王小娟，黃雨娜，姚偉城，浮鈺，岑美鳳

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤或癌癥干細(xì)胞存在的細(xì)胞環(huán)境。腫瘤生長或轉(zhuǎn)移的時(shí)候，腫瘤細(xì)胞所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，亦與腫瘤細(xì)胞自身的胞內(nèi)基質(zhì)和胞外基質(zhì)有關(guān)［1］。腫瘤細(xì)胞的自分泌、旁分泌均可改變和維持自身生存微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展［2］；有研究表明脂肪細(xì)胞分泌的激素、生長因子等可以通過旁分泌的形式進(jìn)入血液，進(jìn)而遠(yuǎn)程影響食管癌、肺癌等惡性腫瘤的能量代謝等相關(guān)活動(dòng)［3］。分泌蛋白質(zhì)組（secreted protein）包括細(xì)胞生長和趨化因子、激素和促激素、消化酶和合成酶、抗體和胞外毒素等功能各異的蛋白，與細(xì)胞粘連、轉(zhuǎn)移、分化、增殖和免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)［4］。分泌蛋白已成為潛在腫瘤標(biāo)志物的主要來源［5-10］。因此，利用分泌蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞分泌物進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，不僅有助于全面理解、認(rèn)識(shí)、分析與解釋惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于腫瘤標(biāo)志物的篩選，腫瘤的早期診斷、監(jiān)測、治療及抗腫瘤藥物的研發(fā)等也具有重要指導(dǎo)意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠?qū)δ骋换蛩磉_(dá)的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)及其特征進(jìn)行系統(tǒng)化研究，其高通量的特點(diǎn)［11］能夠在蛋白質(zhì)水平上解釋復(fù)雜的生命活動(dòng)分子網(wǎng)絡(luò)［12］。目前，該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于藥物合成與研發(fā)、藥物藥理和毒理學(xué)、疾病致病機(jī)理和治療機(jī)理研究、臨床生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。在系統(tǒng)生物學(xué)中［13］，蛋白質(zhì)組學(xué)的變化是生物體受基因遺傳、自身疾病以及外部環(huán)境等干擾后中間體的應(yīng)答反應(yīng)，分析在生物體的體液、細(xì)胞、組織或器官中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這些蛋白經(jīng)基因組轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄組翻譯和翻譯后修飾的相關(guān)信息，有利于我們從蛋白質(zhì)水平上解釋生物體對(duì)外界干擾后產(chǎn)生的反應(yīng)機(jī)制。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)基中，被細(xì)胞分泌出的蛋白質(zhì)［14］，由于豐度較低且受到血清干擾等因素，為此類樣本的蛋白質(zhì)提取和分析帶來了諸大的困難。

脂肪細(xì)胞是一種存在于許多不同組織中的基質(zhì)細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著積極作用，可通過分泌蛋白促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲［15］。據(jù)報(bào)道，脂肪細(xì)胞分泌因子會(huì)影響乳腺癌的微環(huán)境，進(jìn)而增加乳腺癌的發(fā)病、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的概率［16］；脂肪細(xì)胞分泌含有circ-DB的外泌體調(diào)控肝細(xì)胞癌（HCC）的去泛素化，促進(jìn)細(xì)胞的增殖［17］；胰腺癌（PC）細(xì)胞的外泌體可以激活脂肪細(xì)胞，使其通過外泌因子IL-1b去分化來反過來維持PC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［18］；脂肪細(xì)胞谷氨酰胺合成酶的異常分泌與結(jié)腸癌的腹腔轉(zhuǎn)移及腫瘤的血管生成密切相關(guān)［19］。諸如上述可知，脂肪細(xì)胞對(duì)于腫瘤微環(huán)境和腫瘤生長轉(zhuǎn)移具有重要的影響。

本研究將選用經(jīng)藥物處理后小鼠皮下脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行脂肪細(xì)胞的分泌型蛋白質(zhì)鑒定。由于分泌型蛋白的含量較低、存在基質(zhì)環(huán)境復(fù)雜，本文將分別探討4D-Faims-OTIT、ETD-OTIT、OTIT三種采集方法對(duì)小鼠皮下脂肪組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)基這一研究模型的蛋白質(zhì)組進(jìn)行解析，為外泌型低豐度蛋白質(zhì)的鑒定和分析提供有效、高靈敏的檢測方法，以輔助研究相關(guān)腫瘤的預(yù)防、臨床診斷、治療新方向。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

丙酮（A949，ThermoFisher），BCA蛋白定量試劑盒（23227，ThermoFisher），細(xì)胞培養(yǎng)基，乙醇（459828，2 L，Sigma），UA buffer（U820349，Sigma，8 M、PH 8.5），二硫蘇糖醇溶液（D9779-1g，Sigma，質(zhì)譜水配母液），碘乙酰胺溶液（V900335-5G，Sigma，50 mM碳酸氫銨配母液），胰蛋白酶Trypsin溶液（V5280，Promega，50 mmol/L乙酸復(fù)溶至1μg/μL），三 氟 乙 酸（85183，ThermoFisher），SPE萃 取 柱（186000383，Waters），恒溫?fù)u勻儀（thermomixer C，Eppendorf），肽段定量試劑盒（23275，ThermoFisher），液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（Easy-nLC 1200 Orbitrap Fusion，ThermoFisher）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白提取 C57/B6小鼠皮下脂肪組織S-FA7消化后提取的原代細(xì)胞擴(kuò)增后，用1%FBS加入到DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)用2種不同藥物處理方式得到S1組和S2組，每組各3份生物學(xué)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)基上清至50 mL離心管，置于-80℃中冷凍成塊狀后，轉(zhuǎn)移到-80℃中真空濃縮成干粉。稱取1 mg的凍干粉，加入100μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液復(fù)溶，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取相當(dāng)于50μg蛋白至新的1.5 mL離心管中，用50 mmol/L NH4HCO3補(bǔ)足至100μL，加入四倍體積的冰冷丙酮，渦旋后放于-20℃中過夜沉淀蛋白。

1.2.2 蛋白酶解 將-20℃過夜沉淀的蛋白，置于15 000×g，4℃下離心30 min，棄上清，交替使用500μL冰冷的丙酮溶液和500μL新鮮配制的70%乙醇溶液，分別清洗蛋白沉淀物，放置于15 000×g，4℃離心機(jī)下離心5 min，棄上清，置于-80℃凍干。加入50μL UA buffer，恒溫?fù)u勻儀（Eppendorf，thermomixer C）37℃、1300 r/min變性、溶解2 h。加入2μL二硫蘇糖醇溶液，在37℃、1300 r/min的條件下進(jìn)行2 h蛋白質(zhì)還原反應(yīng)。加入13μL碘乙酰胺溶液，放置于25°C，1300 r/min的條件下避光，進(jìn)行蛋白烷基化反應(yīng)45 min后，加入50 mmol/L NH4HCO3溶液至總體積600μL，再按1∶40（質(zhì)量比，酶：蛋白）加入胰蛋白酶溶液，在37℃、1300 r/min的條件下孵育16 h，用三氟乙酸溶液酸化終止反應(yīng)。

1.2.3 肽段脫鹽 完成酶解反應(yīng)后進(jìn)行脫鹽，步驟如下：活化和平衡SPE萃取柱（186000383，Waters），加入適量乙腈活化柱子，去濾液后，加入適量0.1%甲酸水溶液平衡柱子，去濾液。進(jìn)行載樣，每次取樣品200μL加入到柱子，直至全部樣品過完柱子；再次是脫鹽，加入200μL 0.1%甲酸水溶液洗脫柱子，去濾液，重復(fù)操作2次。最后樣品洗脫，分別取200μL 60%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）、80%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）、100%乙腈（0.1%甲酸）依次洗脫樣品（不可更換順序），重復(fù)操作2次，收集合并續(xù)濾液約1200μL，放置在真空濃縮儀中濃縮。

1.2.4 肽段檢測前復(fù)溶方法 加入15μL 0.1%甲酸水溶液進(jìn)行樣本復(fù)溶，渦旋5 min混勻，置于15 000 r/min，4℃下離心30 min。取上清使用肽段定量試劑盒（PierceTMQuantitative Colorimetric Peptide Assay，23275，thermo Invitrogen）進(jìn)行肽段濃度測試，并用0.1%甲酸水溶液稀釋樣品濃度至500 ng/μL。將稀釋后的樣品放在4℃的離心機(jī)中以15 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清轉(zhuǎn)至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行LC-MS/MS分析（ThermoFisher Easy-nLC 1200-Orbitrap Fusion三合一質(zhì)譜聯(lián)用分析儀）。

1.3 LC-MS檢測方法

使用非標(biāo)記定量方法（Label Free）對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白進(jìn)行分析，液相為Easy1200液相系統(tǒng)，填裝一體C18 Tip色譜分析柱（75μm×150 mm，11.9μm，廣州科福技術(shù)）；適配流動(dòng)相A：0.1%甲酸/水溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸、80%乙腈/水溶液，300 nL/min的流速，90 min梯度洗脫，洗脫比例如下：0~2 min，4%~8%B相；2~72 min，8%~28%B相；72~82 min，28%~38%B相；82~85 min，38%~100%B相；85~90 min，100%B相。

1.3.1 靜電場軌道阱線性離子阱模式（Orbitrap ion trap，OTIT）離子源的參數(shù)設(shè)置為：正模式電壓2100 V，毛細(xì)管溫度320℃，一級(jí)分辨率為6e5，掃描范圍為300~2000 m/z，采集模式是輪廓圖。二級(jí)質(zhì)譜的分辨率為1.5e5，四級(jí)桿的同位素隔離窗口是1.6 m/z，自動(dòng)增益控制standard，注入時(shí)間選用dynamic，碰撞池HCD，碰撞能量30 V，二級(jí)檢測器離子阱（Ion trap），采集模式是Centroid，循環(huán)掃描時(shí)間3 s。

1.3.2 電子轉(zhuǎn)移裂解-靜電場軌道阱線性離子阱模式（ETD-OTIT）基于OTIT模式下相同的離子源參數(shù)與一級(jí)Full MS參數(shù)，掃描范圍200~2000；循環(huán)掃描時(shí)間3 s，二級(jí)ddMS2 OT-EThcD和ddMS2 IT-HCD模式：OT-EThcD的參數(shù)是ETD反應(yīng)時(shí)間120 ms，最大注入時(shí)間150 ms，碰撞類型ETD疊加HCD，碰撞能量32%；ddMS2 IT-HCD模式的參數(shù)同OTIT模式一致。

1.3.3 梯度電壓補(bǔ)償-高場非對(duì)稱波形離子遷移譜-靜電場軌道阱線性離子阱模式（4D-Faims-OTIT）基于OTIT模式下相同的離子源參數(shù)與一級(jí)Full MS參數(shù)，增加4D-Faims組件，其參數(shù)設(shè)置Faims mode是Standard resolution，F(xiàn)aims Gas為0 L/min，三個(gè)一級(jí)Full MS-OT采集事件的Faims voltages為on，F(xiàn)aims CV值分別是-40 V、-60 V、-80 V；dd-MS2 IT-HCD模式的參數(shù)同OTIT模式一致。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Proteome Discoverer 2.4（PD）軟件對(duì)質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行定性統(tǒng)計(jì)分析。軟件檢索參數(shù)設(shè)定為：最大漏切位點(diǎn)為3、母離子質(zhì)量偏差為±10 ppm、固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化、可變修飾為甲基化、磷酸化（Phospho/+79.966Da）、糖基化（Glycosyl/+148.037 Da）、氧化（Oxidation/+15.995 Da）、琥珀?；⊿uccinyl/+100.016 Da）、賴氨酸乳酸化（Lactylation/+72.063 Da）和乙?；ˋcetyl/+42.011 Da，蛋白N端），使用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot-mouse-filtered-reviewed.fasta）進(jìn)行搜索。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次得到的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，兩組之間使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為對(duì)比組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總離子流（TIC）圖和二級(jí)質(zhì)譜圖譜

圖1所示，A圖和B圖分別是S1組和S2組在OTIT、ETD-OTIT、Faims-OTIT三種采集模式下得到的TIC圖。結(jié)果顯示，ETD的碎裂產(chǎn)生了更為豐富的修飾基團(tuán)和c、z離子，結(jié)合OTIT組同時(shí)存在的b、y離子，使得ETD-OTIT組的TIC圖更加豐富，而高場非對(duì)稱波形離子遷移譜Faims的存在，使得干擾更少，TIC圖背景更加干凈。

三種采集模式得到的二級(jí)質(zhì)譜圖比對(duì)結(jié)果如圖2所示，經(jīng)縱向比對(duì)，三種采集模式得到的二級(jí)質(zhì)譜圖信息重復(fù)率不高，不可完全替代。OTIT采集模式的b、y離子信息豐富、ETD-OTIT采集模式的b、y、c、z離子相對(duì)較多，F(xiàn)aims-OTIT采集模式經(jīng)過對(duì)雜質(zhì)離子的過濾和篩選，TIC圖譜背景干擾更少，能夠得到更為可靠蛋白組信息。

圖2 樣本S1（A），S2（B）分別在OTIT、ETD-OTIT、Faims-OTIT三種采集模式的二級(jí)質(zhì)譜圖 A：樣本S1三種采集模式的二級(jí)質(zhì)譜圖（MS2）；B：樣本S2三種采集模式的二級(jí)質(zhì)譜圖（MS2）

2.2 一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)目，肽段鑒定，蛋白質(zhì)組鑒定結(jié)果

使用Proteome Discoverer 2.4（PD）軟件進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示，4D-Faims-OTIT采集模式下，圖3-D和3-E分別是三種方法提取的一級(jí)質(zhì)譜圖（MS1）和二級(jí)質(zhì)譜圖（MS2）的數(shù)目比對(duì)圖。結(jié)果顯示，一級(jí)質(zhì)譜采集中，結(jié)果大小依次為4D-Faims-OTIT＞OTIT＞ETD-OTIT。而在二級(jí)質(zhì)譜離子鑒定數(shù)目中，結(jié)果大小依次為4D-Faims-OTIT＞ETDOTIT＞OTIT。肽段鑒定數(shù)目在4D-Faims-OTIT，OTIT和ETD-OTIT這三種模式下，S1樣本分別為3124±61，1479±19和840±12，S2樣本分別為2426±120，971±32和502±48（圖3-B）。修飾位點(diǎn)在4DFaims-OTIT，OTIT和ETD-OTIT這三種模式下，S1樣本分別為138±12，105±1和75±14，S2樣本分別為122±15，66±15和42±7（圖3-C）。蛋白質(zhì)組和肽段鑒定數(shù)目大小結(jié)果依次為4D-Faims-OTIT＞OTIT＞ETD-OTIT，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，三者比較具有顯著性差異，4D-Faims-OTIT是OTIT的2倍以上。S1樣本中鑒定的蛋白質(zhì)組數(shù)目為1040±21，S2樣本中為851±31；OTIT采集模式下，S1樣本為428±4，S2樣本為290±10；ETD-OTIT采集模式下，S1樣本為274±6，S2樣本為192±14（圖3-A）。

圖3 三種采集模式下 鑒定到的蛋白組數(shù)目（A），肽段組（B），修飾位點(diǎn)（C），一級(jí)質(zhì)譜特征數(shù)目（D），二級(jí)質(zhì)譜特征數(shù)目（E）；與OTIT組比較，*P值＜0.05，**P值＜0.01，***P值＜0.001

針對(duì)兩組樣品S1和S2的蛋白鑒定結(jié)果進(jìn)行組內(nèi)并集后，再進(jìn)行組內(nèi)方法間的交集韋恩圖，結(jié)果如圖4顯示，4D-Faims-OTIT采集模式下鑒定到的特異性蛋白分別占據(jù)了58.5%和63.2%，OTIT采集模式下鑒定到的特異性蛋白分別占據(jù)了5.2%和4.4%，ETD-OTIT采集模式下鑒定到的特異性蛋白分別占據(jù)了2.2%和1.6%。結(jié)果表明，4D-Faims-OTIT采集模式的優(yōu)勢(shì)比較明顯，但是OTIT和ETD-OTIT這兩種采集模式也各有優(yōu)勢(shì)，存在不可替代性。

圖4 樣本S1(A)，S2(B)分別在OTIT、ETD-OTIT、Faims-OTIT三種采集模式的蛋白鑒定結(jié)果韋恩圖

2.3 S1樣本中分泌型蛋白鑒定分析結(jié)果

對(duì)S1樣本中4D-Faims-OTIT鑒定到的分泌型蛋白進(jìn)行歸類，除自身生長所需的各類蛋白外，其他影響相關(guān)癌癥病癥的各類型酶（enzyme）有26種，各類生長因子（growth factor）有16種。如表1所示，影響結(jié)腸癌的標(biāo)志物分泌因子有Q9Z0J7（GDF15）［5］，影響肺癌的標(biāo)志物分泌因子有P40224（CXCL12）［6］，影響胰腺癌的標(biāo)志物分泌因子有P18242（Cathepsin D）/P10605（Cathepsin B）［7］，影響卵巢癌的標(biāo)志物分泌因子有P70389、P47880等（Insulin-like growth factor）［8］，影響肝癌的標(biāo)志物分泌因子有P08226（Apolipoprotein E）/P21460（Cystatin C）［9-10］。肝癌的分泌因子標(biāo)志物P08226對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜檢出譜圖如圖5所示，檢出肽段是帶+2電荷的ELEEQLGPVAEETR。

表1 S1樣本腫瘤中潛在的標(biāo)志物的旁分泌型蛋白結(jié)果

圖5 樣本S1檢出的肝癌標(biāo)志物P08226分泌因子對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜

3 討論

為深度解析脂肪細(xì)胞旁分泌的低豐度蛋白質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)以小鼠皮下脂肪原代細(xì)胞培養(yǎng)基樣本為模型，使用丙酮沉淀法提取總蛋白，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用OTIT，ETD-OTIT和4D-Faims-OTIT三種采集模式，對(duì)旁分泌型低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，4D-Faims-OTIT的方法對(duì)于蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目、肽段匹配鑒定數(shù)和修飾位點(diǎn)的鑒定都具有更深的覆蓋，極大提升了修飾檢測的靈敏度和深度。在二級(jí)質(zhì)譜離子鑒定數(shù)目中，結(jié)果大小依次為4D-Faims-OTIT＞ETD-OTIT＞OTIT，這與OTIT采集模式下的b、y離子信息豐富，而ETD-OTIT采集模式下的b、y、c、z離子相對(duì)較多有關(guān)。

生物色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，當(dāng)前新技術(shù)ETD的出現(xiàn)，不僅具備了碎裂過程基本不受肽的長度、序列的影響，基本保留了翻譯后修飾的位點(diǎn)信息。對(duì)于非胰蛋白酶酶切的較長的高堿性肽和蛋白，能夠產(chǎn)生豐富的離子信息，提高了蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋度的優(yōu)點(diǎn)，其獲得二級(jí)離子的時(shí)間只需要100~300 ms，具有更高的檢測通量特點(diǎn)［20］。而且，已報(bào)道出ETD在測定N-和O-糖基化修飾、磷酸化修飾、磺化修飾等翻譯后修飾方面優(yōu)勢(shì)顯著［20-22］，ETD主要斷裂主鏈，可以保留修飾的主鏈基團(tuán)、得到豐富的b、y、c、z序列離子，結(jié)合碰撞池HCD產(chǎn)生的b、y序列離子，使得鑒定結(jié)果更加可靠與完整。而離子淌度（Ion Mobility）和高場非對(duì)稱波形離子淌度遷移譜（Faims）技術(shù)的應(yīng)用，四維蛋白質(zhì)組學(xué)（4D-Proteomics）研究也正式發(fā)展起來。4DProteomicsTM［5，6］是在3D分離即保留時(shí)間、質(zhì)荷比、離子強(qiáng)度的基礎(chǔ)之上擴(kuò)展的第四個(gè)維度。離子淌度的分離功能是從質(zhì)譜的掃描速度、靈敏度上提升蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白鑒定數(shù)量、定量準(zhǔn)確性等性能。同時(shí)，F(xiàn)aims技術(shù)具有明顯減少單電荷離子的干擾，顯著提高分析選擇性等特點(diǎn)，顯著提高了蛋白質(zhì)的鑒定深度［7，8］。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)S1樣本鑒定到的分泌型蛋白進(jìn)行歸類，除自身生長所需的各類蛋白外，鑒定到多種外科腫瘤疾病的標(biāo)志物。其中，影響相關(guān)癌癥的各類型酶（enzyme）有26種，各類生長因子（growth factor）有16種。如結(jié)腸癌的分泌因子Q9Z0J7（GDF15），肺癌的分泌因子P40224（CXCL12），胰腺癌的分泌因子P18242（Cathepsin D）/P10605（Cathepsin B），卵巢癌的分泌因子P70389、P47880等（Insulin-like growth factor），肝癌的分泌因子P08226（Apolipoprotein E）/P21460（Cystatin C）。這些結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等外科疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有利于研究各類腫瘤疾病中腫瘤微環(huán)境的細(xì)微改變對(duì)腫瘤生長或凋亡速度、侵襲和轉(zhuǎn)移速度的改變影響，從而為研究找出腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)起著重要的作用［5］。

綜上所述，4D-Faims-OTIT對(duì)于蛋白質(zhì)，肽段匹配和修飾位點(diǎn)鑒定數(shù)目都具有更深的覆蓋度，具有明顯的提升率，且對(duì)雜質(zhì)離子的過濾和篩選，TIC圖譜背景干擾更少，能夠得到更為可靠蛋白組信息，對(duì)于脂肪細(xì)胞的分泌型蛋白質(zhì)影響腫瘤微環(huán)境的研究有著重要的意義。因此，該檢測方法在相關(guān)腫瘤疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方面具有明顯的輔助功能和優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于LC-MS/MS分析技術(shù)，使用4DFaims-OTIT、ETD-OTIT、OTIT三種采集方法檢測C57/B6小鼠皮下脂肪組織S-FA原代細(xì)胞培養(yǎng)基的低豐度蛋白質(zhì)組。結(jié)果顯示，4D-Faims-OTIT采集方法能夠高效靈敏地檢測低豐度蛋白質(zhì)，具有穩(wěn)定的數(shù)據(jù)提升率、普遍的樣本類型適用性等特點(diǎn)，對(duì)于蛋白鑒定深度，肽段鑒定數(shù)和修飾位點(diǎn)都具有明顯優(yōu)勢(shì)。該方法對(duì)于旁分泌型低豐度蛋白的檢測有著較高的靈敏度，對(duì)于研究脂肪細(xì)胞的旁分泌型低豐度蛋白質(zhì)組影響腫瘤的微環(huán)境起著重要的作用。因此，有助于結(jié)直腸癌、肺癌和卵巢癌等疾病機(jī)理的研究。