李建棣，楊麗樺，何融泉，賴倩瑤，陳思智，陳傳良，李建軍，陳祖軒

2020年全球癌癥統(tǒng)計資料顯示，胃癌（GC）死亡率與發(fā)病率分別位列第四和第五［1］，已成為人類健康的主要威脅之一。胃癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療以及化療等，免疫治療、分子靶向治療和新輔助放化療聯(lián)合治療方案也使得部分患者獲益［2-4］。但胃癌起病隱匿，許多患者確診時已進入晚期并伴有廣泛轉(zhuǎn)移，其臨床管理仍不容樂觀［5］。因此，為推動胃癌早期診斷和靶向治療的發(fā)展，進一步探索胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制并尋找更為有效的診斷標志物和分子靶點勢在必行［6］。

CEACAM6（CEA cell adhesion molecule 6）與多種癌癥的發(fā)生和進展均密切相關(guān)。有研究指出，CEACAM6可通過激活相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)基因，增強細胞轉(zhuǎn)錄功能，從而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［7］。K?niger等人［8］研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌可通過HopQCEACAM相互作用實現(xiàn)細胞毒素相關(guān)抗原A轉(zhuǎn)移，由此促進胃腺癌發(fā)生發(fā)展。Zang等［9］針對CEACAM6過表達對胃癌細胞中Akt磷酸化水平的影響進行了研究，推測CEACAM6可以通過激活胃癌PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進胃癌進展。同時，Zang團隊［10］還研究發(fā)現(xiàn)CEACAM6也可能通過促進FAK磷酸化來促使胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。不僅如此，CEACAM6還有助于癌癥患者的預(yù)后評估。譬如，Maraqa、Kobayashi等人［11，12］就分別證實了CEACAM6高表達與乳腺癌、肺腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，這也為CEACAM6作為癌癥復(fù)發(fā)預(yù)測指標應(yīng)用于胃癌等其他惡性腫瘤的預(yù)后評估提供了更多可能性。更為重要的是，CEACAM6有望成為癌癥的潛在治療靶點。Pandey團隊［13］發(fā)現(xiàn)CEACAM6敲除可通過改變免疫環(huán)境、胰腺導(dǎo)管腺癌線粒體功能等途徑抑制腫瘤生長，由此設(shè)想CEACAM6可作為癌癥的新型治療靶標。然而，CEACAM6在胃癌進展中飾演的角色錯綜復(fù)雜，迄今為止，其分子機制尚未明了。

因此，本研究旨在探索CEACAM6在全球1531例胃腺癌組織樣本的表達水平，初步評估CEACAM6表達的潛在臨床價值，并分析其共表達基因在胃癌中的潛在分子機制，為推動胃癌發(fā)病機制的研究及精準防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 CEACAM6在胃癌中的mRNA表達水平與潛在臨床價值

1.1.1 胃癌中CEACAM6 mRNA表達數(shù)據(jù)與蛋白表達數(shù)據(jù)準備 基于GEO、TCGA生物醫(yī)學(xué)公共數(shù)據(jù)庫對2021年3月1日前提交的胃癌基因芯片和高通量測序數(shù)據(jù)進行檢索，其關(guān)鍵詞如下：“（stomach OR gastric）AND（cancer OR carcinoma OR tumor OR neoplasm*OR malignan*）”。納入標準：①標本須為人體組織，而非細胞系；②數(shù)據(jù)集應(yīng)同時包含胃癌和癌旁組織或正常胃組織，且樣品總數(shù)不少于3；③患者術(shù)前未接受化療、放療等任何輔助治療。從Xena下載TCGA胃癌測序數(shù)據(jù)并進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換。通過The Human Protein Atlas了解CEACAM6蛋白表達水平。

1.1.2 胃癌中CEACAM6表達與臨床參數(shù)的關(guān)系從Xena中獲取TCGA胃癌測序數(shù)據(jù)匹配的臨床病理資料（如年齡、分期、腫瘤分化程度、腫瘤有無轉(zhuǎn)移等）并根據(jù)相應(yīng)的臨床參數(shù)將患者分為不同組別。應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗評估CEACAM6 mRNA在不同臨床病理參數(shù)特征胃癌人群中的表達情況。

1.1.3 CEACAM6在胃癌中的預(yù)后價值 以CEACAM6中位表達值為界將TCGA胃癌患者分為CEACAM6高表達組與CEACAM6低表達組，繪制KM曲線與timeROC曲線以判斷CEACAM6表達高低程度對患者預(yù)后的影響。

1.2 CEACAM6在胃癌中的生物學(xué)功能與潛在分子機制

1.2.1 胃癌差異表達基因與CEACAM6相關(guān)基因的鑒定 基于納入的基因芯片與高通量測序數(shù)據(jù)，用limma-voom程序包計算獲取胃癌差異表達基因（DEG），其滿足|log2FoldChange|＞3且P.adjusted＜0.05。根據(jù)其中位表達值將胃癌患者分為CEACAM6高表達組和CEACAM6低表達組，應(yīng)用DESeq2和tidyverse程序包計算獲取差異表達的CEACAM6相關(guān)基因，滿足|log2FoldChange|＞1且P.adjusted＜0.05。

1.2.2 基因富集分析與蛋白相互作用分析 應(yīng)用ClusterProfiler程序包對胃癌差異表達CEACAM6相關(guān)基因進行功能富集分析。進而選取富集的前10條KEGG通路構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape的CytoHubba插件鑒定PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因。

1.3 胃癌CEACAM6及其相關(guān)樞紐基因初步驗證和遺傳改變

基于TCGA胃癌測序數(shù)據(jù)，采用Pearson檢驗分析樞紐基因與CEACAM6之間的表達相關(guān)性，并利用ROCR程序包繪制ROC曲線以評估CEACAM6相關(guān)樞紐基因區(qū)分胃癌組織和正常組織的特異性及敏感性。應(yīng)用GEPIA驗證樞紐基因在胃癌中的表達水平及其對胃癌患者預(yù)后的影響。

基于cBioPortal TCGA胃腺癌（TCGA，F(xiàn)irehose Legacy）（http：//cBioportal.org）數(shù)據(jù)，研究胃癌患者CEACAM6和樞紐基因的突變類型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

為評價CEACAM6在胃癌和正常樣品中的表達差異情況，首先運用Graphpad Prism v8.0繪制小提琴圖，比較兩組間基因表達量的差異。進而以SPSS v23.0對納入的數(shù)據(jù)集進行兩獨立樣本t檢驗，計算CEACAM6 mRNA表達的例數(shù)、平均值和標準差，最后匯總為標準化平均差（SMD）。通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線與sROC曲線，評估CEACAM6甄別胃癌患者的潛在臨床價值。

2 結(jié)果

2.1 全球胃癌基因芯片及高通量測序數(shù)據(jù)納入情況

本研究最終從GEO與TCGA數(shù)據(jù)庫納入了24個含有CEACAM6表達值的胃癌數(shù)據(jù)集（表1）。所納入的數(shù)據(jù)集包含了來自阿根廷、韓國、羅馬尼亞、美國、日本、新加坡、雅典、意大利和中國這9個國家的1531例胃癌組織樣本及686例正常胃組織樣本。

2.2 CEACAM6 mRNA在胃癌組織中呈顯著高表達

CEACAM6 mRNA表達水平的小提琴圖結(jié)果顯示，CEACAM6在全球胃癌數(shù)據(jù)中呈現(xiàn)高表達趨勢（圖1）。單個ROC曲線圖提示CEACAM6 mRNA表達對胃癌及正常胃組織的鑒別能力為中等水平（圖2，表2）。

表2 CEACAM6對胃癌潛在鑒別價值的評估

圖1 基于全球基因芯片及測序數(shù)據(jù)呈現(xiàn)CEACAM6 mRNA在胃癌組織中的高表達水平

圖2 全球基因芯片及測序數(shù)據(jù)集中CEACAM6 mRNA表達對胃癌及正常胃組織的鑒別能力

更進一步地，表達值標準化平均差整合分析結(jié)果表明，與正常胃組織相比，CEACAM6 mRNA在胃癌中被顯著上調(diào)［SMD=0.72（0.47~0.97）］（圖3A）；且CEACAM6表達值對胃癌與正常胃組織具有中等區(qū)分度［AUC=0.82（0.78~0.85）；敏感性=0.69（0.61~0.76）；特異性=0.82（0.73~0.88）］（圖3B）。因此，CEACAM6 mRNA在胃癌中被顯著上調(diào)并且對胃癌有中度區(qū)分能力。

圖3 全球基因芯片及測序數(shù)據(jù)集整合分析提示高表達的CEACAM6對胃癌具有中等區(qū)分能力 A：與正常胃組織相比，CEACAM6 mRNA在胃癌中顯著上調(diào)；B：CEACAM6表達值對胃癌與正常胃具有中等區(qū)分度

2.3 基于The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫挖掘CEACAM6蛋白表達水平

為從蛋白水平驗證CEACAM6在胃癌中的表達狀況，本研究基于The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫對其蛋白表達水平進行了比較。免疫組化染色結(jié)果顯示（圖4A~D），CEACAM6在胃腺癌組織中的表達明顯增強，且其陽性信號主要定位在細胞質(zhì)與細胞膜，并出現(xiàn)了細胞膜線性陽性反應(yīng)與細胞質(zhì)陽性反應(yīng)。

圖4 CEACAM6蛋白在胃癌組織中呈高表達 A、B：正常胃腺組織，患者編號：2411；腺細胞，染色：中等，強度：強，數(shù)量：＜25%，位置：細胞質(zhì)/膜。鏡下所見：細胞呈柱狀，排列規(guī)則整齊，胞膜光滑完整，胞質(zhì)染色較淺呈透明狀，胞核淺染呈淡藍色，內(nèi)有深藍色顆粒物，卵圓形胞核靠近基底部，細胞間連接緊密，胃小凹之間有微小的絨毛狀突起。C、D：胃腺癌組織，患者編號：2557；腫瘤細胞，染色：高，強度：強，數(shù)量：＞75%，位置：細胞質(zhì)/膜狀。鏡下所見：細胞形態(tài)不規(guī)則，異型性明顯，細胞間間隙縮小，出現(xiàn)了細胞聚集，細胞深染，部分細胞胞核不明顯，腺體結(jié)構(gòu)消失，部分細胞壞死脫落?？贵w：CAB008370；AC：低倍，B、D：高倍。數(shù)據(jù)來源：The Human Protein Atlas

2.4 CEACAM6表達與胃癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系

鑒于CEACAM6在胃癌組織中被上調(diào)，本研究進一步探究了CEACAM6與胃癌患者臨床病理參數(shù)的潛在聯(lián)系。統(tǒng)計結(jié)果表明，CEACAM6在胃癌組織中的表達水平較正常胃組織明顯升高（P＜0.05），且CEACAM6的表達在不同胃癌組織分級中有差異（P＜0.05）（G1：8.603±1.314vs.G3：5.929±2.710，組內(nèi)多重比較P=0.008），但在不同分期及年齡中表達則無明顯差異（P≥0.05）（表3）。但timeROC曲線及K-M曲線結(jié)果皆提示CEACAM6表達程度對胃癌患者的預(yù)后無顯著影響。

表3 CEACAM6的表達與胃腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5 CEACAM6共表達基因富集與通路分析

本研究共獲取胃癌差異表達的CEACAM6共表達基因550個，通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)其主要參與了“肌肉系統(tǒng)過程”“中間絲細胞骨架”“金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運活性”等生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，CEACAM6及其共表達基因主要聚集在“胰腺分泌”“神經(jīng)活性配體-受體相互作用”等通路上（圖5）。

圖5 CEACAM6相關(guān)基因功能富集分析 A：GO富集分析生物學(xué)過程氣泡圖；B：GO富集分析細胞組分氣泡圖；C：GO富集分析分子功能氣泡圖；D：京都基因與基因組百科全書富集分析通路氣泡圖

表1全球胃癌基因芯片及TCGA測序數(shù)據(jù)集中CEACAM6 mRNA的表達情況

2.6 CEACAM6共表達基因編碼蛋白相互作用分析

為進一步探究CEACAM6共表達基因在胃癌中的潛在機制，本研究構(gòu)建差異表達的CEACAM6相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)（圖6A），其中SPRR1B、SPRR1A等蛋白與其他多個節(jié)點間存在相互作用（圖6B），因此，我們可初步認為這些節(jié)點在CEACAM6 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中處于核心地位。通過運用GEPIA2對CEACAM6前10個樞紐共表達基因進行驗證并做Pearson相關(guān)性分析，只有在胃癌中差異表達并且與CEACAM6存在正相關(guān)關(guān)系的基因才最終被確認為CEACAM6在胃癌中的共表達基因，結(jié)果顯示僅SPRR3滿足以上條件（圖6C，圖6D）。本研究還探索了SPRR3表達水平對胃癌患者預(yù)后的影響，然而其結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義，故未展示，這提示SPRR3表達程度可能與胃癌的預(yù)后無關(guān)。

2.7 CEACAM6和SPRR3在胃癌中的遺傳改變

體細胞突變分析結(jié)果顯示，CEACAM6與其相關(guān)樞紐基因SPRR3的主要突變類型均為擴增突變（圖6E），且各自突變率相仿（分別為2.7%、3%）。有趣的是，CEACAM6與SPRR3突變呈現(xiàn)明顯互斥性。

圖6 CEACAM6共表達基因網(wǎng)絡(luò)樞紐基因的鑒定 A：CEACAM6共表達基因蛋白交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；B：CEACAM6共表達基因蛋白交互網(wǎng)絡(luò)中的前10個樞紐基因（從紅色至黃色：評分由高到低）；C：CEACAM6與SPRR3樞紐基因表達水平呈顯著正相關(guān)；D：基于基因表達譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫，SPRR3樞紐基因在TCGA胃腺癌中的表達被顯著下調(diào)；E：擴增突變?yōu)镃EACAM6及其SPRR3樞紐基因最常見的突變類型，CEACAM6與SPRR3突變表現(xiàn)出明顯互斥性

3 討論

CEACAM6是一種細胞黏附分子，其參與正常組織結(jié)構(gòu)和細胞極性的形成與維持。CEACAM6表達異常不僅可抑制細胞分化和細胞極化，還可引起組織結(jié)構(gòu)的破壞。CEACAM6過表達可通過改變細胞間黏附性而參與腫瘤的侵襲和發(fā)展，這成為一些侵襲性腫瘤細胞的獲得性優(yōu)勢之一［14］。不受調(diào)控的CEACAM6過表達與腫瘤的多種特征相關(guān)，包括不受控制地增殖、無菌斑抗性、新生血管生成、免疫逃避、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等［15］。雖然已有部分研究報道了CEACAM6可參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其確切的分子機制迄今為止仍未能完全闡明。在本研究中，為驗證CEACAM6在胃癌組織中的表達水平及其潛在的臨床應(yīng)用價值，作者利用全球胃癌數(shù)據(jù)集對CEACAM6的表達情況、甄別能力進行了整合分析，并進一步探究了CEACAM6在胃癌中的潛在共表達機制。

CEACAM6在胃癌中被顯著上調(diào)。作為一項多中心研究，本研究總共納入了來自9個不同的國家的1531例胃癌組織樣本及686例正常胃組織樣本，從而更有說服力地印證了CEACAM6在mRNA水平的高表達趨勢。此外，CEACAM6在胃癌患者中的潛在臨床價值也被充分挖掘，本研究提示CEACAM6有一定潛力作為鑒定胃癌組織和正常組織的分子指標。

在本研究中，作者初步探索了CEACAM6在胃癌中的可能作用機制。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，CEACAM6與其共表達基因主要參與“肌肉系統(tǒng)過程”“中間絲細胞骨架”“金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運活性”等生物學(xué)過程、細胞成分和分子功能，這表明CEACAM6可能與其共表達基因相互作用，共同參與胃癌細胞骨架和金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運活性的調(diào)控。Hong等［16］人曾指出，異常高表達的microRNA-550a可通過調(diào)節(jié)肌肉系統(tǒng)過程參與食管癌的發(fā)生發(fā)展［16］。此外，Qiu等［17］人通過研究肌球蛋白輕鏈9（myosin light chain 9，MYL9）和鈣聯(lián)蛋白1（calponin，CNN1）與大腸癌復(fù)發(fā)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MYL9和CNN1在“肌肉系統(tǒng)過程”和“細胞骨架蛋白結(jié)合”中富集，且其高表達與大腸癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。以上研究均提示“肌肉系統(tǒng)過程”可能與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。因此，我們通過GO分析發(fā)現(xiàn)胃癌中CEACAM6及其共表達基因主要參與了肌肉系統(tǒng)過程，這有可能進一步支持了CEACAM6與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的假設(shè)。

本研究還對CEACAM6共表達樞紐基因進行探究，并發(fā)現(xiàn)角質(zhì)蛋白β抗體（small proline rich protein 3，SPRR3）可能是CEACAM6的共表達基因。SPRR3是表皮分化復(fù)合體的成員，定位于線粒體，并與Bcl2相互作用，SPRR3的增強表達可使癌細胞對線粒體外膜電位（Momp）喪失敏感性，從而導(dǎo)致DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡［18］。與SPRR3相似，CEACAM6可使MOMP降低的同時增加一種名叫palladin的肌動蛋白結(jié)合蛋白的表達，由此介導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAF）的分化［13］。以上研究提示，CEACAM6與SPRR3在癌癥中可能起到協(xié)同促癌作用。更有趣的是，作者通過在線分析發(fā)現(xiàn)，SPRR3與CEACAM6在胃癌中的遺傳變異率均相近，并且存在明顯的突變互斥性，這進一步提示二者之間可能存在功能協(xié)同或是補充關(guān)系。然而，以上假說有待進一步論證。

總之，CEACAM6在胃癌中顯著高表達，其可能作為促癌基因推動胃癌的發(fā)生發(fā)展。然而，本研究僅通過計算病理學(xué)方法對CEACAM6的分子機制展開了初步分析，更多機理有待實驗進一步佐證。