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小腸缺血時間與GRP78 表達(dá)的相關(guān)性研究及意義

2022-07-30 02:16臧成昊楊金偉馬微梁宇劉礦嬪劉偉劉潔王國棟張絲嘉吳紅杰朱科威郭建輝李力燕
中國臨床解剖學(xué)雜志 2022年4期
關(guān)鍵詞:粘膜小腸程度

臧成昊,楊金偉,馬微,梁宇,劉礦嬪,劉偉,劉潔王國棟,張絲嘉,吳紅杰,朱科威,郭建輝*,李力燕*

1.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院,云南省第一人民醫(yī)院,云南 昆明 650032;2.昆明醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所,云南 昆明 650500

腸缺血再灌注損傷(intestine ischemia reperfusion injury,IIRI)是指組織、器官低灌流缺血后再獲得正常的血液供應(yīng)后,組織、器官所受到的缺血性損害非但沒有減輕或恢復(fù),反而更加嚴(yán)重。在外科手術(shù)中,由于出血、創(chuàng)傷、感染性休克、嚴(yán)重?zé)齻澳承┩饪铺幚磉^程(如小腸移植、腹主動脈手術(shù)或心臟旁路手術(shù)等)等情況都會導(dǎo)致小腸缺血再灌注損傷(IIRI)[1]。小腸的腸粘膜毛細(xì)血管比較豐富,一旦出現(xiàn)損傷,將會介導(dǎo)炎癥反應(yīng),加重腸道損傷,并且IIRI 不僅會造成小腸損傷,更會破壞小腸的黏膜屏障造成多種器官的功能失調(diào)。二胺氧化酶(diamine oxidase;DAO)活性的強(qiáng)弱是反映腸黏膜損傷的重要指標(biāo)之一,腸粘膜一旦受損就會導(dǎo)致腸道中的DAO 活性降低,而血液中的DAO 活性顯著增加[2]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種重要分子伴侶[3]。研究發(fā)現(xiàn),GRP78 可通過維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定,修復(fù)心、腦等重要器官的缺血再灌注損傷[4,5],但GRP78 與小腸缺血再灌注損傷的相關(guān)性研究較少。本文用SD 大鼠制作小腸缺血再灌注損傷模型,來探討不同小腸缺血時間下GRP78 的表達(dá)水平與小腸缺血再灌注損傷程度之間的關(guān)系及意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HE 染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司),ELISA 試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司,CRE0003),TUNEL 試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,C1098),PCR 試劑盒(TaKaRa,RR047A),GRP78抗體(GeneTEX),BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)

1.2 實驗動物分組及模型的制備

SPF 級SD 雌性大鼠84 只,體重為200~230 g,隨機(jī)分組,對照組14 只,損傷組每個時間點14 只,手術(shù)前禁食12 h,自由飲水。對照組和損傷組每個時間點取7 只SD 雌性大鼠,手術(shù)前用4%水合氯醛腹腔注射麻醉,在腹腔正中偏左開口,翻出小腸,顯露腸系膜上動脈(superior mesenteric artery,SMA)。損傷組用微創(chuàng)動脈夾夾住SMA 20、40、60、80 和100 min,然后開放SMA,于開放SMA 6h 后處死;對照組只暴露SMA,不做夾壁處理,其他處理相同。對照組和損傷組每個時間點其余7 只SD 雌性大鼠,在進(jìn)行缺血手術(shù)后縫合傷口正常飼養(yǎng),觀察存活情況。

1.3 標(biāo)本的采集

各組用于取材的SD 雌性大鼠于血液復(fù)灌6 h 后,迅速取出距回腸末端3~5 cm 處的小腸組織,取4 段,每段2~3 cm,用生理鹽水沖洗干凈,再用濾紙吸干小腸組織表面水分,2 段固定在4%多聚甲醛溶液中,其余2 段-80 ℃冰箱保存。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 小腸損傷程度測定 標(biāo)本在4%多聚甲醛溶液固定12 h 后,濾紙吸去小腸組織表面多聚甲醛溶液,進(jìn)行冷凍切片,HE 染色,100×光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。采用Chiu 氏法評分來評價腸黏膜損傷程度。

1.4.2 小腸組織細(xì)胞凋亡的TUNEL 法檢測 檢測步驟按TUNEL 試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,C1098)上的步驟進(jìn)行,細(xì)胞核呈棕黃色者為陽性。400 倍顯微鏡下,在腸粘膜上任意選取5 個非重疊視野,計數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)目,然后取其平均數(shù)值,計算TUNEL 染色細(xì)胞的陽性率,以用于統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4.3 ELISA 法檢測血清中DAO 表達(dá)水平 按照ELISA 試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司,CRE0003)說明書步驟進(jìn)行操作,首先將血清進(jìn)行1:2的稀釋,隨后向96 孔板中加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品37 ℃孵育90 min,加入生物素化抗體工作液37 ℃孵育60 min,加入酶結(jié)合工作液37 ℃孵育30 min,加入顯色劑避光37 ℃孵育15 min,最后加入終止液在OD450下測量吸光度。本實驗采用雙抗體夾心ELISA 法,檢測各組大鼠DAO 表達(dá)水平。

1.4.4 RT-PCR 法檢測小腸中GRP78mRNA 的表達(dá)水平 取0.2 g 小腸組織,加入1 mL Trizol,充分混勻、裂解至液體均一粘稠;加入200 μL 的氯仿,劇烈震蕩15 s,室溫靜置10 min;13 000 rpm×15 min,4 °C 離心;將上層水相轉(zhuǎn)入一個新的EP 管內(nèi),加入400 μL 的異丙醇,室溫靜置20 min;離心,13 000 rpm×10 min,4 ℃;棄上清,1 mL 75%乙醇顛倒搖晃洗滌。13 000 rpm×10 min,4 ℃;打開管蓋,晾干5~10 min。倒扣吸凈殘液;用20 μL DEPC 處理水溶解RNA,之后進(jìn)行總RNA 的濃度和純度測定。隨后用TaKaRa 試劑盒的方法去除基因組DNA 反應(yīng),再用TB Green qPCR 法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)用Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System 的操作方法,配制20 μL 反應(yīng)體系,采用3 步法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列:上游5’GAACCAACTCACGTCCAACC3’,下游:5’CTTTCC CAAATACGCCTCGG3’。內(nèi)參采用GAPDH,上游:5’GAAGCTGGTCATCAACGGGA3’,下 游:5’TCG TGGTTCACACCCATCAC3’。隨后采用2-△△Ct法檢測GRP78mRNA 的相對水平。

1.4.5 WB 法檢測小腸中GRP78 蛋白的表達(dá)水平取0.2 g 小腸組織,提取小腸組織蛋白,用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量,隨后用Loading Buffer進(jìn)行蛋白變性。取20 μL 樣品上樣,10% SDS-PAGE,180 V,100 mA,電泳50 min,電泳后200 mA,1 h 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,隨后用10% 封膜奶室溫封膜2 h,TBST 洗3 次,每次5 min,一抗孵育4 ℃過夜,TBST洗3 次,每次5 min,室溫孵育二抗2 h,TBST 洗4 次,每次5 min,顯影。

1.4.6 術(shù)后各組大鼠兩周的存活率 各組用于觀察存活情況的SD 雌性大鼠,在進(jìn)行小腸缺血手術(shù)之后,正常飼養(yǎng),觀察各組存活情況。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,組間比較采用ANOVA 分析方法,P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 小腸組織病理變化

對照組回腸粘膜正常,顯示規(guī)則的絨毛,絨毛頂端輕微破裂;缺血20 min 組部分腸粘膜絨毛斷裂,絨毛上皮層與固有層中度分離,絨毛毛細(xì)血管充血明顯;缺血40 min 組腸粘膜絨毛成塊脫落,固有層破壞、出血、潰瘍;缺血60 min 組隱窩基底層損傷;缺血80 min 組腸粘膜完全潰散;缺血100 min 組腸粘膜大規(guī)模的出血潰散。損傷組與對照組相比,隨著缺血時間的延長,腸粘膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞越來越嚴(yán)重,出現(xiàn)絨毛脫落,固有層破壞、出血、潰瘍,腸壁變薄。圖1 結(jié)果顯示,隨著小腸缺血時間的延長Chiu 氏評分逐漸升高,說明損傷程度逐漸加重;圖2 結(jié)果顯示,腸黏膜損傷程度與缺血時間有關(guān),隨著缺血時間的延長,黏膜損傷程度逐步加重。

圖1 各組小腸損傷Chiu 氏評分與對照組相比較,****P<0.0001Fig.1 Chiu's score of small intestine injury in each group****P<0.0001,compared with control group

圖2 各組小腸組織HE 染色A:對照組小腸組織HE 染色 B:缺血20 min 組小腸組織HE 染色 C:缺血40 min 組小腸組織HE 染色D:缺血60 min 組小腸組織HE 染色E:缺血80 min 組小腸組織HE 染色 F:缺血100 min 組小腸組織HE染色Fig.2 HE staining of small intestine tissue in each groupA: small intestine tissue in the control group; B: small intestine tissue in the ischemia 20 min group; C: small intestine tissue in the ischemia 40 min group; D:small intestine tissue in the ischemia 60 min group; E:small intestine tissue in the ischemia 80 min group; F: small intestine tissue in the ischemia 100 min group

2.2 小腸組織細(xì)胞凋亡檢測

由圖3、4 可得,對照組小腸絨毛處可見少數(shù)細(xì)胞凋亡;缺血20、40、60、80、100 min 組小腸絨毛及黏膜層細(xì)胞凋亡程度逐漸增加。與對照組相比損傷組隨著缺血時間的延長小腸粘膜細(xì)胞TUNEL 實驗結(jié)果陽性率逐漸增加,小腸絨毛及黏膜層細(xì)胞凋亡程度逐漸增加。

圖3 各組小腸組織TUNEL檢測A:對照組小腸組織TUNEL 檢測B:缺血20 min 組小腸組織TUNEL 檢測 C:缺血40 min 組小腸組織TUNEL 檢測 D:缺血60 min 組小腸組織TUNEL 檢測 E:缺血80 min 組小腸組織TUNEL 檢測 F:缺血100 min 組小腸組織TUNEL 檢測Fig.3 TUNEL detection of small intestine tissue in each groupA: small intestine tissue in the control group; B: small intestine tissue in the ischemia 20 min group;C: small intestine tissue in the ischemia 40 min group; D: small intestine in the ischemia 60min group; E: small intestine tissue in the ischemia 80min group; F: small intestine tissue in the ischemic 100 min group

圖4 各組小腸組織TUNEL 檢測細(xì)胞凋亡評分與對照組相比較,**P<0.01,****P<0.0001Fig.4 Apoptosis scores of small intestine tissues detected by TUNEL in each group**P<0.01,****P<0.0001,compared with the control group

2.3 各組SD 大鼠DAO 的表達(dá)水平

由圖5 可得,隨著缺血時間的延長,DAO 的表達(dá)水平逐漸升高,與對照組相比缺血20 min、40 min 時,DAO 的表達(dá)水平并未顯著升高;與對照組相比缺血60 min 時SD 大鼠DAO 的表達(dá)水平第一次出現(xiàn)明顯升高的現(xiàn)象(P=0.0118);與對照組相比80 min、100 min 時間點時SD 大鼠DAO 的表達(dá)水平顯著升高(P<0.0001)。

圖5 各組SD 大鼠DAO 的表達(dá)水平與對照組相比較,*P=0.0118,****P<0.0001Fig.5 The expression level of DAO in each group*P=0.0118,****P<0.0001,compared with the control group

2.4 GRP78 mRNA 表達(dá)水平

由圖6 可得,與對照組相比損傷組缺血40 min 時GRP78 mRNA 的表達(dá)水平明顯升高(與對照組相比P=0.0009),并且在缺血80 min 時達(dá)到峰值(與對照組相比P<0.0001);與損傷組缺血80 min 時間點GRP78 mRNA 的表達(dá)水平相比,在100 min 時GRP78 mRNA的表達(dá)水平顯著下降(與損傷組缺血80 min 時間點相比P<0.0001)。

圖6 各組SD 大鼠GRP78 mRNA 表達(dá)水平與對照組相比較,***P<0.001,****P<0.0001 與缺血80 min 組相比,****P<0.0001Fig.6 GRP78 mRNA expression levels in each group***P<0.001,****P<0.0001,compared with the control group,****P<0.0001,compared with the 80 min group

2.5 GRP78 蛋白表達(dá)水平

由圖7 可得,與對照組相比損傷組缺血20 min 時GRP78 蛋白表達(dá)量明顯升高(與對照組相比P=0.0027),在缺血80 min 時GRP78 蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值(與對照組相比P<0.0001);與損傷組缺血80 min 時GRP78 蛋白表達(dá)量相比,在缺血100 min 時GRP78 蛋白表達(dá)量略有下降(與損傷組缺血80 min 時間點相比P>0.05),與PCR 結(jié)果基本一致。

圖7 各組SD 大鼠GRP78 蛋白表達(dá)水平 A: GRP78 蛋白表達(dá)條帶; B: GRP78 蛋白表達(dá)灰度值與對照組相比較,***P<0.001,****P<0.0001 與缺血80 min 組相比,P>0.05Fig.7 GRP78 protein expression level in each groupA: GRP78 protein expression band; B: protein expression gray value**P<0.01,****P<0.0001,compared with the control group,P>0.05,compared with the 80 min group

2.6 術(shù)后各組大鼠兩周的存活率

由表1 可得,對照組和缺血時間在20 min,40 min組的大鼠全部存活,存活率為100%;缺血時間為60 min 的大鼠,存活了5 只,存活率為71.4%;缺血時間為80 min 的大鼠存活了2 只,存活率為28.6%;缺血時間為100 min 的大鼠存活了1 只,存活率為14.3%。隨著缺血時間的延長,大鼠存活率逐漸降低。

表1 術(shù)后各組大鼠兩周的存活率Tab.1 Two-week survival rate of rats in each group after operation

2.7 不同缺血時間小腸損傷程度與GRP78 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析

由圖8 可得,在80 min 之前,隨著缺血時間的延長,小腸損傷程度逐漸加重,GRP78 蛋白表達(dá)水平也逐漸增加,小腸損傷程度與GRP78 蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(R2=0.9655),在100 min 時,隨著缺血時間的延長,小腸損傷程度加重,GRP78 蛋白表達(dá)水平較80 min 時降低,故100 min 的時間點為離散點。因此,小腸缺血時間在80 min 之內(nèi)時,小腸損傷程度與GRP78蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(R2=0.9655),100 min 時為離散點。

圖8 不同缺血時間小腸損傷程度與GRP78 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between the degree of small intestine injury and GRP78 protein expression at different ischemic times

3 討論

GRP78 是熱休克蛋白70(HSP70)家族的成員,它在所有真核生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上都有發(fā)現(xiàn)[6],具有糾正錯誤折疊和裝配,防止錯誤折疊的蛋白質(zhì)或蛋白亞基運輸?shù)墓δ?。GRP78 具有非伴侶功能,它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的主要結(jié)合蛋白,維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中的Ca2+平衡[7]。GRP78 的表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的活動直接相關(guān),當(dāng)某種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)時,GRP78 的表達(dá)量便會升高,以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的穩(wěn)定[8]。Wang 等發(fā)現(xiàn),敲除純合小鼠的GRP78 基因,小鼠會出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡,直至死亡[9]。隨著更深入的研究,發(fā)現(xiàn)GRP78 基因具有抗凋亡的作用,對細(xì)胞活力至關(guān)重要[10]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)發(fā)生時,過度表達(dá)的GRP78 會導(dǎo)致Ca2+平衡紊亂,從而影響細(xì)胞活力[11]。過度表達(dá)的GRP78 會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的GRP78/PERK/CHOP 凋亡信號通路,引起細(xì)胞凋亡[12]。在外科手術(shù)中,嚴(yán)重的創(chuàng)傷、機(jī)械損傷、小腸移植手術(shù)等均會導(dǎo)致缺血再灌注損傷,因此研究不同缺血時間與GRP78 的表達(dá)規(guī)律,對小腸缺血再灌注損傷的臨床診斷提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

小腸缺血再灌注損傷后,由于小腸細(xì)胞缺血缺氧導(dǎo)致Ca2+超載、自由基增多、炎癥反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),促使GRP78 的表達(dá)量顯著升高[13]。Senol Ardic 等研究發(fā)現(xiàn),GRP78 是小腸缺血再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物,GRP78 表達(dá)量與小腸缺血再灌注損傷的程度密切相關(guān)[14]。

本實驗中,HE 結(jié)果顯示,與對照組相比損傷組隨著缺血時間的延長小腸絨毛及粘膜損傷程度逐漸增加;TUNEL 結(jié)果顯示,與對照組相比損傷組隨著缺血時間的延長小腸絨毛及粘膜細(xì)胞凋亡水平逐漸增加;ELISA 結(jié)果顯示,與對照組相比損傷組隨著缺血時間的延長DAO 的表達(dá)水平逐漸升高,在缺血60 min 時SD 大鼠DAO 的表達(dá)水平第一次出現(xiàn)明顯升高的現(xiàn)象,而DAO 是腸粘膜損傷的標(biāo)志物之一,這說明隨著缺血時間的延長腸粘膜損傷程度逐步加重,在60 min時間點腸粘膜第一次出現(xiàn)明顯的損傷;PCR 結(jié)果顯示,與對照組相比損傷組缺血40 min 時GRP78 mRNA 的表達(dá)水平明顯升高,并且在缺血80min 時達(dá)到峰值,與損傷組缺血80 min 時間點GRP78 mRNA的表達(dá)水平相比,在100 min 時GRP78 mRNA 的表達(dá)水平顯著下降;WB 結(jié)果顯示,與對照組相比損傷組隨著缺血時間的增加,GRP78 蛋白表達(dá)量表達(dá)量逐漸升高,在80 min 時間點達(dá)到峰值,與損傷組缺血80 min 時GRP78 蛋白表達(dá)量相比,在缺血100 min 時GRP78 蛋白表達(dá)量略有下降。觀察術(shù)后大鼠的存活情況可知,對照組、20 min 組、40 min 組大鼠的存活率為100%,說明這三組的損傷并不明顯,依靠大鼠的自愈能力可以自愈,60 min 組、80 min 組、100 min 組的大鼠存活率顯著降低,說明這三組的損傷明顯,大鼠不能自愈。由圖8 不同缺血時間小腸損傷程度與GRP78 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析可知,小腸缺血時間在80 min 之內(nèi)時,小腸損傷程度與GRP78 蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān),100 min 時為離散點。

結(jié)合以上實驗結(jié)果表明,大鼠小腸缺血時間小于80 min 時,隨著缺血時間的增加,大鼠小腸損傷程度逐漸加重,小腸絨毛及粘膜層細(xì)胞凋亡水平逐漸增加,GRP78 的表達(dá)水平也逐漸增加;當(dāng)缺血時間大于80 min 時,大鼠小腸絨毛及粘膜層細(xì)胞凋亡增加,而GRP78 的表達(dá)水平減弱。有研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)會使GRP78 的表達(dá)水平升高,抑制CHOP 的表達(dá),達(dá)到保護(hù)小腸細(xì)胞的作用[14]。但是GRP78 的保護(hù)作用有限,隨著缺血時間的延長,損傷程度逐漸加重,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)長時間得不到調(diào)節(jié),GRP78 便會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的GRP78/PERK/CHOP 凋亡信號通路,從抗凋亡因子轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲鲆蜃?,促進(jìn)CHOP、Caspase-12、PERK 等凋亡因子的表達(dá),此時細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡,水解酶等促進(jìn)細(xì)胞凋亡的酶活性升高,基因活性降低,GRP78 表達(dá)量降低[12,15~17]。本次實驗結(jié)果與該研究結(jié)論基本一致。

綜上所述,本研究檢測了缺血時間與小腸損傷程度和GRP78 表達(dá)量之間的關(guān)系,本研究初步證實了隨著小腸缺血時間的延長,GRP78 表達(dá)量并非一直增加,當(dāng)缺血損傷過于嚴(yán)重時,GRP78 的表達(dá)量會降低,在缺血80 min 之前grp78 表達(dá)量與小腸損傷程度呈正相關(guān),在100 min 時間點,小腸損傷程度較80min 時增加,grp78 表達(dá)量較80 min 時減少。本研究為小腸缺血再灌注損傷的臨床診斷提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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