孫麗媛 朱莉 陳思童 王凱 趙明威

正視化是指眼睛受到外界的視覺刺激，眼球壁向著物像焦點(diǎn)的方向生長(zhǎng)，最終致屈光狀態(tài)與其軸向長(zhǎng)度相匹配的發(fā)展過程。在一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼中已發(fā)現(xiàn)存在正視化過程，當(dāng)其正常過程受到干預(yù)（如形覺剝奪、透鏡誘導(dǎo)等）時(shí)，實(shí)驗(yàn)眼會(huì)發(fā)生異常改變導(dǎo)致屈光不正的出現(xiàn)[1]。眼睛可以鎖定離焦的跡象，通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度對(duì)正、負(fù)透鏡引起的離焦做出應(yīng)答。正透鏡干擾時(shí)眼球生長(zhǎng)速度降低，負(fù)透鏡干擾時(shí)生長(zhǎng)速度加快，并且這一現(xiàn)象廣泛存在于不同物種[2]。1983 年，Williams等[3]通過給獼猴配戴負(fù)鏡片，首次成功構(gòu)建了透鏡誘導(dǎo)近視（Lens-induced myopia，LIM）模型。Tatiana等[4]學(xué)者提出眼睛的生長(zhǎng)受光學(xué)離焦信號(hào)的雙向正視化（Bidirectional emmetropization by the sign of optical defocus，BESOD）機(jī)制調(diào)控，即近視和遠(yuǎn)視離焦信號(hào)可由視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)換為分子信號(hào)，再通過2個(gè)基本不同的離焦敏感信號(hào)級(jí)聯(lián)放大傳播。利用動(dòng)物模型進(jìn)行的研究使我們能了解正視化的機(jī)制和特點(diǎn)以及屈光不正的發(fā)展過程。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有：魚[5]、雞[6]、小鼠[7]、樹鼩[8]、狨猴[9]、恒河猴[10]、豚鼠[11]等。近年來(lái)創(chuàng)新設(shè)計(jì)的透鏡固定方式，如應(yīng)用3D打印技術(shù)設(shè)計(jì)的頭蓋骨式鏡框[7]可以有效、穩(wěn)定地誘導(dǎo)出動(dòng)物近視模型，給近視研究帶來(lái)了便利。

近年來(lái)，隨著“人類基因組計(jì)劃”的逐漸完善以及各檢測(cè)技術(shù)成本的迅速下降，各種組學(xué)研究方法飛速發(fā)展，其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)專注于RNA水平的基因表達(dá)，并提供基因結(jié)構(gòu)和基因功能的全基因組信息，以揭示特定生物過程中涉及的分子機(jī)制，提高了我們對(duì)基于RNA的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解[12]。隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法已經(jīng)從對(duì)一個(gè)或幾個(gè)轉(zhuǎn)錄本（例如，實(shí)時(shí)定量PCR）的定向定量，發(fā)展到對(duì)數(shù)千個(gè)轉(zhuǎn)錄本的無(wú)偏倚同時(shí)分析。下一代測(cè)序技術(shù)，主要是RNA-sequencing（RNA-seq）已經(jīng)迅速成為傳統(tǒng)技術(shù)的強(qiáng)大替代品[13]。本研究旨在篩選出離焦識(shí)別晚期雛雞的后極部各組織的差異表達(dá)基因和信號(hào)通路，為屈光不正的防控提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)

本研究采用的實(shí)驗(yàn)用7 d齡白來(lái)航雞，購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，出生時(shí)無(wú)任何發(fā)育畸形，雌雄兼用，隨機(jī)分為3組，每組10只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度控制的房間里，并保持在正常的實(shí)驗(yàn)室照明下，12/12 h明暗交替光照。本研究遵循美國(guó)視覺和眼科研究協(xié)會(huì)（American Association for Vision and Ophthalmology Research,ARVO）規(guī)定的眼科研究動(dòng)物使用規(guī)范。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2018PHC059）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

負(fù)鏡誘導(dǎo)組即遠(yuǎn)視離焦組小雞配戴-10 D透鏡于右眼，正鏡誘導(dǎo)組即近視離焦組小雞配戴+10 D透鏡于右眼，對(duì)照組配戴平光鏡于右眼，所有小雞左眼均不做任何干預(yù)。本實(shí)驗(yàn)使用的鏡片均由聚甲基丙烯酸甲酯材料（PMMA）制作而成，有效光學(xué)區(qū)直徑為10 mm，鏡片直徑12.2 mm，分別為屈光力為-10 D的負(fù)透鏡、+10 D的正透鏡和0 D的平光鏡的單光鏡片。尼龍扣分為毛面和勾面兩部分，中央均打孔，鏡片與勾面尼龍扣固定，毛面尼龍扣粘貼于雛雞右眼眼周，使中央打孔位置良好暴露上下瞼。為了避免對(duì)動(dòng)物可能造成的應(yīng)激反應(yīng)而影響測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，毛面扣于光學(xué)干預(yù)前1 d完成眼周粘貼，次日將勾面尼龍扣鏡片與毛面眼周尼龍扣貼合，開始光學(xué)干預(yù)。雛雞配戴鏡片后每天上午10時(shí)和下午3時(shí)檢查鏡片配戴情況，保證鏡片光學(xué)區(qū)與動(dòng)物瞳孔中心準(zhǔn)確對(duì)位，并清洗鏡片，以避免飼料及灰塵遮蓋鏡片光學(xué)區(qū)造成形覺剝奪。對(duì)于實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)鏡片脫位的動(dòng)物排除出組。分別于戴鏡前及戴鏡6 d后，行雙眼帶狀光檢影鏡驗(yàn)光，高頻A超測(cè)量眼球軸向長(zhǎng)度，光學(xué)相干斷層掃描（OCT）行后極部掃描成像。所有的生物學(xué)測(cè)量均由同一名研究人員于上午8—10時(shí)完成，采取先屈光測(cè)量后眼球生物學(xué)長(zhǎng)度測(cè)量、先實(shí)驗(yàn)眼后對(duì)側(cè)眼的順序。

1.2.1 帶狀光檢影驗(yàn)光 以1.5%異氟烷對(duì)動(dòng)物進(jìn)行吸入性麻醉，開瞼器充分暴露角膜，暗室環(huán)境下應(yīng)用帶狀光檢影鏡（YZ24，蘇州六六視覺科技有限公司）進(jìn)行檢影。記錄2條垂直子午線上的屈光度值，計(jì)算其等效球鏡度。

1.2.2 眼球生物學(xué)長(zhǎng)度 采用本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的高頻A超檢測(cè)眼部參數(shù)，該檢測(cè)裝置具有25MHz換能器（北京TECLAB公司），檢測(cè)軟件為系統(tǒng)自帶UTSystem。取20次測(cè)量結(jié)果求取平均值，保證各個(gè)數(shù)據(jù)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)誤差小于0.1。軸向長(zhǎng)度定義為從角膜前部到視網(wǎng)膜后表面的距離[14]。

1.2.3 光學(xué)相干斷層掃描 本次實(shí)驗(yàn)采用圖湃超高速眼科掃頻OCT（北京圖湃掃頻OCT，掃頻激光光源，中心波長(zhǎng)1 060 nm，掃描速度100 000次/s，掃描深度3 mm，圖像像素1 024×1 024，軸向分辨率5 μm，橫向分辨率10 μm）測(cè)量雛雞視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜厚度，厚度測(cè)量參考既往研究[15]。由于雛雞的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜生理結(jié)構(gòu)與人類不同，其視網(wǎng)膜沒有黃斑中心凹[16]，視網(wǎng)膜較厚，在視神經(jīng)入口處形成特殊的眼梳膜，含有豐富的血管，伸入玻璃體內(nèi)，與視網(wǎng)膜的營(yíng)養(yǎng)和代謝有關(guān)。為了更加準(zhǔn)確地量化脈絡(luò)膜厚度和血流變化，本研究以眼梳膜近中心止端為定位點(diǎn)（見圖1中A點(diǎn)），選取距離該點(diǎn)5 000 μm處測(cè)量脈絡(luò)膜厚度（見圖1中B點(diǎn)）。

1.3 RNA分離和文庫(kù)制備

1.3.1 組織分離 配戴鏡片6 d后使用異氟醚對(duì)小雞進(jìn)行重度麻醉并斷頭處死。迅速取出每只眼球，在冰上沿赤道部環(huán)形切開眼球，棄眼前節(jié)及玻璃體，使用3個(gè)凍存管分別收集視網(wǎng)膜/RPE、脈絡(luò)膜和鞏膜，放入液氮中保存。

1.3.2 總RNA的提取 各組中隨機(jī)選取3個(gè)個(gè)體的組織，使用Trizol試劑按照制造商的說明從各組織中提取總RNA。RNA提取完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)量濃度。進(jìn)一步使用Agilent 2100 生物分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），檢測(cè)了RNA樣品質(zhì)量，樣品質(zhì)量達(dá)到A后用于后續(xù)的建庫(kù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)。利用磁珠法，mRNA被分離，并片段化，用于cDNA的合成。cDNA合成后，經(jīng)純化、末端修復(fù)、加A、連接頭，用于PCR擴(kuò)增富集。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行樣品文庫(kù)的質(zhì)控，并使用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）對(duì)文庫(kù)進(jìn)行量化，將制作好的文庫(kù)用Illumina HiSeq測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序，并用測(cè)序儀自帶分析軟件對(duì)測(cè)序過程進(jìn)行分析并輸出結(jié)果。

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

使用SOAPnuke（v1.5.2）[17]過濾測(cè)序數(shù)據(jù)

（1）去除接頭序列。

（2）去除低質(zhì)量堿基（低質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為堿基質(zhì)量≤5）比例大于20%的序列。

（3）去除未知堿基（'N'堿基）比例大于5%的reads，得到clean reads并以FASTQ格式存儲(chǔ)。使用HISAT2（v2.0.4）[18]將cleandata比對(duì)到參考基因組（https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/vertebrate_other/Gallus_gallus/latest_assembly_versions/GCF_016700215.1_bGalGal1.pat.whiteleghornlay）。

（4）使用Bowtie2（v2.2.5）[19]將干凈的reads比對(duì)到參考編碼基因集，然后通過StringTie[20]計(jì)算基因的表達(dá)水平。熱圖由pheatmap根據(jù)不同樣本中的基因表達(dá)情況繪制。

（5）使用DESeq2（v1.4.5）[21]進(jìn)行差異表達(dá)分析，差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes,DEGs）篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05和|log2FC|＞1。

1.4.2 功能分析 由Phyper（https://en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution）基于超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行注釋的不同表達(dá)基因的富集分析：Gene Ontology（GO）（http://www.geneontology.org/）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）（https://www.kegg.jp/）。DEG映射到PPI網(wǎng)絡(luò)上，并將＞0.4 的交互得分設(shè)置為閾值。使用Cytoscapev3.8.2軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化和構(gòu)建。與相鄰節(jié)點(diǎn)交互次數(shù)最多的節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是中心節(jié)點(diǎn)。為了識(shí)別關(guān)鍵的 PPI 網(wǎng)絡(luò)模塊，使用MCODE對(duì)上述 PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分（node score cutoff=0.2，K-core=2），記錄得分最高的子網(wǎng)絡(luò)，再應(yīng)用cytoHubba，記錄top5的基因。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。屈光度和軸向長(zhǎng)度測(cè)量值符合正態(tài)分布，表示為，本研究差值表示的是干預(yù)后右眼的屈光度及眼軸長(zhǎng)度減去左眼的差值。多組之間的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1.SS-OCT測(cè)量界面圖A：眼梳膜止端；B：距離A點(diǎn)垂直距離5 000 μm的位置，厚度測(cè)量在B點(diǎn)進(jìn)行。R，視網(wǎng)膜厚度；C，脈絡(luò)膜厚度；S，鞏膜厚度Figure 1.SS-OCT measurement interface diagram.A:The end of the pecten oculi.B:The position at a vertical distance of 5 000 μm from point A,the thickness measurement was performed at point B.R,retinal thickness;C,choroidal thickness;S,scleral thickness.

2 結(jié)果

2.1 屈光度和眼軸增長(zhǎng)結(jié)果

各組間基線數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)6 d后，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)眼（右眼）保持正常生理生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)眼與左眼的屈光度差值為（0.20±0.96）D，眼軸長(zhǎng)度差值為（0.04±0.06）mm；應(yīng)用-10 D單光鏡片施加干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)眼與左眼的屈光度差值為（-8.50±1.41）D，眼軸長(zhǎng)度差值為（0.50±0.04）mm，與對(duì)照組相比，-10 D透鏡引起了明顯的近視屈光變化（P＜0.001）和過度的軸向伸長(zhǎng)（P＜0.001）；應(yīng)用+10 D單光鏡片施加單眼干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)眼與左眼的屈光度差值為（+9.50±1.35）D，眼軸長(zhǎng)度差值為（-0.32±0.05）mm；與對(duì)照組相比，+10 D鏡片誘導(dǎo)出遠(yuǎn)視漂移（P＜0.001），如圖2所示。

2.2 后極部組織厚度變化

采用SS-OCT對(duì)雛雞后極部成像，各組間基線數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)比干預(yù)后右眼與干預(yù)后左眼的后極部各組織厚度變化，負(fù)鏡組的視網(wǎng)膜厚度差值為（-5.60±13.71）μm，脈絡(luò)膜厚度差值為（-79.00±29.13）μ m，鞏膜厚度差值為（7.90±13.08）μ m；對(duì)照組視網(wǎng)膜厚度差值為（-0.50±11.35）μ m，脈絡(luò)膜厚度差值為（-0.2 0±3 1.3 0）μ m，鞏膜厚度差值為（1.4 0±1 4.2 7）μ m；正鏡組的視網(wǎng)膜厚度差值為（5.90±6.92）μ m，脈絡(luò)膜厚度差值為（161.40±75.83）μ m，鞏膜厚度差值為（5.70±15.41）μm；各組織中僅脈絡(luò)膜厚度差值各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如圖3所示。

圖2.透鏡誘導(dǎo)對(duì)雛雞屈光度和眼軸長(zhǎng)度的作用（干預(yù)后右眼與左眼的差值）A：屈光度差值；B：眼軸長(zhǎng)度差值。Minus，負(fù)鏡組；Control，對(duì)照組（平光鏡組）；Plus，正鏡組。a，P＜0.001Figure 2.Effect of lens induction on diopter and axial length in chicks(difference between OD and OS after intervention).A:Diopter difference.B:Axial length difference.Minus,minus-lens group;Control,plano-lens group;Plus,plus-lens group.a,P＜0.001.

2.3 差異基因表達(dá)

基于轉(zhuǎn)錄組的RNA-seq分析，鑒定了3種組織的差異表達(dá)基因。以P＜0.05和|log2FC|＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，各組各組織差異基因表達(dá)如表1所示，差異基因由負(fù)鏡/正鏡組與對(duì)照組基因表達(dá)相比較而產(chǎn)生，重疊差異基因表示該基因在負(fù)鏡組表達(dá)存在差異，同時(shí)該基因在正鏡組也存在表達(dá)差異；視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜的大部分重疊差異基因的表達(dá)趨勢(shì)一致，即該基因如果在負(fù)鏡組表達(dá)下調(diào)，在正鏡組也表達(dá)下調(diào)，上調(diào)同理；僅有脈絡(luò)膜的LOC121112941表現(xiàn)出相反的差異表達(dá)趨勢(shì)，該基因在負(fù)鏡組表達(dá)上調(diào)，在正鏡組表達(dá)下調(diào)。

負(fù)鏡組差異表達(dá)基因在3種組織中有13個(gè)基因重合，正鏡組有9個(gè)基因重合，具體信息如表2所示，其中l(wèi)og2FC值表示負(fù)鏡/正鏡組與對(duì)照組基因表達(dá)量的比值，log2FC＞1表示與對(duì)照組相比，負(fù)鏡/正鏡組該基因表達(dá)上調(diào)；log2FC＜-1表示與對(duì)照組相比，負(fù)鏡/正鏡組該基因表達(dá)下調(diào)。

2.4 GO功能注釋

對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，從細(xì)胞成分、生物學(xué)過程和分子功能3 個(gè)方面分析靶基因功能。不同透鏡誘導(dǎo)所致的差異基因在不同組織中富集的50%以上的GO通路存在重疊（重疊通路的數(shù)量：視網(wǎng)膜15、脈絡(luò)膜19、鞏膜24），如圖4所示。

圖3.透鏡誘導(dǎo)對(duì)雛雞后極部脈絡(luò)膜厚度的影響(干預(yù)后右眼與左眼的差值)Minus，負(fù)鏡組；Control，對(duì)照組（平光鏡組）；Plus，正鏡組。a，P＜0.001Figure 3.Effect of lens induction on choroidal thickness at the posterior pole of chicks (difference between OD and OS after intervention).Minus,minus-lens group;Control,plano-lens group;Plus,plus-lens group.a,P＜0.001.

表1.負(fù)鏡/正鏡組視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜的差異表達(dá)基因數(shù)目Table 1.The number of DEGs in retina,choroid,and sclera in the minus-lens/plus-lens group

表2.負(fù)鏡/正鏡組視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜重疊差異表達(dá)基因Table 2.Overlapping differentially expressed genes in retina,choroid,and sclera in the minus-lens/plus-lens group

2.5 KEGG通路分析

與GO分析類似，2種處理后的KEGG通路分析也存在重疊，視網(wǎng)膜水平的共同通路是花生四烯酸代謝、酪氨酸代謝和視黃醇代謝。脈絡(luò)膜水平的重疊途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，精氨酸和脯氨酸代謝和視黃醇代謝。鞏膜層面則為細(xì)胞粘附分子、ECM-受體相互作用、粘著斑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、硫代謝、糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素、Toll樣受體信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路，如圖5所示。

2.6 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

應(yīng)用STRING11.0 構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)，使用MCODE對(duì)上述PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分，記錄得分最高的子網(wǎng)絡(luò)于圖6，應(yīng)用cytoHubba，記錄top5的基因于表3。

3 討論

本研究首次通過RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析研究雛雞晚期離焦識(shí)別過程中后極部各組織的DEGs，繼而通過GO、KEGG等富集分析探索具體的作用通路。通過測(cè)量長(zhǎng)時(shí)間暴露于正/負(fù)透鏡磨損產(chǎn)生的近視/遠(yuǎn)視離焦后視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜中的基因表達(dá)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較，本研究發(fā)現(xiàn)僅有LOC121112941基因在鞏膜組織中表現(xiàn)出離焦敏感的表達(dá)，各組織在近視離焦和遠(yuǎn)視離焦的過程中，由差異基因富集到的通路存在一定程度的重合，通過PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，本研究還確定了離焦識(shí)別過程中的關(guān)鍵基因，可為后續(xù)研究提供參考靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示正負(fù)透鏡的組間的重疊差異基因比例在各組織間保持在29%～62%之間，且重疊基因基本保持同樣的表達(dá)趨勢(shì)，即在正鏡組中表達(dá)升高的DEGs，在負(fù)鏡組同樣表達(dá)增高。研究結(jié)果同時(shí)顯示，負(fù)鏡組3種組織的差異基因結(jié)果，存在13 個(gè)基因的重疊，而正鏡組存在9 個(gè)基因的重疊，說明這些基因可能在屈光不正的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。其中FBLN1 編碼蛋白Fibulin-1[22]是fibulin家族的7個(gè)成員之一，為一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)支架蛋白。有研究證實(shí)Fibulin-1 蛋白在豚鼠鞏膜和培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)受全反式維甲酸調(diào)節(jié)，可能參與眼軸增長(zhǎng)中的鞏膜重塑過程。HSP90AA1基因編碼熱休克蛋白90α（Hsp90α）[23]，是分子伴侶Hsp90的應(yīng)激誘導(dǎo)異構(gòu)體；HSPA5[24]基因編碼結(jié)合免疫球蛋白，這是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的Hsp70 家族伴侶。Hsp90 和Hsp70 均參與通路“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工”[25]，該通路通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解確保正確的蛋白質(zhì)折疊或錯(cuò)誤折疊多肽的降解。一項(xiàng)研究收集了透鏡誘導(dǎo)近視后恢復(fù)的樹鼩鞏膜，蛋白組學(xué)檢測(cè)顯示熱休克蛋白70家族的成員HSPA5編碼蛋白上調(diào)1.3倍[26]。PDK編碼丙酮酸脫氫酶激酶[27]，是線粒體中的關(guān)鍵酶，通過其亞基的磷酸化負(fù)調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的活性，從而有助于調(diào)節(jié)葡萄糖利用和脂質(zhì)代謝。作為代謝開關(guān)，在已知的同工酶中，PDK4分布最廣，在哺乳動(dòng)物的心肌和骨骼肌中高度表達(dá)[28]。但本研究中PDK4在正負(fù)透鏡誘導(dǎo)組各組織中均表現(xiàn)出表達(dá)增高，此現(xiàn)象說明，無(wú)論施加何種離焦干預(yù)，均會(huì)影響動(dòng)物眼部各組織的代謝反應(yīng)。

圖4.差異表達(dá)基因Gene Ontology分析A、B、C：負(fù)鏡組vs.對(duì)照組（A：視網(wǎng)膜；B：脈絡(luò)膜；C：鞏膜）；D、E、F：正鏡組vs.對(duì)照組（D：視網(wǎng)膜；E：脈絡(luò)膜；F：鞏膜）。BP，生物學(xué)過程；CC，細(xì)胞成分；MF，分子功能Figure 4.Gene Ontology analysis of DEGsA,B,C:The minus-lens group vs. control group (A:retina;B:choroid;C:sclera).D,E,F:The plus-lens group vs. control group (D:retina;E:choroid;F:sclera).BP,biological process;CC,cellular component;MF,molecular function.

圖5.差異表達(dá)基因Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)分析A：負(fù)鏡組vs.對(duì)照組；B：正鏡組vs.對(duì)照組Figure 5.KEGG analysis of DEGs.A:The minus-lens group vs. control group.B:The plus-lens group vs. control group.

GO數(shù)據(jù)庫(kù)把基因的功能分成了3 個(gè)部分分別是：細(xì)胞組分、分子功能、生物過程。本研究選取了每部分中顯著性最高的10 個(gè)條目進(jìn)行分析，應(yīng)用正/負(fù)透鏡干預(yù)雛雞眼部發(fā)育后，各組織中二者重合條目分別為15（視網(wǎng)膜）、19（脈絡(luò)膜）和24（鞏膜），重疊比例≥50%。

圖6.Cytoscape中MCODE插件計(jì)算得分最高的子網(wǎng)絡(luò)A、B、C：負(fù)鏡組vs.對(duì)照組（A：視網(wǎng)膜；B：脈絡(luò)膜；C：鞏膜）；D、E、F：正鏡組vs.對(duì)照組（D：視網(wǎng)膜；E：脈絡(luò)膜；F：鞏膜）Figure 6.Sub-networks with the highest scores calculated by the MCODE plugin in Cytoscape.A,B,C:The minus-lens group vs. control group (A:retina,B:choroid,C:sclera).D,E,F:The plus-lens group vs. control group (D:retina,E:choroid,F:sclera).

表3.負(fù)鏡/正鏡組視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、鞏膜的Top 5 hub基因Table 3.Top 5 hub genes in retina,choroid,and sclera in the minus-lens/plus-lens group

目前，已經(jīng)提出了2種用于正視化視覺控制的替代模型：模型一假設(shè)眼睛的生長(zhǎng)速度僅受視網(wǎng)膜模糊量的調(diào)節(jié)而與離焦的跡象無(wú)關(guān)。在此模型中，越多的模糊促進(jìn)眼球越快的生長(zhǎng)，由于視網(wǎng)膜確實(shí)不能區(qū)分近視和遠(yuǎn)視離焦，所以預(yù)計(jì)強(qiáng)加的近視和遠(yuǎn)視離焦都會(huì)影響相同基因在同一方向上的表達(dá)。模型二則被描述為，出生后眼睛的生長(zhǎng)受視網(wǎng)膜離焦跡象的控制，并且對(duì)離焦的反應(yīng)是雙向的，即近視離焦會(huì)主動(dòng)減少生長(zhǎng)，遠(yuǎn)視離焦會(huì)主動(dòng)增加生長(zhǎng)，該過程可能由同一個(gè)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速率的控制器或2 個(gè)分別控制增加或減少生長(zhǎng)的單獨(dú)控制器調(diào)控。如果這個(gè)模型是正確的，那么強(qiáng)加的近視和遠(yuǎn)視離焦將有望在相反方向調(diào)節(jié)相同基因的表達(dá)或影響不同基因組的表達(dá)[29]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，即不同的離焦信號(hào)誘導(dǎo)的差異基因的重疊部分表達(dá)趨勢(shì)基本一致，可以猜測(cè)該部分可能由離焦的模糊量決定；而差異基因未重疊部分可能符合模型二中的說法，即正視化過程或由2個(gè)分別控制增加或減少生長(zhǎng)的單獨(dú)控制器控制。

既往的離焦信號(hào)識(shí)別的研究證實(shí)的基因如，ZENK[30]、ABCC10[31]、ChEST927g14[32]等，在本研究中未顯示出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)現(xiàn)象，考慮出現(xiàn)此差異的原因?yàn)閷?shí)驗(yàn)檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)不同。上述實(shí)驗(yàn)均在近視誘導(dǎo)的早期進(jìn)行了差異基因的檢測(cè)，而本研究著眼于離焦過程的晚期，我們?cè)陔r雞誘導(dǎo)6 d后取樣檢測(cè)，而且本研究對(duì)雛雞的后極部組織進(jìn)行了分離，分別對(duì)視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜進(jìn)行了分離采集，與既往混合實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，數(shù)據(jù)更具說服力。

KEGG富集分析結(jié)果顯示：應(yīng)用正/負(fù)透鏡干預(yù)雛雞眼部發(fā)育后，各組織中二者重合條目分別為3（視網(wǎng)膜）、3（脈絡(luò)膜）和9（鞏膜）。視網(wǎng)膜的KEGG富集通路包括花生四烯酸代謝、酪氨酸代謝和視黃醇代謝。在脈絡(luò)膜中，重合通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工，精氨酸和脯氨酸代謝和視黃醇代謝。鞏膜則為細(xì)胞粘附分子、ECM-受體相互作用、粘著斑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、硫代謝、糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素、Toll樣受體信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。而上述大部分通路均在過往研究中被證實(shí)和屈光不正，尤其是與近視密切相關(guān)，也在側(cè)面證實(shí)了本研究結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。例如，有研究者在豚鼠代謝組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)遮蓋誘導(dǎo)近視會(huì)降低視網(wǎng)膜花生四烯酸水平[33]，酪氨酸代謝和炎癥通路的失調(diào)可能是近視引起的視網(wǎng)膜變性的機(jī)制[34]。早在2000 年，已經(jīng)有研究證實(shí)脈絡(luò)膜視黃酸的合成受到離焦信號(hào)的調(diào)節(jié)，并且視黃酸可以到達(dá)鞏膜，調(diào)節(jié)鞏膜蛋白聚糖形成[35]。Betrand等[36]對(duì)透鏡誘導(dǎo)近/遠(yuǎn)視的雛雞的視網(wǎng)膜和鞏膜纖維層分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證得到ApoA1在視網(wǎng)膜和纖維鞏膜中均表現(xiàn)出表達(dá)差異，而Apo A1可通過參與視黃酸的調(diào)節(jié)反饋影響眼球增長(zhǎng)[37]。一項(xiàng)代謝組學(xué)的研究結(jié)果證實(shí)[38]病理性近視患者的硫胺素代謝發(fā)生了改變，同時(shí)提出靶向精氨酸和脯氨酸代謝可能具有緩解近視病理變化的治療潛力。全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）和動(dòng)物研究已經(jīng)確定了ECM-受體相互作用和粘著斑參與了屈光不正發(fā)展過程[39]。Frost等[26]在以樹鼩的鞏膜為觀察對(duì)象的蛋白組學(xué)研究顯示LIM眼中，下調(diào)的差異蛋白參與轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞粘附和蛋白質(zhì)合成，而近視誘導(dǎo)恢復(fù)組鞏膜差異表達(dá)蛋白涉及細(xì)胞粘附、細(xì)胞分裂、細(xì)胞骨架和ECM結(jié)構(gòu)蛋白等信號(hào)通路。Guo等[40]研究了LIM豚鼠鞏膜中miRNA的表達(dá)譜，KEGG通路富集分析表明，差異表達(dá)的miRNA涉及TGF-β信號(hào)通路。Zhu等[41]發(fā)現(xiàn)在近視期間異常表達(dá)的miRNA調(diào)控的可能通路包括MAPK信號(hào)通路。糖胺聚糖生物合成-硫酸軟骨素/硫酸皮膚素通路則主要在鞏膜的生物力學(xué)特性改變方面發(fā)揮作用[42]。

本研究中的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果輸入cytoHubba插件，記錄了各組織top5的hub基因，發(fā)現(xiàn)鞏膜組織的hub基因存在明顯重合。其中PLK-1[43]可與Polo-box結(jié)構(gòu)域結(jié)合的底物相互作用并促進(jìn)細(xì)胞周期。CDC20[44]是一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制因子，在有絲分裂后期承擔(dān)細(xì)胞的關(guān)鍵功能。NDC80[45]復(fù)合物，是最重要的動(dòng)粒元件之一，在負(fù)責(zé)微管附著的動(dòng)粒蛋白中起核心作用，參與有絲分裂紡錘體組裝和紡錘體檢查點(diǎn)信號(hào)。CDK1[46]高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞周期。BUB1[47]促進(jìn)染色體排列并有助于調(diào)節(jié)有絲分裂持續(xù)時(shí)間?？傊鲜龌蚓c細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，可能為后續(xù)的研究提供更多可參考的靶點(diǎn)基因。

本研究沒有進(jìn)一步進(jìn)行基因的機(jī)制研究，后續(xù)應(yīng)該在細(xì)胞和動(dòng)物水平上通過RNA干擾、過表達(dá)、玻璃體腔注射通路抑制劑等手段進(jìn)一步驗(yàn)證基因和相關(guān)通路在正視化過程中的作用，為屈光不正的治療奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過正負(fù)透鏡誘導(dǎo)后，雛雞后極部各組織中的差異基因重疊比例在29%以上，2 組的差異基因在GO分析和KEGG分析結(jié)果存在重疊，且除LOC121112941基因外，絕大多數(shù)重疊基因保持著相同的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但仍有部分差異基因未重疊，說明近視和遠(yuǎn)視離焦的模糊程度和離焦方向可能同時(shí)影響動(dòng)物正視化過程。然而，確切的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

利益沖突申明 本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 孫麗媛：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析、解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。朱莉：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，指導(dǎo)。陳思童：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，起草文章。王凱：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，獲得研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)。趙明威：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，獲得研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)