曹魯娜，畢言鋒，王靜，鄭兆顯

菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，菏澤 274032

西瓜霜潤(rùn)喉片為《中國藥典》2020 年版一部收載的中成藥，屬獨(dú)家生產(chǎn)品種，由西瓜霜、冰片、薄荷素油、薄荷腦4 種原料藥制成，具有清音利咽、消腫止痛的功效，用于防治咽喉腫痛、聲音嘶啞等病癥，療效顯著［1-2］，臨床應(yīng)用廣泛［3-5］。鄒節(jié)明等［6］研究發(fā)現(xiàn)，西瓜霜潤(rùn)喉片具有抑菌作用。為確保微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，使其可客觀反映樣品被微生物污染的真實(shí)水平，需在進(jìn)行微生物限度檢查前通過查閱文獻(xiàn)、分析組方藥味的抑菌活性等對(duì)樣品特性進(jìn)行初步研判并進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，對(duì)有抑菌活性的樣品，應(yīng)選擇適宜的方法去除其活性后再進(jìn)行檢查。

本研究首先通過平皿法篩選出敏感菌株，而后參考相關(guān)文獻(xiàn)［7-9］，結(jié)合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)企業(yè)提供的資料，采用3 批樣品進(jìn)行3 次獨(dú)立平行試驗(yàn)的方法，建立了基于中和法的西瓜霜潤(rùn)喉片微生物限度檢查方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；JE1201 型電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；BPH-9272 型精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；MLS-3781L-PC 型高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社）。

1.2 試藥

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)201225）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號(hào)201214）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號(hào)201214）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，批號(hào)201112）、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（EE，批號(hào)191231）、pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)210310）均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；聚山梨酯80（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；培養(yǎng)基經(jīng)過適用性檢查，均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。西瓜霜潤(rùn)喉片（桂林三金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)210307、210308、210617）。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］及乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇復(fù)壯傳代并鑒定合格，本次試驗(yàn)所用菌株均為第4 代。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 平皿傾注法

取西瓜霜潤(rùn)喉片10g，加入TSB 至100ml，用勻漿儀混勻，制成1∶10 的供試品溶液。取1∶10的供試液適量，加入TSB 依法制成1∶50、1∶100的不同濃度供試品溶液［10］。

2.1.2 中和法

取西瓜霜潤(rùn)喉片10g，加入含10%聚山梨酯80 的TSB 至100ml，用勻漿儀混勻，制成1∶10的供試品溶液。

2.2 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于TSB 中，33℃培養(yǎng)24h；白色念珠菌接種于SDB 中，23℃培養(yǎng)3 天；黑曲霉接種于SDA中，23℃培養(yǎng)7 天，制成新鮮培養(yǎng)物。取上述新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫、稀釋，分別制備成菌落數(shù)為1000～10 000cfu/ml 的菌懸液或孢子懸液，用于微生物計(jì)數(shù)。將銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌分別接種于TSB 中，33℃培養(yǎng)24h，制成新鮮培養(yǎng)物。取上述新鮮培養(yǎng)物用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫、稀釋，制備成菌落數(shù)為10～100cfu/ml 的菌懸液，用于控制菌檢查。

2.3 計(jì)算方法與結(jié)果判斷

需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的回收比值依據(jù)公式計(jì)算：回收比值=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)（公式1）。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)采用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，各試驗(yàn)菌回收比值應(yīng)在0.5～2 范圍內(nèi)；控制菌檢查適用性試驗(yàn)陽性對(duì)照組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組應(yīng)無菌落生長(zhǎng)。

2.4 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.4.1 平皿傾注法（1∶10）

試驗(yàn)組：取“2.1.1”項(xiàng)下1∶10 供試液9.9ml共5 份，分別加入“2.2”項(xiàng)下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉5 種試驗(yàn)菌液各0.1ml，使每1ml 供試液中含菌量不大于100cfu，混勻，取1ml 注入平皿，平行制備2 個(gè)平皿。

供試品對(duì)照組：取“2.1.1”項(xiàng)下1∶10 供試液9.9ml，以TSB 代替試驗(yàn)菌液，其余操作同試驗(yàn)組。

菌液對(duì)照組：取TSB 9.9ml 共5 份，分別加入“2.2”項(xiàng)下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉5 種試驗(yàn)菌液各0.1ml 進(jìn)行菌種回收試驗(yàn)。

按照《中國藥典》2020 年版四部［1］要求，在各組平皿中加入15～20ml 相對(duì)應(yīng)的SDA（用于霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)）或TSA（用于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)），測(cè)定各平皿菌落數(shù)，計(jì)算3 次獨(dú)立試驗(yàn)的平均回收比值，結(jié)果詳見表1。

由表1 數(shù)據(jù)可知，采用平皿傾注法（1∶10）進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)，金黃色葡萄球菌回收比值低于0.5，枯草芽孢桿菌回收比值為0，表明西瓜霜潤(rùn)喉片對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌活性，且對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性更強(qiáng)，提示可將二者作為敏感菌株進(jìn)一步開展試驗(yàn)。霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的試驗(yàn)菌株回收比值均在0.5～2，表明該方法可行。

表1 平皿傾注法（1∶10）微生物計(jì)數(shù)適用性試驗(yàn)各試驗(yàn)菌株回收比值

2.4.2 增加稀釋液體積

選取敏感菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，采用平皿傾注法（1∶50，1∶100），選用1 批樣品進(jìn)行試驗(yàn)。取“2.1.1”項(xiàng)下1∶50、1∶100 供試液，試驗(yàn)菌液選取“2.2”項(xiàng)下用于微生物計(jì)數(shù)的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，其余操作按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌的回收比值分別為0.35、0.56，枯草芽孢桿菌的回收比值分別為0.14、0.21。表明西瓜霜潤(rùn)喉片對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性很強(qiáng)，不宜繼續(xù)采用增加稀釋倍數(shù)的方法去除。

2.4.3 需氧菌總數(shù)測(cè)定

取“2.1.2”項(xiàng)下1∶10 供試液9.9ml 5 份，分別加入“2.2”項(xiàng)下用于微生物計(jì)數(shù)的5 種試驗(yàn)菌液各0.1ml，以含10%聚山梨酯80 的TSB 為稀釋劑（代替TSB），其余操作按“2.4.1”項(xiàng)下步驟制備試驗(yàn)組、供試品對(duì)照組和菌液對(duì)照組。另取含10%聚山梨酯80 的TSB 9.9ml 作為中和劑對(duì)照組，共2 份，操作同“2.4.1”項(xiàng)下試驗(yàn)組操作步驟，進(jìn)行中和劑的菌種回收試驗(yàn)。按照《中國藥典》2020 年版四部［1］要求，在各組平皿中加入15～20ml TSA，測(cè)定各平皿菌落數(shù)，計(jì)算3 次獨(dú)立試驗(yàn)的平均回收比值，結(jié)果詳見表2。

由表2 可知，中和劑對(duì)照組菌株回收比值均符合標(biāo)準(zhǔn)，表明含10%聚山梨酯80 的TSB 對(duì)試驗(yàn)菌株無抑菌性且無損傷［11］。西瓜霜潤(rùn)喉片采用中和法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)時(shí)，試驗(yàn)菌株的回收比值均在0.5～2 范圍內(nèi)，表明該方法能有效去除西瓜霜潤(rùn)喉片的抑菌活性，可用于其微生物限度檢查。

表2 中和法需氧菌總數(shù)適用性試驗(yàn)各試驗(yàn)菌株回收比值

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

按照《中國藥典》2020 年版四部［1］要求，西瓜霜潤(rùn)喉片的控制菌檢查應(yīng)為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌5 種。

陽性對(duì)照組：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌3 種控制菌檢查取“2.1.1”項(xiàng)下1∶10 供試液10ml；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查取相當(dāng)于0.1g、0.01g 和0.001g 的預(yù)培養(yǎng)物（“2.1.1”項(xiàng)下1∶10 供試液23℃培養(yǎng)2h）；沙門菌檢查取西瓜霜潤(rùn)喉片10g。上述供試液及供試品分別加入“2.2”項(xiàng)下用于控制菌檢查的對(duì)應(yīng)菌液，接種至對(duì)應(yīng)的規(guī)定培養(yǎng)基，混勻，33℃培養(yǎng)24h。

試驗(yàn)組：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌3 種控制菌檢查取“2.1.1”項(xiàng)下1∶10供試液10ml；耐膽鹽革蘭陰性菌檢查取1ml 預(yù)培養(yǎng)物；沙門菌檢查取西瓜霜潤(rùn)喉片10g，均不加試驗(yàn)菌液，其余操作同陽性對(duì)照組。

陰性對(duì)照組：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌5 種控制菌檢查均以TSB 代替供試液，其余操作同試驗(yàn)組。

按照《中國藥典》2020 年版四部［1］規(guī)定將各組進(jìn)一步選擇和分離培養(yǎng)。結(jié)果表明，按照常規(guī)培養(yǎng)基體積檢查時(shí)，陰性對(duì)照組均無菌落生長(zhǎng)，陽性對(duì)照組除沙門菌外，大腸埃希菌等4 個(gè)陽性對(duì)照組均檢出試驗(yàn)菌，提示西瓜霜潤(rùn)喉片對(duì)沙門菌有抑菌活性，將稀釋液增加至200ml 時(shí)，陽性對(duì)照組菌落生長(zhǎng)良好，表明稀釋法可以消除樣品對(duì)沙門菌的抑菌活性。結(jié)果詳見表3。

表3 控制菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 樣品抑菌活性的去除方法

方法適用性試驗(yàn)是微生物限度檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠的基礎(chǔ)保證，其本質(zhì)是建立對(duì)樣品影響小且操作效率高的方法［12］。去除樣品抑菌性是其中的重點(diǎn)和難點(diǎn)［13］，應(yīng)遵循由簡(jiǎn)到繁、由單一到聯(lián)合的原則。在非無菌制劑的微生物限度檢查中，平皿傾注法因操作簡(jiǎn)捷、結(jié)果準(zhǔn)確而最為常用，但西瓜霜潤(rùn)喉片的抑菌作用較強(qiáng)，采用稀釋倍數(shù)1∶100 時(shí)枯草芽孢桿菌的回收比值仍小于0.5。常用的薄膜過濾法首先要求樣品可通過微孔濾膜，本研究在制備1∶10供試液時(shí)發(fā)現(xiàn)不溶性顆粒較多，不宜選用。適宜的中和劑能有效降低樣品抑菌活性，而且操作效率高，聚山梨酯80 是一種非離子表面活性劑，可增加藥品溶解，且對(duì)微生物有一定的保護(hù)作用［14-16］，因此本研究使用聚山梨酯 80 作為中和劑。在選擇去除樣品抑菌活性的方法時(shí)，建議根據(jù)樣品特性對(duì)擬采用方法進(jìn)行評(píng)估，不要盲目按照藥典收錄的方法逐一嘗試，避免大量的重復(fù)性工作。

3.2 敏感菌株的確定

在檢驗(yàn)工作以及查閱文獻(xiàn)資料［17-20］過程中發(fā)現(xiàn)，有抑菌活性的中藥制劑在需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)中大多對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑菌作用?；诖?，本研究選取金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌開展敏感菌株預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。建議相關(guān)實(shí)驗(yàn)室通過實(shí)踐工作或查閱資料后，選用1～2 種敏感菌株開展預(yù)試驗(yàn)進(jìn)行方法篩選，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步規(guī)范開展方法適用性試驗(yàn)，減少菌種使用量和檢驗(yàn)工作量，降低試驗(yàn)過程中引入微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高檢驗(yàn)準(zhǔn)確性。

3.3 統(tǒng)一管理藥品方法適用性試驗(yàn)資料

現(xiàn)階段藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)獲取方法適用性資料的主要方式是和生產(chǎn)企業(yè)溝通，其人力和時(shí)間成本較高。建議由省級(jí)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)牽頭，利用信息化建設(shè)平臺(tái)，將本轄區(qū)內(nèi)所生產(chǎn)的藥品方法適用性試驗(yàn)資料統(tǒng)一網(wǎng)絡(luò)化管理，并將可公開的項(xiàng)目?jī)?nèi)容采取適宜的方式發(fā)布。

4 小結(jié)

本研究建立了西瓜霜潤(rùn)喉片的微生物限度檢查方法：需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用中和法；霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用平皿傾注法（1∶10）；大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌檢查采用常規(guī)培養(yǎng)基體積；沙門菌采用培養(yǎng)基稀釋法。該方法結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可用于西瓜霜潤(rùn)喉片的微生物限度檢查。