袁 諾，張 清，張小飛，彭義交，郭 宏，趙金紅

（北京食品科學(xué)研究院，北京 100068）

鹵蛋是以新鮮雞蛋為原料，經(jīng)水煮、去殼、調(diào)味鹵制、腌制等工序制作而成的休閑蛋制品，因其口感彈韌、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、食用方便而深受消費者喜愛。為了延長商品的貨架期，食品生產(chǎn)企業(yè)通常采用真空包裝和熱殺菌抑制商品中微生物的生長繁殖，從而延緩腐敗時間。雖然低溫等離子、超高壓、脈沖強光等新型非熱殺菌技術(shù)有良好的殺菌效果，但因為設(shè)備和技術(shù)等原因，熱殺菌技術(shù)仍然是目前最普遍采用的殺菌方式。常用的熱殺菌方式根據(jù)溫度可分為90 ℃以下的低溫殺菌、90～110 ℃的中溫殺菌和110 ℃以上的高溫殺菌。低溫殺菌如巴氏殺菌可較好地保留原料的營養(yǎng)成分和風(fēng)味，但出品后需全程冷藏且保質(zhì)期較短，常用于乳制品和啤酒等快銷品行業(yè)。當(dāng)前市場中大部分肉、蛋制品均使用121 ℃進行殺菌，高溫殺菌產(chǎn)品中的微生物基本被全部殺滅，具有很長的貯藏期。但殺菌過程中110 ℃以上的高溫會對產(chǎn)品的營養(yǎng)、風(fēng)味及口感造成較大損失或劣變。隨著社會發(fā)展、生活質(zhì)量的提升，消費者對食物品質(zhì)和營養(yǎng)水平的要求日益增高，在一些產(chǎn)品的加工中，中溫殺菌技術(shù)受到科研人員及市場的關(guān)注，成為殺菌應(yīng)用的新趨勢。經(jīng)中溫殺菌的產(chǎn)品雖然可以有效地延長保質(zhì)期并保留營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)，但無法完全滅殺細(xì)菌芽孢等小部分極耐熱微生物。目前，鮮有關(guān)于中溫和高溫殺菌鹵蛋貯藏期內(nèi)微生物和脂肪酸組成變化的比較研究。因此，本實驗利用95、105 ℃和121 ℃不同殺菌溫度對真空包裝鹵蛋進行殺菌，并將樣品分別于4 ℃和25 ℃進行貯藏，測定并分析各樣品在貯藏期間內(nèi)菌落總數(shù)和脂肪酸組成的變化，以期為鹵蛋生產(chǎn)加工中殺菌和貯藏溫度的選擇提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)后一周以內(nèi)的新鮮海蘭褐殼雞蛋（產(chǎn)蛋雞35 周齡）由北京二商金健力有限公司提供。

食鹽、醬油、香料（包括八角、白芷、小茴香、桂皮、橘皮、山柰、草果、砂仁、甘草、白胡椒、花椒、高良姜、姜、月桂葉、丁香）均為市售。

氫氧化鈉、氯化鈉、正己烷、硫酸氫鈉、氫氧化鉀、無水硫酸鈉、三氯甲烷（均為分析純） 北京化工廠；三氟化硼乙醚絡(luò)合物、無水甲醇（分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；正己烷（色譜純） 天津福晨化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2020氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；殺菌釜 諸城中泰機械有限公司；Hei-VAP Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；DZ400/2D真空包裝機 浙江葆春包裝機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鹵蛋制備

鹵蛋制備參照袁諾等的方法稍作修改。1）預(yù)煮：將雞蛋放入98 ℃水浴鍋中煮制30 min后，取出冷激并去殼備用；2）鹵湯熬制：按水的質(zhì)量添加鹵料1.2%、食鹽1.2%、白砂糖2%、生抽醬油2%，使用電磁爐1 200 W熬制1 h；3）鹵制：剝殼后的雞蛋，以料液比為1∶3（/）加入鹵湯，95 ℃水浴鹵制2 h；4）裝袋：將鹵蛋裝入復(fù)合薄膜蒸煮袋，用抽真空設(shè)備封口包裝；5）殺菌：將真空包裝后的鹵蛋樣品進行殺菌，根據(jù)前期實驗基礎(chǔ)，本研究選擇的熱殺菌條件為：95 ℃殺菌45 min、105 ℃殺菌45 min、121 ℃ 殺菌45 min。

根據(jù)不同的殺菌溫度和貯藏溫度將樣品分為5 組進行貯藏實驗。第一組為95 ℃殺菌、25 ℃貯藏（95/25組）；第二組為95 ℃殺菌、4 ℃貯藏（95/4組）；第三組為105 ℃殺菌、25 ℃貯藏（105/25組）；第四組為105 ℃殺菌、4 ℃貯藏（105/4組）；第五組為121 ℃殺菌、25 ℃貯藏（121/25組）。

每貯藏15 d取樣品進行菌落總數(shù)和脂肪酸組成指標(biāo)檢測，貯藏實驗周期為90 d。根據(jù)GB 2749—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 蛋與蛋制品》的規(guī)定，再制蛋檢出菌落總數(shù)應(yīng)小于10CFU/g，當(dāng)樣品菌落總數(shù)超過限定值時停止對超標(biāo)樣品的后續(xù)檢測。

1.3.2 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》進行測定。

1.3.3 脂肪酸組成的測定

蛋黃油脂的提取：取樣品5個，剝?nèi)サ鞍?，搗碎蛋黃并準(zhǔn)確稱取30 g，放入具塞錐形瓶中，加入180 mL氯仿-甲醇混合液（2∶1，/）混勻，將錐形瓶放入超聲波儀中以功率350 W超聲提取30 min。過濾后加入20 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.88% NaCl溶液促進溶液分層，劇烈振蕩混勻后轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，保留下層。下層溶液3 000×離心10 min，抽去上清液，保留下層澄清橙黃色溶液。對下層溶液進行75 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h后，75 ℃水浴氮吹至恒質(zhì)量得蛋黃脂質(zhì)。提取的油脂放入棕色瓶中，0 ℃下冷藏備用。

鹵蛋蛋黃油脂的皂化和甲酯化參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》中的外標(biāo)法。

脂肪酸檢測的氣相色譜分析條件為：SH-Rt-2560毛細(xì)管色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；氦氣為載氣；流速1.0 mL/min；分流比15∶1；進樣口溫度240 ℃；升溫程序：柱溫起始溫度130 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至190 ℃，保持5 min，再以1 ℃/min升至210 ℃，保持5 min，再以4 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。定量方法采用外標(biāo)法，以色譜峰面積計算提取的油脂中各種脂肪酸的含量（g/100 g）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，每個指標(biāo)實驗做3 次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Duncan’s法進行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組別鹵蛋貯藏期間內(nèi)微生物生長情況

剛產(chǎn)出的雞蛋無菌或僅帶少量的細(xì)菌，但在雞蛋貯藏、運輸以及生產(chǎn)加工等環(huán)節(jié)中，環(huán)境中和生產(chǎn)設(shè)備上的微生物會污染原料和中間品。這些初始污染微生物中的一種或幾種主導(dǎo)了食品的腐敗變質(zhì)，稱為特定腐敗菌。各組別樣品貯藏期內(nèi)的菌落總數(shù)變化情況如表1所示，3種溫度在殺菌完成時都可以殺死樣品中的活體微生物。隨著貯藏時間的延長，第一組鹵蛋（95/25組）在貯存15 d時開始檢測到微生物，并于30 d時包裝內(nèi)出現(xiàn)渾濁湯液，鹵蛋表面軟爛且有酸臭味，嚴(yán)重腐敗。同樣25 ℃下貯藏的第三組（105/25組），在第75天檢測出了微生物數(shù)增長，在之后的15 d微生物以低于第一組的繁殖速度致使樣品輕度腐敗，較95 ℃殺菌25 ℃貯藏的樣品延長貯藏期60 d。第五組121 ℃殺菌的樣品（121/25組）在25 ℃下貯藏90 d未發(fā)現(xiàn)微生物增殖。說明提高殺菌溫度可有效熱損傷和滅殺芽孢體，使活體芽孢數(shù)量減少，受損芽孢需要長時間調(diào)整和修復(fù)，致使芽孢桿菌的增殖起始時間后延并降低其增殖速度，在常溫貯存下，當(dāng)微生物修復(fù)并適應(yīng)環(huán)境后，會快速增殖。由于10 ℃以下不適于芽孢桿菌等微生物的增長繁殖，所以在4 ℃貯藏的樣品其微生物起始增殖時間和增殖速度都會比常溫貯藏下延長和增加。第二組（95/4組）在75 d時微生物開始增殖，但第90天微生物并未超標(biāo)；而第四組（105/4組）在90 d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)微生物增殖，說明低溫貯藏對微生物增殖有明顯的抑制作用。對鹵蛋狀態(tài)和培養(yǎng)基中的微生物菌落形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)腐敗菌中沒有霉菌，皆為細(xì)菌屬。這表明殺菌和真空包裝造成的低氧環(huán)境可有效遏制霉菌的生長繁殖。賀燕等對市售雞蛋干進行了腐敗微生物鑒定，確認(rèn)地衣芽孢桿菌（）和芽孢桿菌LAMI 002（sp. LAMI 002）為腐敗細(xì)菌。宋思家等發(fā)現(xiàn)雞蛋干的核心致腐微生物為芽孢桿菌屬，乳桿菌屬和狹義梭菌屬會加速雞蛋干的腐敗變質(zhì)。弓敏等從雞蛋殼表面分離純化得到5種典型菌株，確定腐敗能力最強的為蠟樣芽孢桿菌屬A、C，其次為大腸桿菌E、枯草芽孢桿菌B及考克氏菌D。

表1 不同組別鹵蛋貯藏期內(nèi)的菌落總數(shù)Table 1 Total bacterial count in marinated eggs from different groups during storage

2.2 貯藏期內(nèi)各組鹵蛋脂質(zhì)脂肪酸組成的變化

2.2.1 貯藏期內(nèi)各組鹵蛋飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸總含量的變化

雞蛋黃中富含脂肪、磷脂等營養(yǎng)成分，脂質(zhì)的脂肪酸組成和含量是評價鹵蛋營養(yǎng)價值、風(fēng)味以及氧化穩(wěn)定性等鹵蛋品質(zhì)的重要特征指標(biāo)。貯藏期間內(nèi)，各組鹵蛋飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）總含量變化分別如圖1、2所示。在初始?xì)⒕瓿蓵r，隨著殺菌溫度的升高，樣品中的SFA和MUFA總含量總體呈增加趨勢。這是由于高溫使多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）氧化分解為MUFA和SFA，當(dāng)溫度升高時，PUFA氧化速率也隨之增高。MUFA在高溫下也會發(fā)生氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為SFA，使得其含量增加，但因MUFA自身只有一個雙鍵相對較為穩(wěn)定，其自身發(fā)生氧化降解的速率比PUFA要低很多，因此MUFA含量還是呈增加趨勢。SFA因為不含不飽和鍵而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易反生氧化分解，當(dāng)溫度高于150 ℃時，才會發(fā)生熱分解反應(yīng)或在霉菌等微生物的影響下發(fā)生酮型酸敗。25 ℃貯存條件下，95/25組的SFA和MUFA總含量在第15天便明顯減少，與菌落總數(shù)開始增加的時間一致；在貯存至第15天和嚴(yán)重腐敗的第30天時，SFA總含量由殺菌完成時的20.357 g/100 g分別降至18.999 g/100 g和18.107 g/100 g，分別降低了6.67%和11.06%；MUFA總含量由31.282 g/100 g分別降至29.987 g/100 g和27.546 g/100 g，分別降低了4.14%和11.94%。相同貯存條件下，105/25組在第45天SFA總含量明顯減少，在第75天由20.797 g/100 g下降至19.590 g/100 g，降低了5.80%；MUFA總含量在第60天出現(xiàn)明顯變化，第75天由31.450 g/100 g降至29.422 g/100 g，降低了5.57%。121/25組SFA總含量在貯藏前60 d無明顯變化，在第75天時略有下降，第90天時由21.145 g/100 g下降至20.748 g/100 g，降低了1.88%；121/25組MUFA總含量在第60天出現(xiàn)下降，第90天時，由31.858 g/100 g降至30.919 g/100 g，降低了2.95%。95/4組樣品SFA和MUFA總含量也出現(xiàn)了下降趨勢。在第90天時，SFA總含量由20.357 g/100 g降至18.144 g/100 g，降低了10.87%；MUFA總含量由31.282 g/100 g降至27.423 g/100 g，降低了12.34%。而105/4組樣品中的SFA和MUFA的總含量并無明顯的變化趨勢。

圖1 貯藏期內(nèi)各組鹵蛋SFA總含量的變化Fig. 1 Variation in total saturated fatty acid (SFA) content in marinated eggs from each group during storage

圖2 貯藏期內(nèi)各組鹵蛋MUFA總含量的變化Fig. 2 Variation in total monounsaturated fatty acids (MUFA) content in marinated eggs from each group during storage

分析實驗數(shù)據(jù)變化趨勢可以得出，同組別SFA和MUFA總含量隨貯存時間變化的趨勢和減少量基本一致，且與樣品的菌落總數(shù)變化趨勢高度相關(guān)，而各組別間含量變化有明顯差異。目前，國內(nèi)外在污水處理方面關(guān)于油脂降解菌株篩選鑒定的大量文獻報道表明，自然環(huán)境中的細(xì)菌、霉菌及酵母菌具有油脂降解能力。而細(xì)菌中的葡萄球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬等因油脂降解能力出色而作為油脂分解菌被培養(yǎng)。王幫香等從松樹油脂中分離得到一種野生油脂分解菌，并鑒定為蠟樣芽孢桿菌。雞蛋黃中的脂質(zhì)可作為微生物生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)，且其中富含的鐵、鎂等可促進菌體分泌脂肪酶，致使樣品中SFA和MUFA總含量降低。而不同殺菌和貯藏方式會使樣品中微生物種類及增殖速度存在差異，進而導(dǎo)致各組別間明顯的含量差異及不同的變化趨勢。95 ℃殺菌的樣品中，SFA和MUFA含量降低速度快，105、121 ℃殺菌25 ℃貯藏可延緩二者含量降低速度，105 ℃殺菌4 ℃貯藏可較好地保留樣品中的SFA和MUFA。

2.2.2 各組鹵蛋貯藏期間SFA和MUFA組成的變化

貯藏期間內(nèi)，各組別的SFA和MUFA組成的變化分別如表2、3所示。各組別SFA中的C和C含量總體顯著降低。在25 ℃下貯藏的樣品C含量總體也呈降低趨勢。MUFA中，各組別的C含量均減少，95/25、95/4及105/25 3 組的C含量總體顯著降低，而另外兩組只有微小變化；105/25組和121/25組的C含量顯著降低。這可能是由于大部分微生物在生長繁殖過程中更多分解利用SFA，而殺菌條件導(dǎo)致了樣品中有特殊微生物生長增長，造成了MUFA組分的差異變化。根據(jù)脂肪酸組成變化情況可以推測，95/25、95/4和105/25組樣品中生長繁殖的微生物種類和數(shù)量要多于105/4組與121/25組。

表2 各組鹵蛋貯藏期間SFA組成的變化Table 2 Changes in SFA composition of marinated eggs from each group during storage

表3 各組鹵蛋貯藏期間MUFA組成的變化Table 3 Changes in MUFA composition of marinated eggs from each group during storage

2.2.3 各組鹵蛋貯藏期間PUFA總含量及其組成的變化

各組別的PUFA總含量及其組成的變化分別如圖3和表4所示。當(dāng)殺菌完成時，隨著殺菌溫度逐漸升高，PUFA總含量呈降低趨勢。相較于95 ℃殺菌的PUFA總含量，經(jīng)105 ℃和121 ℃殺菌其含量分別下降了1.56%和6.83%。這是由于加溫加壓可以促使蛋黃中的甘油三酯和磷脂水解，釋放出游離脂肪酸，而游離脂肪酸中的PUFA在高溫環(huán)境下極不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化分解反應(yīng)。在氧化分解的過程中，PUFA雙鍵相鄰的亞基碳原子上C—H σ鍵發(fā)生均裂，生成活性氫原子和游離基，游離基會與氧氣反應(yīng)生成過氧化物游離基，然后此過氧化物游離基又和一分子脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，生成過氧化物和新的游離基。過氧化物極不穩(wěn)定，易分解為短鏈的醛、酮。溫度越高，則產(chǎn)生游離基的速度越快，游離基所誘發(fā)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)則越多，受到自由基攻擊的PUFA也就越多。整個貯藏期間，PFUA總含量變化最小的為105/4組，降低了12.06%，其次為121/25組（12.61%）、95/25組（14.95%）、95/4組（16.65%）和105/25組（19.05%）。

圖3 貯藏期內(nèi)各組別PUFA總含量的變化Fig. 3 Variation in total PUFA content in marinated eggs from each group during storage

由表4可以看出，貯藏期間各組主要減少的脂肪酸為C、C和C，而C（二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA））含量在4 ℃貯存的兩組中無顯著變化。薄膜真空包裝可有效阻隔氧氣滲入，降低PUFA的氧化速度。李趙敏等發(fā)現(xiàn)酥油真空包裝6個月后其MUFA和PUFA各組分含量及總含量總體無顯著變化。105/4組和121/25組受到微生物生長繁殖的影響較小，造成其PUFA變化的主要影響因素是殺菌過程中高溫導(dǎo)致的自由基數(shù)量增加造成的鏈?zhǔn)窖趸纸夥磻?yīng)。而121/25組殺菌溫度和貯存溫度比105/4組更高，所以其PUFA含量減少量也更多。前3 組（95/25組、95/4組、105/25組）的PUFA含量既受到微生物生長繁殖的影響，也受到貯藏時間、貯藏溫度和自由基引發(fā)的自發(fā)氧化影響，所以這3 組PUFA總含量減少得也更多。因此，PUFA含量和組成變化的差異是殺菌條件、貯藏條件、貯藏時間、微生物生長以及自發(fā)氧化等多方面因素影響的結(jié)果。

表4 各組別貯藏期間PUFA組分的變化Table 4 Changes in PUFA composition of marinated eggs from each group during storage

2.2.4 各組鹵蛋貯藏期間脂肪酸總含量的變化

從圖4可以看出，在最初殺菌完成時，各組別脂質(zhì)總脂肪酸含量基本相同。而隨著貯藏時間的延長，各組別均出現(xiàn)了總脂肪酸含量不同程度地減少，各組別總脂肪酸含量的變化與樣品菌落總數(shù)的變化呈較強的相關(guān)性，但不完全一致。這可能是因為由于環(huán)境中大多數(shù)微生物處于“存活但不能培養(yǎng)”或難培養(yǎng)的狀態(tài)。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)基檢測菌落總數(shù)作為分析微生物種群的手段，無法全面地檢測出樣品中微生物的存活情況，若要更清晰地分析樣品中微生物種類，需要進一步采用高通量等技術(shù)進行鑒定，但現(xiàn)有數(shù)據(jù)也具有較強的參考價值。95/25組的樣品，貯存30 d時脂肪酸總含量大幅下降（降低12.25%）并嚴(yán)重腐敗，而121/25組在60 d貯藏期內(nèi)脂肪酸總含量僅下降4.35%，95/4組和105/25組樣品的總脂肪酸含量在貯存期間內(nèi)持續(xù)下降。105/4組樣品在第45天時脂肪酸總含量（64.310 g/100 g）超過了121/25組的樣品（63.893 g/100 g），且較好地保持了PUFA水平，從脂肪酸含量變化規(guī)律推測，其保質(zhì)期將長于121/25組的樣品。

圖4 貯藏期內(nèi)各組鹵蛋脂肪酸總含量的變化Fig. 4 Changes in the total amount of fatty acids in marinated eggs from each group during storage

3 結(jié) 論

本實驗研究了不同殺菌溫度和貯藏溫度的鹵蛋在貯藏過程中蛋黃脂質(zhì)脂肪酸含量和組成的變化。研究結(jié)果表明，與95、105 ℃殺菌相比，121 ℃殺菌會大幅降低鹵蛋初始的PUFA水平；95 ℃殺菌的鹵蛋雖然初始PUFA總含量最高，但隨著貯藏時間的延長，其中微生物快速生長繁殖，致使脂肪酸總含量快速降低，在常溫30 d的期間降低了12.25%，并腐敗變質(zhì)，不適用于企業(yè)的生產(chǎn)銷售。市面常用的121 ℃殺菌鹵蛋常溫貯藏60 d期間微生物繁殖速度慢，脂肪酸總含量下降幅度小（4.35%）。中溫105 ℃殺菌的鹵蛋初始PUFA總含量介于95 ℃和105 ℃鹵蛋之間，為12.423 g/100 g，在25 ℃貯藏條件下具有75 d的保質(zhì)期，可應(yīng)用于開發(fā)短保質(zhì)期的高營養(yǎng)產(chǎn)品。若使用4 ℃貯藏，中溫105 ℃殺菌鹵蛋不僅PUFA的總含量高于121 ℃殺菌的鹵蛋，在貯藏45 d后總脂肪酸含量（64.310 g/100 g）高于121 ℃殺菌鹵蛋（63.893 g/100 g）。根據(jù)脂肪酸與微生物菌落總數(shù)的變化規(guī)律可以推測，105 ℃殺菌4 ℃貯存鹵蛋的保質(zhì)期最長。因此，105 ℃中溫殺菌結(jié)合4 ℃貯藏可作為生產(chǎn)高營養(yǎng)水平和長保質(zhì)期鹵蛋的一項較好的應(yīng)用技術(shù)。