碎片離子，工作站推測(cè)其分子式為C21H20O10(err 5.3 ppm)，因此根據(jù)保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子確定為牡荊素。

圖4 牡荊素的質(zhì)譜圖譜

化合物12：在tR8.9 min時(shí)，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 449.1838，二級(jí)圖譜碎片離子為m/z 382.9297、287.0717、212.1996、156.4139，工作站推測(cè)其分子式為C21H20O11(err 10.2 ppm)，根據(jù)二級(jí)碎片287.0717、212.1996、156.4139，推測(cè)為山柰素母核，而且碎片287.0717、156.4139的強(qiáng)度明顯高于其他碎片離子，可以推測(cè)糖連接在3位上(圖5)，結(jié)合參考文獻(xiàn)[19],推測(cè)此化合物為山柰素-葡萄糖苷。

圖5 山柰素-葡萄糖苷的質(zhì)譜圖譜和裂解規(guī)律

化合物13：在tR9.1 min時(shí)，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 449.1045，二級(jí)圖譜碎片離子為m/z 303.04473、249.0269、179.3563、153.2378、140.2155、119.7527、78.6479，工作站推測(cè)其分子式為C21H20O11(err 7.5 ppm)，根據(jù)二級(jí)碎片303.04473、249.0269、179.3563、153.2378，推測(cè)為槲皮素母核，而且碎片303.0447、179.3563、153.2378的強(qiáng)度明顯高于其他碎片離子，可以推測(cè)糖連接在3位上(圖6)，結(jié)合參考文獻(xiàn)[16],推測(cè)此化合物為槲皮苷。

圖6 槲皮素的質(zhì)譜圖譜和裂解規(guī)律

化合物20：在tR19.7 min時(shí)，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 287.0476，二級(jí)圖譜碎片離子為m/z 243.1033、177.0675、153.1243，工作站推測(cè)其分子式為C15H11O6(err 2.8 ppm)，二級(jí)碎片m/z 243.1033、177.0675、153.1243，分別對(duì)應(yīng)[M + H-CO2]+、[M + H-C5H2O3]+、[M+H-C8H6O2]+(圖7)，結(jié)合參考文獻(xiàn)[21],推測(cè)此化合物為木犀草素。

圖7 木犀草素的裂解規(guī)律圖

化合物24：在tR21.8 min時(shí)，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 611.1770，二級(jí)圖譜碎片離子為m/z 465.1110、303.0145、257.4031、229.1231、153.1529，工作站推測(cè)其分子式為C27H30O16(err -2.4 ppm)，二級(jí)碎片m/z 465.1110、303.0145、257.4031、229.1231、153.152943，分別對(duì)應(yīng)[M+H-C6H6O5]+、[M+H-C12H4O10]+、[M+H-C13H6O12]+、[M+H-C14H6O13]+、[M+H-C20H22O13]+，結(jié)合參考文獻(xiàn)[8],推測(cè)此化合物為蘆丁。

化合物31：在tR25.2 min時(shí)，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 317.0647，二級(jí)圖譜碎片離子為m/z302.2121、273.1976、，工作站推測(cè)其分子式為C16H12O7(err 2.7 ppm)，二級(jí)碎片m/z 302.2121、273.1976，分別對(duì)應(yīng)[M + H-CH3]+、[M + H-CH3O]+，結(jié)合參考文獻(xiàn)[13]，推測(cè)此化合物為異鼠李素。

4 討論

葒草70% 乙醇提取物中大部分化合物采用本實(shí)驗(yàn)建立的UHPLC方法能得到較好的分離，流動(dòng)相中加入0.1%的甲酸有利于改善峰型。本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-ESI-Q-TOF-MS方法從葒草提取物中分析得到了39個(gè)化學(xué)成分，運(yùn)用Data Analysis分析軟件，采用高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量和同位素峰型匹配來初步確定化合物的分子式，通過與對(duì)照品比對(duì)，確定其中3個(gè)化學(xué)成分，同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)信息，推測(cè)了19個(gè)化學(xué)成分。另外，因?yàn)樘崛∥镏写嬖谥罅拷Y(jié)構(gòu)類似的同分異構(gòu)體，不但分子式一樣，并且有相似的裂解方式，例如異葒草素和葒草素，區(qū)分它們需要用對(duì)照品進(jìn)一步確認(rèn)，本實(shí)驗(yàn)也用相應(yīng)的對(duì)照品對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)然，葒草提取物中還存在很多其他的化合物，而且大多數(shù)是屬于同一類化合物，彼此的區(qū)別不明顯，且二級(jí)碎片離子的信息相似，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

木犀草素及其黃酮苷廣泛存在于抗炎植物原料中，具有廣泛生理活性[22]。Cottiglia等[23]發(fā)現(xiàn)從亞麻葉瑞香中提取的異葒草素，可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌等的生長(zhǎng)。鄭必勝等[24]研究表明從忍冬葉片中提取的木犀草素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。胡琪琪等[25]發(fā)現(xiàn)葒草醋酸乙酯提取物中含量較高的異葒草素、葒草素、牡荊素等黃酮類化合物分是其抗腫瘤的主要活性成分。實(shí)驗(yàn)采用的UHPLC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)能快速分析中藥提取物中的化學(xué)成分，為民族藥葒草成分的全面定性分析提供了一種高效、快速的分析方法，并為微量成分的快速分析提供了一種科學(xué)有效的分析方法。