趙福新 汪琪 王莉 陽(yáng)凡 鄭陽(yáng)洋 趙晨琛 朱禾 周翔天 瞿佳

血管活性腸肽受體2（Vasoactive intestinal peptide receptor 2,VIPR2）是一種7個(gè)跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，與配體血管活性腸肽（Vasoactive intestinal peptide,VIP）結(jié)合被激活后，經(jīng)環(huán)磷酸腺苷依賴(lài)的蛋白激酶A途徑和磷酯酶C途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。主要參與生理節(jié)律調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞增殖和分化，抑制細(xì)胞因子合成分泌，調(diào)控機(jī)體免疫功能[1]。

目前研究發(fā)現(xiàn)VIPR2與近視相關(guān)。如石毅等[2]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)VIPR2（rs2730260）與高度近視關(guān)聯(lián)；而Zhao等[3]發(fā)現(xiàn)VIPR2SNP位點(diǎn)rs6979985與高度近視相關(guān)。這些研究在遺傳學(xué)上均提示VIPR2與近視相關(guān)。另外，研究顯示小雞形覺(jué)剝奪誘導(dǎo)后視網(wǎng)膜VIPR2表達(dá)升高[4]。給予小雞非選擇性VIP受體拮抗劑（VIP hybrid），可有效減緩雞形覺(jué)剝奪性近視（Form deprivation myopia,FDM）的進(jìn)展，并下調(diào)小雞形覺(jué)剝奪眼視網(wǎng)膜VIP蛋白和mRNA的表達(dá)[5]；而其他研究給予小雞玻璃體下腔注射VIP可明顯抑制FDM的形成，并且會(huì)導(dǎo)致VIPR2mRNA表達(dá)水平下調(diào)[6]。這些研究結(jié)果均表明VIPR2在近視進(jìn)展中發(fā)揮作用，可能的效應(yīng)部位在視網(wǎng)膜，但VIPR2如何影響視網(wǎng)膜功能導(dǎo)致近視并未完全闡明。

文獻(xiàn)報(bào)道顯示生理節(jié)律變化與近視有關(guān)，Stone等[7]認(rèn)為視網(wǎng)膜節(jié)律改變可能影響近視的進(jìn)展；Lee等[8]發(fā)現(xiàn)BMAL1基因（調(diào)控節(jié)律時(shí)鐘重要的轉(zhuǎn)錄因子）敲除小鼠發(fā)展為近視。多巴胺（Dopamine，DA）是視網(wǎng)膜一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，視網(wǎng)膜DA合成和代謝[9-10]具有節(jié)律性并參與屈光發(fā)育、影響近視形成[11-13]。大量研究證實(shí)Vipr2調(diào)控小鼠生理節(jié)律[14-15]。Vipr2作為視網(wǎng)膜一個(gè)重要的節(jié)律基因是否通過(guò)影響視網(wǎng)膜DA等遞質(zhì)的合成與分泌，并影響電生理功能參與近視？為明確此問(wèn)題，本研究將利用Vipr2敲除小鼠檢測(cè)視網(wǎng)膜DA等神經(jīng)遞質(zhì)水平及電生理變化，探討VIPR2對(duì)視網(wǎng)膜功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用的4周齡雄性C57BL/6J小鼠，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Vipr2敲除小鼠的構(gòu)建利用CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)完成（南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院）。利用CRISPR-Cas9刪除Vipr2基因的第2個(gè)外顯子序列（100 bp），導(dǎo)致新轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯蛋白時(shí)密碼子產(chǎn)生移碼突變，多肽合成提前中止，生成的截短蛋白無(wú)法發(fā)揮VIPIR2 蛋白正常的生物學(xué)功能達(dá)到Vipr2基因敲除的目的。具體操作如下：首先設(shè)計(jì)針對(duì)Vipr2基因的gRNA和Cas9表達(dá)質(zhì)粒，這2種質(zhì)粒通過(guò)原核顯微注射到受精卵隨后移植到代孕鼠中，子代鼠基因型通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和Sanger直接測(cè)序驗(yàn)證獲得F0代陽(yáng)性雜合子小鼠（Vipr2+/-）。F0代小鼠（Vipr2+/-）與C57BL/6J小鼠交配，PCR鑒定基因型得到大量陽(yáng)性F1代小鼠（Vipr2+/-）。雜合子F1代小鼠（Vipr2+/-）雄雌交配后經(jīng)PCR基因型鑒定獲得Vipr2全身敲除小鼠（Vipr2-/-）與野生同窩仔（Vipr2+/+）小鼠。4周齡Vipr2-/-和Vipr2+/+小鼠（包括雌雄）由江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司代養(yǎng)繁殖?；蛐丸b定引物見(jiàn)表1。所有小鼠飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持室溫25℃，維持12 h光照/12 h黑暗循環(huán)（上午8點(diǎn)開(kāi)燈），光照明度約為300勒克斯（lx），可自由進(jìn)食飲水。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 Vip和Vipr2在小鼠眼球表達(dá)部位檢測(cè)

VIPR2 需要在配體VIP激活下才發(fā)揮生物學(xué)作用，通過(guò)檢測(cè)VIP和VIPR2在眼組織中的表達(dá)分布，明確VIP-VIPR2 信號(hào)軸在眼部可能發(fā)揮作用的部位。選取1 只4 周齡的野生型C57BL/6J雄性小鼠，頸椎脫臼處死后，分別取角膜、虹膜、晶狀體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜+視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及鞏膜，利用Trizol或RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit（美國(guó)QIAGEN公司）提取組織RNA，轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）合成cDNA后，以肌動(dòng)蛋白β（Actb）作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增Vip、Vipr2cDNA序列，檢測(cè)Vip、Vipr2在眼組織是否表達(dá)。RT-PCR引物使用Primer Premier 5.0商業(yè)軟件設(shè)計(jì)，上下游引物至少跨越一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。序列及擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小見(jiàn)表2。

1.3 Vipr2敲除小鼠屈光度測(cè)量

Vipr2敲除小鼠（Vipr2-knockout，Vipr2-KO）小鼠和Vipr2野生型（Vipr2-wildtype，Vipr2-WT）小鼠在4周齡時(shí)，使用自行搭建的紅外偏心攝影驗(yàn)光儀對(duì)屈光度進(jìn)行測(cè)量，具體操作參考本課題組前期研究[3]。簡(jiǎn)述如下：小鼠在暗室未經(jīng)麻醉狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)操作者用一只手抓小鼠尾巴調(diào)整小鼠頭部方位使其瞳孔中央定位在驗(yàn)光儀顯示屏上，當(dāng)顯示屏上的浦肯野影像清晰，并位于瞳孔中央且屈光力相對(duì)穩(wěn)定時(shí)，記錄此時(shí)的屈光度，左右眼交替測(cè)量，每只眼睛測(cè)量3次，并取其平均值作為最終屈光度數(shù)據(jù)。

1.4 Vipr2-KO小鼠視網(wǎng)膜和玻璃體DA等神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

1.4.1 樣本取材及預(yù)處理 小鼠在12 h/12 h晝夜循環(huán)（光照時(shí)間08:00—20:00）環(huán)境中飼養(yǎng)。文獻(xiàn)報(bào)道小鼠由黑暗進(jìn)入光照后的1 h，即授時(shí)因子時(shí)間（Zeitgeber time 1,ZT1）時(shí)視網(wǎng)膜DA合成和代謝利用水平最高[10]，故選取上午9:00（ZT1）在微弱的紅光下對(duì)視網(wǎng)膜取材。分別取24只4周齡的Vipr2-KO小鼠和24只Vipr2-WT小鼠行頸椎脫臼法分批處死，立即剜出右眼置于預(yù)冷的培養(yǎng)皿上，在解剖顯微鏡下使用1 ml無(wú)菌注射器迅速抽出玻璃體液注入預(yù)冷的EP管，用10 μl微量移液器測(cè)量抽取的玻璃體液體積，然后于30 s內(nèi)迅速剝離視網(wǎng)膜，放入EP管用電子天平稱(chēng)重后立即轉(zhuǎn)入液氮中，待同一批樣本取完材后從液氮中取出樣本轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。樣 本檢測(cè)DA等神經(jīng)遞質(zhì)含量前，玻璃體液和視網(wǎng)膜分別加入15、100 μl的0.1 mol/L冰預(yù)冷的高氯酸，其中含10 μmol/L 抗壞血酸、0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉（Ethylenediaminetetraacetic cid disodinm salt，EDTA-Na2）、0.02 μmol/L 3,4-二羥基苯甲胺氫溴酸鹽（3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide，DHBA），進(jìn)行超聲勻漿處理（玻璃體液不需勻漿處理），于4℃16000 g離心50 min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，置于冰上立即檢測(cè)。

表1.Vipr2敲除和野生型小鼠基因型鑒定引物序列Table 1.Primer sequences for genotyping of Vipr2-KO and Vipr2-WT mice

表2.RT-PCR擴(kuò)增Vip和Vipr2引物序列Table 2.Primer sequences of Vip and Vipr2 for reverse transcription PCR

1.4.2 高效液相色譜法檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)含量 利用安捷倫神經(jīng)遞質(zhì)分析儀平臺(tái)（Agilent 1200，美國(guó)安捷倫公司）通過(guò)高效液相色譜法（High performance liquid chromatography,HPLC）對(duì)DA等遞質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[16]對(duì)視網(wǎng)膜和玻璃體液DA、3,4-二羥基苯乙酸（3,4-dihydroxyphenylacetate,DOPAC）、高香草酸（Homovanillic acid,HVA）、去甲腎上腺素（Norepinephrine,NE）以及各類(lèi)氨基酸包括天冬氨酸（Aspartic acid,Asp）、谷氨酸（Glutamic acid,Glu）、絲氨酸（Serine,Ser）、谷氨酰胺（Glutamine,Gln）、甘氨酸（Glycine,Gly）、?；撬幔═aurine,Tau）和γ氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）等進(jìn)行檢測(cè)分析。操作步驟大致如下：使用流動(dòng)速率為0.2 ml/min的流動(dòng)相（0.05 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）、1.7 mmol/L 正硅酸（Orthosilicic acid）、90 mmol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、50 mmol/L檸檬酸（Citric acid）和5%乙腈（Acetonitrile）對(duì)DA等進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)池電壓設(shè)為+700 mV，溫度保持為35℃。收集的數(shù)據(jù)通過(guò)ChemStation工作臺(tái)（美國(guó)安捷倫公司）進(jìn)行分析，同時(shí)使用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析。

1.5 Vipr2-KO小鼠視網(wǎng)膜電生理檢測(cè)

為明確Vipr2敲除影響視網(wǎng)膜電生理的早期時(shí)間點(diǎn)，分別選取6 只4 周齡的Vipr2-KO小鼠和6 只Vipr2-WT同窩仔小鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜電生理檢測(cè)。檢測(cè)前一晚小鼠放在暗房中過(guò)夜進(jìn)行暗適應(yīng)。檢測(cè)儀器為改裝后的小鼠專(zhuān)用電生理儀（ROLAND Ganzfeld Q450，德國(guó)羅蘭公司），記錄系統(tǒng)為RETI port 視網(wǎng)膜電圖（Roland Consult，德國(guó)羅蘭公司）。操作步驟如下：①散瞳：視網(wǎng)膜電生理記錄前20 min對(duì)每只小鼠的右眼滴用復(fù)方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥株式會(huì)社）充分散瞳；②麻醉：在微弱紅光下用氯胺酮（90 mg/kg）+甲苯噻嗪（10 mg/kg）混合液按小鼠體質(zhì)量（0.01 ml/g）行腹腔注射麻醉。小鼠麻醉后使其側(cè)臥于立式支架的平臺(tái)上，將其固定。測(cè)量室溫維持在20～22℃，放置小鼠的支架平臺(tái)給予水浴恒溫加熱，避免小鼠麻醉后因體溫過(guò)低死亡；③安放電極：在小于5 lx紅光下安置電極。右眼角膜表面安放自制螺旋狀銀-氯化銀電極作為記錄電極，電極盡量與角膜最大接觸，避免產(chǎn)生尖端接觸，電極固定后，角膜予以1%羧甲基纖維素鈉（美國(guó)眼力健公司）點(diǎn)眼，以保持角膜濕潤(rùn)。不銹鋼針狀電極用作參考電極和接地電極，分別置于同側(cè)面頰部和尾部皮下；④記錄：再次暗適應(yīng)1 min后，在不同刺激強(qiáng)度下（-3.699、-2.201、-0.699、0.301、0.799 log cd·s/m2）記錄視網(wǎng)膜電圖，包括暗適應(yīng)視網(wǎng)膜a、b波振幅和潛時(shí)，然后記錄振蕩電位（Oscillatory potentials,OPs）。暗適應(yīng)閃光視網(wǎng)膜電圖記錄完成之后，進(jìn)行10 min的明適應(yīng)，再記錄明適應(yīng)條件下不同刺激強(qiáng)度下（-0.699、-0.201、0.301、0.799、1.301 log cd·s/m2）視網(wǎng)膜a、b波振幅和潛時(shí)及OPs。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1.眼球各組織中Vip和Vipr2的mRNA表達(dá)情況Vip和Vipr2基因的RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。擴(kuò)增條帶大?。篤ip為343 bp；Vipr2為442 bp；Actb為487 bp。1，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，晶狀體；3，虹膜；4，視網(wǎng)膜；5，脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；6，角膜；7，鞏膜Figure 1.Vip and Vipr2 mRNA expression in ocular tissue.The agarose gel electrophoresis of Vip and Vipr2 for RT-PCR.Lengths of RT-PCR amplification product:Vip:343 bp;Vipr2:442 bp;Actb:487 bp.1,DNA molecular weight marker;2,lens;3,iris;4,retina;5,choroid+retinal pigment epithelium;6,cornea;7,sclera.

實(shí)驗(yàn)研究。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，以表示。小鼠左右眼屈光度比較使用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，若差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則以左右眼的平均值作為最終均值進(jìn)行后繼分析；Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠間的屈光度、DA及各類(lèi)氨基酸比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不同明暗適應(yīng)時(shí)，不同刺激強(qiáng)度下Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠間視網(wǎng)膜電生理數(shù)據(jù)比較采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vip和Vipr2在眼組織中表達(dá)情況

逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)顯示VipmRNA在小鼠視網(wǎng)膜中高表達(dá)，在脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、角膜和鞏膜也有表達(dá)，在虹膜和晶狀體未見(jiàn)表達(dá)（見(jiàn)圖1）；Vipr2mRNA在視網(wǎng)膜、虹膜、脈絡(luò)膜+視網(wǎng)膜色素細(xì)胞中均高表達(dá)，而在晶狀體、角膜和鞏膜中低表達(dá)（見(jiàn)圖1）。

2.2 Vipr2-KO小鼠表現(xiàn)為相對(duì)性近視

通過(guò)對(duì)Vipr2雜合子（Vipr2+/-）種鼠交配繁殖的后代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，成功鑒定并得到Vipr2敲除純合子（Vipr2-/-）、雜合子（Vipr2+/-）及WT（Vipr2+/+）小鼠（見(jiàn)圖2A）。對(duì)4周齡的Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠的屈光度進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Vipr2-KO小鼠相比Vipr2-WT小鼠，屈光明顯向近視漂移（t=2.51，P=0.017），見(jiàn)圖2B。

圖2.Vipr2敲除純合子、雜合子和野生型小鼠基因型鑒定圖及4周齡時(shí)屈光狀態(tài)A：基因型鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。-/-：純合子；+/-：雜合子：+/+：野生型；B：Vipr2敲除（n=24）和野生型（n=24）小鼠4周齡的屈光狀態(tài)。a，Vipr2敲除和野生型小鼠比較，P=0.017Figure 2.Genotyping of Vipr2 homozygote,heterozygote and wildtype mice.A:Electrophoresis of PCR amplification product for genotyping of Vipr2 knockout mice and wildtype counterparts.-/-,Homozygote;+/-,Heterozygote;+/+,Wildtype.B:The refractive status of Vipr2 knockout mice (n=24) and wildtype (n=24) counterparts at age 4 weeks.a,comparison between Vipr2 knockout and wildtype mice,P=0.017.

2.3 Vipr2-KO小鼠視網(wǎng)膜DA含量變化

4 周 齡Vipr2-KO小鼠與Vipr2-WT小鼠相比，視網(wǎng)膜DA 含量為（0.284±0.019）ng/mgvs.（0.191±0.020）ng/mg（以視網(wǎng)膜重量進(jìn)行校正），Vipr2-KO小鼠視網(wǎng)膜DA含量明顯增加（t=3.42，P=0.001，見(jiàn)圖3A）；而DOPAC含量為（0.082±0.008）ng/mgvs.（0.062±0.005）ng/mg，HVA含量為（0.050±0.004）ng/mgvs.（0.035±0.002）ng/mg，Vipr2-KO小鼠視網(wǎng)膜DOPAC、HVA含量明顯高于Vipr2-WT小鼠（t=2.15，P=0.037；t=3.27，P=0.002，見(jiàn)圖3A），但Vipr2-KO小鼠與Vipr2-WT小鼠間的DOPAC/DA 比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.97，P=0.058，見(jiàn)圖3A）。視網(wǎng)膜中未檢測(cè)出NE。

玻璃體液中，Vipr2-KO小鼠與Vipr2-WT小鼠DA含量分別為（0.015±0.001）ng/μl、（0.018±0.001）ng/μl；DOPAC含量分別為（0.030±0.002）ng/μl、（0.032±0.002）ng/μl；DOPAC/DA比值分別為2.274±0.166、2.092±0.152。2種小鼠間DA、DOPAC、DOPAC/DA、NE、HVA含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.01～1.37，P＞0.05，見(jiàn)圖3B）。視網(wǎng)膜和玻璃體液中的氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gln、Gly、Tau、GABA）含量在Vipr2-KO小鼠與Vipr2-WT小鼠之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.21～6.45，P＞0.05，見(jiàn)圖3C-D）。

圖3.Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠視網(wǎng)膜和玻璃體液DA、DOPAC及各氨基酸含量比較A：視網(wǎng)膜中DOPAC、DA、HVA含量和DOPAC/DA比值；B：玻璃體液中DOPAC、DA、NE、HVA含量和 DOPAC/DA比值；C、D：分別為視網(wǎng)膜、玻璃體液中Asp、Glu、Ser、Gln、Gly、Tau和GABA含量比較。Vipr2-KO小鼠和Vipr2-WT小鼠各24只。DOPAC，3,4-二羥基苯乙酸；DA，多巴胺；HVA，高香草酸；NE，去甲腎上腺素；Asp，天冬氨酸；Glu，谷氨酸；Ser，絲氨酸；Gln，谷氨酰胺；Gly，甘氨酸；Tau，?；撬?；GABA，γ氨基丁酸。a，Vipr2-KO小鼠與Vipr2-WT小鼠DOPAC比較，P=0.037；b，Vipr2-KO小鼠與Vipr2-WT小鼠DA比較，P=0.0013；c，Vipr2-KO小鼠與Vipr2-WT小鼠HVA比較，P=0.002Figure 3.DA,DOPAC,and amino acid contents in the retina and vitreous body for Vipr2 knockout (Vipr2-KO) and Vipr2 wildtype (Vipr2-WT) mice at age 4 weeks.A:DOPAC,DA,and HVA contents and DOPAC/DA ratio in the retina in Vipr2-KO and Vipr2-WT mice.B:DOPAC,DA,NE,and HVA contents,and DOPAC/DA ratio in the vitreous body.C-D:Asp,Glu,Ser,Gln,Gly,Tau,and GABA contents in the retina and vitreous body.Vipr2-KO (n=24) and Vipr2-WT (n=24).DOPAC,3,4-dihydroxyphenylacetate;DA,dopamine;HVA,homovanillic acid;NE,norepinephrine;Asp,aspartic acid;Glu,glutamic acid;Ser,serine;Gln,glutamine;Gly,glycine;Tau,taurine;GABA,γ-aminobutyric acid.a,comparison of DOPAC content between Vipr2-KO and Vipr2-WT mice,P=0.037;b,comparison of DA content between Vipr2-KO and Vipr2-WT mice,P=0.0013;c,comparison of HVA content between Vipr2-KO and Vipr2-WT mice,P=0.002.

2.4 Vipr2-KO小鼠視網(wǎng)膜電生理檢測(cè)結(jié)果

暗適應(yīng)條件下，4周齡Vipr2-KO小鼠b波振幅與Vipr2-WT小鼠相比，明顯增加（F=8.65，P=0.015），而a波差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.23，P=0.639）；明適應(yīng)條件下，Vipr2敲除小鼠a、b波與野生型小鼠相比，振幅差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.99，P=0.081；F=4.75，P=0.054）。暗適應(yīng)條件下2 種小鼠間OPs振幅（F=2.00，P=0.187）及a、b波潛時(shí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.01，P=0.918；F=2.48，P=0.146）。見(jiàn)圖4。

3 討論

RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎16d（E16）即可見(jiàn)VIPR2 在視神經(jīng)母細(xì)胞層表達(dá)[17]，出生后6～7 d時(shí)全視網(wǎng)膜均有表達(dá)，且在內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層高表達(dá)，說(shuō)明VIPR2 在視網(wǎng)膜早期發(fā)育中就發(fā)揮作用。免疫熒光及免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VIPR2 主要在雞[4,18]視網(wǎng)膜（光感受器外節(jié)、內(nèi)叢狀層）和脈絡(luò)膜上表達(dá)。本研究通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步明確了VIPR2在成年小鼠視網(wǎng)膜、虹膜、脈絡(luò)膜+視網(wǎng)膜色素細(xì)胞、晶狀體、角膜和鞏膜中均有表達(dá)，提示這些組織部位均可能為VIPR2的作用靶點(diǎn)。

圖4.明暗適應(yīng)條件下Vipr2-KO和Vipr2-WT同窩仔小鼠在不同強(qiáng)度光刺激時(shí)a、b波和振蕩電位的變化A：暗適應(yīng)時(shí)Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠a、b波的波幅；B：明適應(yīng)時(shí)Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠a、b波的波幅；C：暗適應(yīng)時(shí)Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠振蕩電位；D：暗適應(yīng)時(shí)Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠a、b波潛時(shí)。Vipr2-KO小鼠和Vipr2-WT小鼠各6只。a，Vipr2-KO和Vipr2-WT小鼠b波比較，P=0.015Figure 4.The amplitude of a and b waves,and oscillation potential (OPs) in scotopic and photopic adaptation for Vipr2 knockout (Vipr2-KO) and Vipr2 wildtype (Vipr2-WT) mice at age 4 weeks.A:The amplitudes of a and b waves in scotopic adaptation.B:Amplitudes of a and b waves in photopic adaptation.C:Amplitude of oscillation potential in scotopic adaptation.D:Implicit time of a and b waves in scotopic adaptation.Vipr2-KO mice (n=6) and Vipr2-WT mice (n=6) were used.a,comparison of amplitude of the b wave between Vipr2-KO and Vipr2-WT mice,P=0.015.ERG,electroretinogram.

正常生理狀態(tài)下，機(jī)體受各種生理節(jié)律的調(diào)控。神經(jīng)中樞具有整體調(diào)控的節(jié)律時(shí)鐘，而各器官和組織也有自身內(nèi)在的節(jié)律調(diào)控機(jī)制。如視網(wǎng)膜有內(nèi)在的節(jié)律調(diào)控時(shí)鐘基因表達(dá)，如褪黑素受體（MTNR1A、MTNR1B）、黑視蛋白（OPN4）、周期基因（PER1、PER2）、VIP及受體VIPR1、VIPR2等，這些節(jié)律基因可以調(diào)控視網(wǎng)膜節(jié)律并影響視網(wǎng)膜生理功能。文獻(xiàn)報(bào)道光照晝夜節(jié)律紊亂與近視有關(guān)[19]；Zhou等[20]改變小鼠光照/黑暗節(jié)律，2周后發(fā)現(xiàn)18 h光照/6 h黑暗節(jié)律循環(huán)明顯使小鼠屈光向近視方向漂移，因此他們認(rèn)為光/暗循環(huán)變化可能改變節(jié)律基因表達(dá)而影響小鼠正常屈光發(fā)育。目前大量文獻(xiàn)已證實(shí)VIPR2可調(diào)控機(jī)體的生理節(jié)律[15,21-22]，VIPR2 已明確影響到正常屈光發(fā)育[3]。視網(wǎng)膜DA含量受晝夜等生理節(jié)律調(diào)控并已明確其參與屈光發(fā)育。本研究對(duì)Vipr2敲除小鼠視網(wǎng)膜和玻璃體液中的DA等神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，只發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中的DA、DOPAC、HVA含量明顯升高而玻璃體液中無(wú)變化。由于DA在細(xì)胞內(nèi)合成后分泌到細(xì)胞外才能發(fā)揮生理作用，視網(wǎng)膜DA反映其胞內(nèi)非活性總水平及合成能力，而分泌到細(xì)胞外（玻璃體）中的DA反映其發(fā)揮生物學(xué)活性作用的部分，玻璃體DA含量高低反映了視網(wǎng)膜DA的分泌能力。DOPAC、HVA則為DA主要代謝產(chǎn)物，反映DA代謝利用能力。本研究結(jié)果說(shuō)明Vipr2敲除可影響到視網(wǎng)膜（胞內(nèi)）DA的合成與代謝，但未影響到視網(wǎng)膜DA分泌功能（胞外玻璃體液中DA水平未變化）。文獻(xiàn)報(bào)道近視狀態(tài)下視網(wǎng)膜DA含量明顯降低[11,23]，但也有研究發(fā)現(xiàn)近視后DA含量并沒(méi)有變化[16,24]或者增加[25]。本研究發(fā)現(xiàn)Vipr2敲除導(dǎo)致小鼠表現(xiàn)為相對(duì)近視，DA含量升高，Vipr2敲除如何導(dǎo)致DA升高的具體機(jī)制目前并不清楚，還有待進(jìn)一步闡明。Luo等[25]對(duì)豚鼠利用閃爍光誘導(dǎo)近視，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜及玻璃體液中DA含量升高，但形覺(jué)剝奪近視豚鼠的DA卻降低，提示不同的誘導(dǎo)條件可能觸發(fā)的近視信號(hào)通路及機(jī)制可能不同，導(dǎo)致DA變化不一致。DA通過(guò)與DA受體結(jié)合發(fā)揮生理作用，DA激活不同的DA受體發(fā)揮的生理學(xué)并不相同，如多巴胺受體DRD1與DRD2在近視中發(fā)揮相反作用[12]，這些研究結(jié)果表明DA及受體在屈光發(fā)育及近視形成中的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，VIPR2是如何影響DA并參與近視的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究來(lái)明確。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠形覺(jué)剝奪1、2 d后VIP mRNA表達(dá)明顯下降，而形覺(jué)剝奪1、2、4周后卻沒(méi)有差異[3]，提示VIP-VIPR2信號(hào)軸在近視早期發(fā)揮作用。近視過(guò)程中視網(wǎng)膜電生理會(huì)發(fā)生異常變化，視網(wǎng)膜光感受器異常會(huì)引起電生理a波變化，而雙極細(xì)胞功能受損則影響b波。本課題組前期已對(duì)7 周齡Vipr2-KO小鼠視網(wǎng)膜電生理進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在暗適應(yīng)時(shí)a波和b波振幅較野生型對(duì)照明顯升高[3]。為明確Vipr2是否在更早時(shí)間點(diǎn)就已經(jīng)影響視網(wǎng)膜功能，本研究選取了4周齡Vipr2-KO小鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜電生理檢測(cè)，同樣也發(fā)現(xiàn)暗適應(yīng)時(shí)b波振幅升高，提示Vipr2在小鼠發(fā)育早期（4周齡）已影響視網(wǎng)膜功能。文獻(xiàn)報(bào)道Drd1、Drd2、Aplp2敲除影響屈光發(fā)育產(chǎn)生近視或遠(yuǎn)視表型[26-27]，同時(shí)Drd2-KO小鼠伴隨著a、b波波幅明顯升高，而Drd1-KO和Aplp2-KO小鼠b波的波幅明顯下降，提示不同的基因功能喪失可產(chǎn)生不同的視網(wǎng)膜電生理a、b波變化；雙極細(xì)胞ON（Nyx-/-）[28]和OFF通路（Vsx1-/-）[24]失活也影響小鼠屈光發(fā)育并伴隨b波明顯下降或消失。這也提示雙極細(xì)胞引起的電生理異常影響正常屈光發(fā)育。本課題組前期通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)Vipr2主要表達(dá)在視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞[3]，小鼠形覺(jué)剝奪眼視網(wǎng)膜中Vipr2+雙極細(xì)胞功能明顯受到抑制，使cAMP信號(hào)通道明顯下調(diào)，這些均提示VIPR2主要通過(guò)調(diào)控視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞而發(fā)揮作用，如本研究中引起視網(wǎng)膜電生理b波變化。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Vipr2-KO小鼠在4周齡時(shí)呈近視表型，能引起視網(wǎng)膜DA含量增加，并伴隨視網(wǎng)膜電生理功能異常。由此推測(cè)VIPR2可影響視網(wǎng)膜DA合成與代謝但并不是直接通過(guò)調(diào)控DA導(dǎo)致近視，有可能是通過(guò)影響視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞電生理功能參與近視形成，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突申明 本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 趙福新：收集數(shù)據(jù)；參與選題、設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋?zhuān)蛔珜?xiě)論文；修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論；根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行核修。汪琪、王莉、陽(yáng)凡、鄭陽(yáng)洋、趙晨琛、朱禾：收集數(shù)據(jù)；參與選題、設(shè)計(jì)及資料分析。周翔天、瞿佳：參與課題思路設(shè)計(jì)，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行核修