胥玉行，李英，謝云鵬，王途，崔海鵬，趙娟*

1.承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以動脈內(nèi)形成粥樣斑塊為主要病變的慢性炎性疾病，對人的身體健康造成極大威脅[1～3]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和P38 絲裂原蛋白激酶（P38 mitogenactivated protein kinase，P38）是 MAPK（mitogenactivated protein kinase）家族控制炎性反應(yīng)的重要成員，可介導(dǎo)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[4～6]。尾加壓素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）及其受體G 蛋白耦連受體14（G protein-coupled receptors 14，GPR14）構(gòu)成的UⅡ/UT 系統(tǒng)與AS 等疾病有顯著的關(guān)聯(lián)性[7,8]。Urantide 正是基于UⅡ衍生而來，目前被認(rèn)為最有效的UⅡ受體特異性拮抗劑[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Urantide 可通過拮抗UⅡ/UT 相互作用和調(diào)控MAPK 信號通路減輕動脈粥樣硬化性心肌損傷，并通過抑制ERK1/2、P38 MAPK 信號通路激活而改善AS 病變程度[5,6,10]。脾具有調(diào)節(jié)血脂代謝、免疫調(diào)控、造血等多種生理功能[11]。研究顯示AS 模型（ApoE-/-）小鼠出現(xiàn)脾腫大，血清IgG、ANA 和抗dsDNA 抗體滴度顯著升高，提示ApoE-/-小鼠免疫功能異?？赡軐ψ陨砼K器造成損傷[12]，脾病變與AS 的發(fā)展有一定聯(lián)系。近年來相關(guān)研究表明，通過調(diào)節(jié)脾細(xì)胞和分子成分來限制單核細(xì)胞依賴的致病活性的新方法或許成為將來防治心血管病的一個可行方向[13,14]。然而，Urantide 是否對AS大鼠的脾具有作用尚未闡述。本實(shí)驗(yàn)以AS 大鼠為研究對象，觀察其脾組織的形態(tài)學(xué)變化及ERK1/2、P38 MAPK 信號通路相應(yīng)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討Urantide 與AS 之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及高脂飼料配制 SPF 級雄性Wistar大鼠180 只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK (京)-2016-0011），體質(zhì)量180～200 g；高脂飼料配制：0.2%丙硫氧嘧啶，0.5%膽酸鈉，3.5%膽固醇，5%白糖，10%豬油，80.8%基礎(chǔ)飼料。

1.1.2 主要試劑 Urantide（蘇州強(qiáng)耀生物公司）；辛伐他汀（simvastatin）（北京諾華制藥有限公司）；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶公司）、RIPA 裂解液、兔抗大鼠ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38（Cell Signaling Technology）；GAPDH 一抗、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（Bioworlde）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；FITC 熒光二抗、DAPI 染液（北京天根生化科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠分組及處理 隨機(jī)分為正常組（n=30）和模型組。實(shí)驗(yàn)開始時，模型組給予每只大鼠腹腔注射維生素D3 150 U/kg 連續(xù)3 d，并飼以高脂飼料，于第4周，隨機(jī)選取6 只進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，驗(yàn)證造模成功后，Urantide（3、7、14 d）組（每組30 只）每日尾靜脈注射Urantide 30 μg/kg；陽性藥辛伐他汀組（n=30）每日給予辛伐他汀5 μg/kg 灌胃，連續(xù)14 d。

1.2.2 胸主動脈、脾形態(tài)學(xué)觀察 用4%多聚甲醛對大鼠胸主動脈、脾組織固定后經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后制作石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察各組大鼠的病理變化。

1.2.3 免疫熒光染色法測定脾組織中p-ERK1/2、p-P38 表達(dá) 取制備好的石蠟切片，由二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，抗原修復(fù)，10%山羊血清封閉，兔抗大鼠一抗p-ERK1/2（1：200）、p-P38（1：1600）孵育過夜；洗片，在暗室環(huán)境下，滴加FITC 標(biāo)記二抗（1：1000），孵育1 h，移去二抗，滴加DAPI 染液，孵育45 min，洗片，防熒光淬滅劑封片后在熒光顯微鏡下觀察。每組選6 張切片，每張片選取6 個不同視野拍照。Image-Pro Plus 6.0 軟件計算免疫熒光陽性細(xì)胞的平均吸光強(qiáng)度值，隨后作統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4 Western blot 檢測脾ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38 蛋白 組織樣本的總蛋白由RIPA 裂解液提取，使用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測。取45 μg 蛋白于SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)膜，封閉，GAPDH（1：5000）、ERK1/2（1：1000）、p-ERK1/2（1：2000）、P38（1：1000）、p-P38（1：1000）兔抗大鼠一抗孵育過夜，洗膜，滴加HRP 標(biāo)記抗兔二抗（1：5000），孵育l h，洗膜，超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。運(yùn)用Image J 吸光度值分析軟件，測定各目的蛋白條帶灰度值并計算蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 21.0 軟件分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間參數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胸主動脈形態(tài)學(xué)改變

正常組血管內(nèi)皮邊緣整齊，中膜見梭形平滑肌細(xì)胞排列均勻整齊，彈力纖維層結(jié)構(gòu)完整，膜邊界清楚。模型組胸主動脈內(nèi)皮損傷，中膜內(nèi)平滑肌細(xì)胞排列紊亂，有結(jié)晶，鈣化形成，為典型AS 病理形態(tài)改變，證實(shí)AS 大鼠模型造模成功。經(jīng)Urantide 治療的大鼠與模型組大鼠相比，隨用藥時間增加，胸主動脈粥樣斑塊逐漸減小(圖1)。

圖1 大鼠胸主動脈形態(tài)（HE 染色） A：正常組B：模型組C：Urantide 組Fig.1 Morphological changes of thoracic aorta in each group (HE staining) A: Control group；B:AS group；C: Urantide group

2.2 大鼠脾組織形態(tài)學(xué)變化

正常組大鼠脾內(nèi)紅髓、白髓清晰可見，無脂肪變性及細(xì)胞壞死，脾細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，紅髓內(nèi)可見呈索條狀分布的脾索，其間有脾血竇。模型組大鼠脾內(nèi)有細(xì)胞壞死及變形，界限不清，脾索分布不均，脾中央動脈有明顯玻璃樣變性。經(jīng)Urantide 治療的大鼠與模型組大鼠相比，隨用藥時間增加，脾病變逐漸減輕，用藥14 d 的大鼠脾動脈形態(tài)接近于陽性藥組(圖2)。

圖2 大鼠脾形態(tài)（HE 染色）A：正常組B：模型組C：陽性藥物組D：Urantide 3 d 組E：Urantide 7 d 組F：Urantide 14 d 組Fig.2 Morphological changes of spleen of rats in each group (HE staining)A: Control group; B:AS model group; C: Simvastatin group; D: Urantide 3 days group; E: Urantide 7 days group; F: Urantide 14 days group

2.3 大鼠脾免疫熒光p-ERK1/2、p-P38 表達(dá)

p-ERK1/2、p-P38 顆粒主要存在于脾血管周圍，模型組內(nèi)陽性顆粒表達(dá)水平較正常組均明顯升高（P＜0.05）。由Urantide 治療后，脾p-ERK1/2、p-P38 陽性顆粒表達(dá)較模型組明顯下降（P＜0.05），Urantide 14 d組效果最明顯(圖3,4)。

圖3 大鼠脾組織內(nèi)p-ERK 表達(dá)水平（標(biāo)尺=50 μm)A1～F1：脾內(nèi) p-ERK 表達(dá)水平A2～F2：細(xì)胞核DAPI染色 A3～F 3：脾 內(nèi)p-ERK 與DAPI 共定位A：正常組B：模型組 C：陽性藥物組D：Urantide 3 d 組E：Urantide 7 d 組F：Urantide 14 d 組Fig. 3 The expression levels of p-ERK in rat spleen of each group (bar=50μm)A1～F1: p-ERK protein expression level in the spleen;A2～F2: Nuclear DAPI staining; A 3～F3:Colocalization of p-ERK protein and DAPI in the spleen.A: Control group;B: AS group; C:Simvastatin group;D: Urantide 3 days group; E: Urantide 7 days group; F:Urantide 14 days group

圖4 大鼠脾組織內(nèi)p-P38 表達(dá)水平（標(biāo)尺=50 μm)A1～F1：脾內(nèi)p-P38表達(dá)水平A2～F2：細(xì)胞核DAPI 染色A3～F3：脾內(nèi)p-P38與DAPI 共定位A：正常組B：模型組 C：陽性藥物組D：Urantide 3 d 組E：Urantide 7 d 組F：Urantide 14 d 組Fig.4 The expression levels of p-P38 in rat spleen of each group (bar=50 μm)A1～F1: p-P38 protein expression level in the spleen;A2～F2: Nuclear DAPI staining; A 3～F3:Colocalization of p-P38 protein and DAPI in the spleen.A: Control group;B: AS group; C:Simvastatin group;D: Urantide 3 days group; E: Urantide 7 days group; F:Urantide 14 days group

2.4 Western blot 檢測

同正常組比，模型組脾內(nèi)p-ERK1/2、p-P38 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比，辛伐他汀組中p-ERK1/2 蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下降（P＜0.05），p-P38 蛋白質(zhì)表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比，Urantide 各組中p-ERK1/2、p-P38 蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），ERK1/2、P38 蛋白質(zhì)表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）（圖5）。

圖5 大鼠脾內(nèi)蛋白表達(dá)水平*P＜0.05，與AS 組比較Fig.5 The protein expression levels in spleen of rats in each group *P＜0.05,compared with AS group

3 討論

AS 是一種由多種病理變化影響的復(fù)雜動脈疾病，其中血管壁的慢性炎性反應(yīng)有著至關(guān)重要的作用[15,16]。而血管內(nèi)局部炎癥反應(yīng)、泡沫細(xì)胞的形成、免疫應(yīng)答等多種反應(yīng)過程與單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)密切相關(guān)。單核巨噬細(xì)胞主要存儲于脾，是粥樣斑塊形成的主要細(xì)胞[17]。

在高膽固醇條件刺激下，脾能促使造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞（HSPCs）分化成為單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等細(xì)胞，使單核細(xì)胞在炎癥中的數(shù)量顯著增加，有研究表明，主動脈中積聚的單核細(xì)胞30%左右來自脾[18,19]。此外，當(dāng)脾外髓質(zhì)裂解時亦可釋放單核細(xì)胞進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)進(jìn)入發(fā)炎的內(nèi)膜，持續(xù)的單核細(xì)胞招募促進(jìn)巨噬細(xì)胞積累、增加斑塊體積[17～20]。

ERK1/2 和P38 屬于MAPK 家族，MAPK 信號通路是由一系列的蛋白激酶及其磷酸化作用構(gòu)成的級聯(lián)反應(yīng)[3,6,10]。由于受不同細(xì)胞類型和細(xì)胞環(huán)境影響，該信號通路可產(chǎn)生促凋亡、促炎、抗增殖、參與缺血/再灌注損傷、脂質(zhì)代謝等多種生物學(xué)效應(yīng)[5,21～23]。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞長期處于氧化應(yīng)激、高血脂等因素刺激下，多種鏈激酶通過磷酸化途徑激活P38 MAPK，而ERK1/2 可由MEK1 和MEK2 介導(dǎo)其磷酸化，之后移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)并參與AS 炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[24～27]。

脾血管內(nèi)皮細(xì)胞受AS 大鼠血脂變化影響，使MAPK 信號通路被激活產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致脾腫大促使脾功能異常改變，釋放單核細(xì)胞至病變部位，進(jìn)一步加劇泡沫細(xì)胞堆積[11,12,17～20]。有研究顯示，脾切除術(shù)后的小鼠主動脈根部病變明顯更大[28]。此外，脂質(zhì)代謝受脾的影響，在動物中觀察到脾移除后血清膽固醇水平升高[11,29]。由此可知，脾功能異常能加速AS 進(jìn)展過程。

UⅡ是由11 個氨基酸殘基組成的生長抑素樣神經(jīng)環(huán)肽，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素之一，UⅡ參與肝硬化、炎癥、腎功能衰竭、生殖功能障礙等多種疾病的發(fā)展過程[30]。此外，UⅡ也被視作促進(jìn)AS 發(fā)生發(fā)展的主因之一[7,8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Urantide 治療的AS 大鼠，脾組織中ERK1/2、P38 MAPK 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)含量均下降，其中p-ERK1/2，p-P38 表達(dá)量顯著下降，AS大鼠脾中央動脈內(nèi)玻璃樣病變、胸主動脈內(nèi)粥樣斑塊均有一定程度的改善。進(jìn)一步的免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證明Urantide 可顯著降低AS 大鼠脾中p-ERK1/2、p-P38陽性顆粒表達(dá)。提示脾動脈內(nèi)玻璃樣變可能是AS 致脾損傷的主要病變之一，最終導(dǎo)致脾的結(jié)構(gòu)功能改變。脾功能恢復(fù)正常水平時，可能使單核細(xì)胞的生成減少，泡沫細(xì)胞隨單核細(xì)胞募集數(shù)量減少而減少，從而抑制粥樣斑塊進(jìn)一步的病理改變。

本課題前期大量研究發(fā)現(xiàn)，Urantide 可通過拮抗UⅡ/UT 系統(tǒng)，產(chǎn)生多種不同生物學(xué)效應(yīng)，影響AS 及相關(guān)病變進(jìn)展過程。經(jīng)Urantide 治療后，可降低P38 MAPK 信號通路中P38 基因與蛋白的表達(dá)水平，改善大鼠AS 病變程度[6,10]；通過調(diào)控ERK1/2、MAPK、JNK等信號通路的活化水平，減輕AS 大鼠肝脂肪變性[5,31]；通過下調(diào)OPN 和α-SMA 的表達(dá)，改善AS 大鼠心肌纖維化水平[32]；通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號通路，改善AS 相關(guān)腎損傷[33,34]。這些研究證明Urantide 通過拮抗UⅡ/UT 系統(tǒng)，調(diào)控不同信號通路在AS 大鼠各組織器官發(fā)揮抗AS 作用。

綜上表明，Urantide 可通過阻斷UⅡ/UT 系統(tǒng)進(jìn)而介導(dǎo)ERK1/2、P38 MAPK 信號通路，從而減輕AS 大鼠的脾動脈玻璃樣變的病變程度。然而，Urantide 阻斷發(fā)揮生物學(xué)作用的具體機(jī)制還需更深層次的探究。