丁旭，殷紫，鄧祥敏，張艷軍，宋曉莉

1.江蘇護理職業(yè)學院藥學與中藥學院，江蘇 淮安 223005；2.淮安廣濟醫(yī)藥連鎖有限公司，江蘇 淮安223001

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，對全球數(shù)百萬人造成嚴重影響[1]。隨著人口的迅速老齡化，PD 的預防和治療迫在眉睫。目前，用于治療PD 的藥物能夠改善患者癥狀，尚缺乏神經(jīng)保護作用[2]。有研究顯示，植物提取物和植物化學物質(zhì)可通過抗氧化和抗炎發(fā)揮對PD 的神經(jīng)保護作用[3]。銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）為銀杏葉提取物，是一種強效的血小板活化因子拮抗劑，具有明顯的神經(jīng)保護作用[4]。Wu 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B 與原兒茶酸聯(lián)合應用可以增強對PD 的治療效果。但GB 神經(jīng)保護作用的機制有待闡明。本研究以GB 治療PD 模型大鼠，探討GB 對PD 神經(jīng)功能的保護作用及其可能機制，旨在為PD 治療提供可靠根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器

健康SPF 級別SD 雄性大鼠，體重200～220 g，動物許可證號：SCXK（蘇）2020-0006，由本省實驗動物中心提供。將大鼠飼養(yǎng)于本院實驗室SPF 級別動物房中，溫度20～25 ℃，濕度55%～60%，12 h 光照和12 h暗處理交替，使用標準飼料和水飼養(yǎng)，自由進食和飲水。GB（南京紫曦生物制品有限公司）；美多芭（上海羅氏制藥有限公司）；6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿撲嗎啡（美國艾美捷公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）；組織裂解液（上海威奧生物科技有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、鼠單克隆抗體GAPDH（廣州泛思生物科技有限公司）；PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt 一抗（美國CST 公司）；羊抗兔二抗（北京博爾邁生物技術(shù)有限公司）；酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；化學發(fā)光檢測儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及PD 模型制備 將大鼠隨機分為6 組：Sham 組、模型組、美多芭組和GB 低、中、高劑量組，每組8 只。按照文獻[6]，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后，將其固定于立體定向儀上，取俯臥位，牙齒固定于前方，兩側(cè)耳棒插入外耳道；碘伏消毒，備皮，無菌刀切開頭部皮膚，對筋膜肌肉予以分離，精準認定前囟位置；將右側(cè)腦前內(nèi)側(cè)束為立體定向注射位點，使用微量注射器垂直進針，徐緩注射2 μL 6-OHDA（8 μg），速度為0.5 μg/min，注射完留針3 min；縫合傷口，將大鼠放回籠內(nèi)，Sham 組大鼠右側(cè)腦前內(nèi)側(cè)束立體定向注射生理鹽水（4 μL）；術(shù)后2 周腹腔注射阿撲嗎啡，誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)行為，記錄其30 min 內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，轉(zhuǎn)速＞420 r/h 即為造模成功。GB 低、中、高劑量組予以15、30、60 mg/kg 劑量GB 腹腔注射，美多芭組予以20 mg/kg 美多芭（Madopar）灌胃，Sham 組、模型組予以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1 次，共4 周。

1.2.2 行為學檢測 用阿撲嗎啡（5 mg/kg）誘導，檢測各組大鼠給予治療藥前12 h 及最后給藥12 h 在開闊、空曠的空間30 min 內(nèi)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)。

1.2.3 氧化應激指標檢測 4 周以后，采用脊髓脫臼法將大鼠處死，立即斷頭取腦，取大鼠腦組織黑質(zhì)部位，加入生理鹽水勻漿，采用試劑盒檢測MDA、SOD活性、GSH 水平，嚴格按照說明書進行實驗操作。

1.2.4 炎癥因子檢測 取樣方法同上，通過ELISA 檢測IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，步驟如下：每孔加入100 μL 待測樣品，同時加入100 μL 不同濃度的標準品；封板，4℃孵育過夜；洗滌液洗板3 次，徹底甩干；加入100 μL 二抗，封板，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗板3 次，徹底甩干；加入100 μL TMB 顯色底物，室溫避光孵育10 min；加入100 μL 終止液，于10 min 內(nèi)在450 nm 波長處讀取各孔OD 值，繪制標準曲線，并計算各樣品對應的濃度值。

1.2.5 Western blot 檢測PI3K/Akt 信號通路 4 周后，采用脊髓脫臼法將大鼠處死，立即斷頭取腦，在冰上取黑質(zhì)和紋狀體組織進行徹底勻漿，加入組織裂解緩沖液（1 μL/2 μg），并于超聲裂解儀中裂解組織，15000 r/min 離心15 min，提取組織總蛋白；采用BCA法測定組織蛋白濃度，接著進行Western blot 蛋白分析，配制分離膠和濃縮膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗PI3K（1：500）、AKT（1：500）、p-PI3K（1：500）、p-AKT（1：500）、GAPDH（1：1000），于4 ℃孵育過夜，加二抗羊抗兔IgG（1：2000）于室溫孵育2 h，進行抗體雜交，顯色，使用Image J 軟件分析所掃描的圖像，具體步驟為：將條帶轉(zhuǎn)換為灰度圖像，再將條帶區(qū)域變成亮色，背景區(qū)域變成暗色，然后沿著目標條帶的邊緣畫線，將目標條帶圈起來，操作重復3 次，取平均數(shù)，得到目標條帶的平均灰度值。

1.2.6 抑制PI3K/Akt 信號通路對大鼠氧化應激指標、炎癥因子水平的影響 加入PI3K/Akt 信號通路LY294002 抑制劑，將大鼠隨機分為5 組：Sham 組、Model 組、Ginkgolide B 60 mg/kg 組、LY294002 組、（GB 60 mg/kg+LY294002）組，每組8 只，各組大鼠檢測氧化應激指標、炎癥因子水平，方法參照1.2.3 和1.2.4。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0 軟件和GraphPad Prism 5.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）形式進行統(tǒng)計描述，多組間數(shù)據(jù)對比采用單因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)對比采用t檢驗，P＜0.05 表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學檢測

治療前，各組大鼠30 min 內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無明顯差異（P＞0.05）；治療后，GB 低劑量組與模型組行為學檢測比較無明顯差異（P＞0.05），美多芭組和GB 中、高劑量組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯少于模型組（P＜0.05）（圖1）。

圖1 銀杏內(nèi)酯B 對阿樸嗎啡誘導的帕金森模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響*P＜0.05，與模型組比較n=8Fig.1 Effects of Ginkgolide B on rotation behaviors of model rats with apomorphine-induced Parkinson’s disease*P＜0.05,compared with the model group, n=8

2.2 大鼠氧化應激指標水平

與Sham 組比較，模型組大鼠MDA 水平明顯升高（P＜0.05），SOD、GSH 水平明顯降低（P＜0.05）；GB 低劑量組與模型組比較無明顯差異（P＞0.05），美多芭組和GB 中、高劑量組大鼠MDA 水平明顯低于模型組（P＜0.05），SOD、GSH 水平明顯高于模型組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 銀杏內(nèi)酯B 對帕金森模型大鼠腦內(nèi)MDA、SOD、GSH 水平的影響*P＜0.05，與Sham 組比較 #P＜0.05，與模型組比較n=8Fig.2 Effects of Ginkgolide B on levels of MDA,SOD and GSH in the brain of rats with Parkinson's disease*P＜0.05,compared with the sham group;#P＜0.05,compared with the model group, n=8

2.3 大鼠炎癥因子水平

與Sham 組比較，模型組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；GB 低劑量組與模型組比較無明顯差異（P＞0.05），美多芭組和GB 中、高劑量組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯低于模型組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 銀杏內(nèi)酯B 對帕金森模型大鼠腦內(nèi)IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的影響*P＜0.05，與Sham 組比較 #P＜0.05，與模型組比較n=8Fig.3 Effects of Ginkgolide B on levels of IL-6,IL-1β and TNF-α in the brain of rats with Parkinson's disease*P＜0.05,compared with the sham group;#P＜0.05,compared with the model group, n=8

2.4 大鼠黑質(zhì)和紋狀體組織PI3K/Akt 信號通路

Western blot 結(jié)果顯示，各組PI3K、Akt 蛋白表達比較無明顯差異（P＞0.05），與Sham 組比較，模型組大鼠p-PI3K、p-Akt 蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，GB 低劑量組無明顯改變（P＞0.05），美多芭組和GB 中、高劑量組大鼠p-PI3K、p-Akt 蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.05）（圖4）。

圖4 銀杏內(nèi)酯B 對帕金森模型大鼠黑質(zhì)和紋狀體PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達的影響*P＜0.05，與Sham 組比較 #P＜0.05，與模型組比較n=8Fig.4 Effects of Ginkolide B on protein expressions of PI3K,Akt,p-PI3K and p-Akt in the substantia nigra and striatum of model rats with Parkinson’s disease.*P＜0.05,compared with the sham group;#P＜0.05,compared with the model group, n=8

2.5 抑制PI3K/Akt 信號通路對大鼠氧化應激指標、炎癥因子水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與GB 60 mg/kg 組比較，LY294002 組大鼠p-PI3K、p-Akt 蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05）；與 LY294002 組比較，（GB 60 mg/kg+LY294002）組大鼠p-PI3K、p-Akt 蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.05），表明抑制PI3K/Akt 信號通路可削弱GB 對大鼠p-PI3K、p-Akt 蛋白的下調(diào)能力，而加入GB 可一定程度恢復GB 對大鼠p-PI3K、p-Akt 蛋白的上調(diào)能力（圖5A 和B）。

與GB 60 mg/kg 組比較，LY294002 組大鼠MDA水平明顯升高（P＜0.05），SOD、GSH 水平明顯降低（P＜0.05）；與 LY294002 組比較，（GB 60 mg/kg+LY294002）組大鼠MDA 水平明 顯降低（P＜0.05），SOD、GSH 水平明顯升高（P＜0.05），表明抑制PI3K/Akt 信號通路可削弱GB 對大鼠MDA 水平的下降能力和對SOD、GSH 水平的升高能力，加入GB 可一定程度恢復GB 對大鼠MDA、SOD、GSH 水平的調(diào)節(jié)能力（圖5D）。

與GB 60 mg/kg 組比較，LY294002 組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯升高（P＜0.05）；與LY294002 組比較，（GB 60 mg/kg+LY294002）組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯降低（P＜0.05），表明抑制PI3K/Akt 信號通路可削弱GB 對大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的下降能力，而加入GB 可一定程度恢復GB 對大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的下降能力（圖5C）。

圖5 抑制PI3K/Akt 信號通路對帕金森病模型大鼠氧化應激指標和炎癥細胞因子的影響A、B：Western blot 檢測PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達 C：ELISA 檢測IL-6、IL-1β、TNF-α 水平 D：試劑盒檢測MDA、SOD 活性、GSH水平**P＜0.01，與Sham 組比較 ##P＜0.01，與模型組比較 #P＜0.05，與GB 60 mg/kg 組比較 &P＜0.05，與LY294002 組比較n=8Fig.5 Effects of inhibiting PI3K/Akt signaling pathway on oxidative stress indexes and inflammatory cytokines of model rats with Parkinson's diseaseA～B: Detection of protein expressions of PI3K,Akt,p-PI3K and p-Akt by Western blot; C: Detection of IL-6,IL-1β and TNF-α by ELISA; D:Detection of MDA,SOD activity and GSH level by kit；**P＜0.01,compared with the sham group;##P＜0.01,compared with the model group;#P＜0.05,compared with the GB 60 mg/kg group;&P＜0.05,compared with the LY294002 group, n=8

3 討論

PD 是由腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元遭到破壞所誘發(fā)的進行性神經(jīng)退行性疾病[7]。PD 發(fā)病機制復雜，目前認為，在PD 病理生理過程中有神經(jīng)炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)失衡、凋亡以及遺傳等多種因素共同參與。IL-6、IL-1β、TNF-α 均是促炎癥因子，一方面可激活小膠質(zhì)細胞，升高其活性，進而誘導多巴胺能神經(jīng)元細胞損傷；另一方面還可結(jié)合多巴胺能神經(jīng)元細胞相關(guān)受體，誘導其發(fā)生細胞凋亡，進而加重PD 病情[8]。氧化應激為PD 發(fā)病最重要的病理生理基礎之一，研究顯示，多巴胺能神經(jīng)元受損早期氧化應激水平明顯升高[9]。MDA、SOD、GSH 是機體最重要的抗氧化劑和氧化應激調(diào)節(jié)劑，SOD 是機體抵御活性氧的第一道防線，可作為活性氧清除劑，保護多巴胺能神經(jīng)元。文獻報道，PD 大鼠腦組織黑質(zhì)部位處于氧化應激狀態(tài)，SOD、谷胱甘肽過氧化物酶以及過氧化氫酶等抗氧化應激因子水平降低，MDA水平升高，造成抗氧化應激系統(tǒng)功能異常，進而導致多巴胺能神經(jīng)元損傷，最終損傷PD 大鼠神經(jīng)功能[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA 誘導的大鼠PD 模型中，大鼠右側(cè)腦半球氧化應激指標MDA 明顯升高，SOD、GSH明顯降低，炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯升高，提示大鼠抗氧化應激體系遭到6-OHDA 的破壞，炎癥損傷加重。予以美多芭和中、高劑量GB 干預后，大鼠行為學明顯改善，且MDA 和IL-6、IL-1β、TNF-α 水平更低，SOD、GSH 水平更高，表明中、高劑量GB 干預可激活大鼠抗氧化應激體系，減輕神經(jīng)炎癥損傷，保護多巴胺能神經(jīng)元，繼而改善大鼠行為學。提示中、高劑量GB 有可能成為PD 神經(jīng)保護作用的新靶點。張輝等[11]研究顯示，銀杏葉提取物可改善PD 大鼠氧化應激狀態(tài)，起腦保護作用。劉星亮等[12]報道，GB 對體外誘導的PD 模型細胞具有保護作用，能夠抑制細胞凋亡，提高神經(jīng)元細胞存活率，提示GB可用于治療神經(jīng)退行性疾病。本研究結(jié)果與之一致。PI3K/Akt 信號通路是細胞內(nèi)最重要的信號轉(zhuǎn)導通路之一，在細胞凋亡、生長等過程中行使重要功能。證據(jù)表明，PI3K/Akt 信號通路可調(diào)控細胞凋亡和小膠質(zhì)細胞活化，抑制神經(jīng)炎癥，防治活性氧積累，進而控制氧化應激水平，對多巴胺能神經(jīng)元起到神經(jīng)保護作用[13]。Gong 等[14]指出，SHC3 沉默可能通過下調(diào)PD大鼠PI3K-AKT-FoxO 信號通路，進而加重黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應激損傷。一項體內(nèi)和體外實驗表明，激活PI3K/Akt 信號通路可改善PD 小鼠運動障礙，抑制神經(jīng)元凋亡和炎癥反應[15]。為進一步通過體內(nèi)實驗探究GB 發(fā)揮PD 神經(jīng)功能保護作用的可能機制，本研究檢測PI3K/Akt 信號通路蛋白表達情況，結(jié)果顯示，予以GB 干預以后，GB 中、高劑量組大鼠p-PI3K、p-Akt 蛋白表達明顯上調(diào)，表明中、高劑量GB 可上調(diào)PD 大鼠黑質(zhì)和紋狀體p-PI3K、p-Akt 蛋白表達。GB治療PD 的作用機制可能是通過激活PI3K/Akt 信號通路，促進蛋白磷酸化，進而發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。LY294002 是PI3K 的特異性抑制劑，可阻斷蛋白激酶Akt 磷酸化。而本研究發(fā)現(xiàn)，采用LY294002 抑制PI3K/Akt 信號通路激活后，可阻斷GB 誘導的p-PI3K、p-Akt 蛋白上調(diào)作用，加入GB 后這種作用又可得到一定恢復。此外，LY294002 組大鼠氧化應激和炎癥損傷明顯高于GB 60 mg/kg 組，（GB 60 mg/kg+LY294002）組氧化應激和炎癥損傷明顯減輕，進一步表明GB 是通過激活PI3K/Akt 信號通路來發(fā)揮對PD大鼠神經(jīng)元的保護作用。盡管PI3K/Akt 信號通路抗PD 的具體作用機制尚不清楚，但有選擇性地激活PI3K/Akt 信號通路可能會成為延緩PD 進展的新方向，為PD 預防和治療提供全新思路。此次研究有待繼續(xù)進行體外實驗以深入研究分析。

綜上所述，高劑量GB 可改善PD 大鼠行為學，增強抗氧化應激能力，減輕炎性損傷，起到一定保護作用，其機制可能與激活PI3K/Akt 信號通路有關(guān)，可為PD 的預防和治療提供新的途徑。