梁麗娜, 駱青燕, 王歡, 吉蘇云

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

銀屑病(psoriasis)的發(fā)病與遺傳背景、環(huán)境誘因、免疫應(yīng)答異常等因素有關(guān)[1]，其中IL-23/Th17軸被認(rèn)為在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用[2]。Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)途徑是一種重要的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3]。TYK2作為JAK家族成員之一，介導(dǎo)IL-23誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的增殖、活化，促使IL-17、IL-22、IL-23等細(xì)胞因子表達(dá)增加，與銀屑病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[1]。既往研究報(bào)道TYK2抑制劑可顯著抑制銀屑病樣皮炎小鼠的皮膚炎癥和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]，目前Ⅱ期臨床研究結(jié)果也顯示口服選擇性TYK2抑制劑對(duì)中重度銀屑病有著良好的治療效果[5]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種免疫原性低、自我更新能力強(qiáng)、免疫調(diào)節(jié)特性強(qiáng)的成體多能祖細(xì)胞，因具有調(diào)節(jié)B、T細(xì)胞增殖、抑制樹突狀細(xì)胞成熟、抑制中性粒細(xì)胞動(dòng)員等免疫調(diào)節(jié)功能，被認(rèn)為是治療克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫或炎癥性疾病的一種治療方式[6-8]。有報(bào)道2例尋常型銀屑病患者在接受MSCs治療后療效明顯，且觀察4～5年均無(wú)復(fù)發(fā)[9]。但目前MSCs治療銀屑病的詳細(xì)機(jī)制尚未清楚，對(duì)TYK2的作用亦不清楚。因此，本研究探討MSCs對(duì)銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化影響，為MSCs治療銀屑病的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞

MSCs來(lái)源于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院劉秋莉老師贈(zèng)與的人臍血來(lái)源的第4代MSCs。BALB/C雌性小鼠，共9只，6～8周齡，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 方法

1.2.1 MSCs培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用10% FBS(Gibco)、1%雙抗(Gibco)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)MSCs，取第5～8代的MSCs用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 小鼠建模 隨機(jī)分為3組：空白組、咪喹莫特組(IMQ組)及治療組(IMQ+MSC組)，每組3只。剃掉小鼠背部毛發(fā)，連續(xù)6 d在每只小鼠的背部均勻涂抹62.5 mg咪喹莫特乳膏。第6天，涂抹咪喹莫特乳膏后，空白組不予任何處理，IMQ組經(jīng)尾靜脈注射100 μL的無(wú)菌PBS溶液，IMQ+MSC組經(jīng)尾靜脈注射同體積的1×106的MSC懸浮液。48 h后，予頸椎脫臼法分別將各組小鼠處死，取背部皮膚組織備用。

1.2.3 PASI評(píng)分 采用PASI評(píng)分動(dòng)態(tài)評(píng)估各組皮損的嚴(yán)重程度，紅斑、鱗屑和皮損厚度評(píng)分為0～4分(0分：無(wú)；1分：輕度；2分：中度；3分：顯著；4分：非常顯著)。紅斑+鱗片+皮損厚度的總分為最后評(píng)分。

1.2.4 HE染色 取合適大小的近后正中線的背部皮膚組織于4%的多聚醛溶液中室溫固定24～48 h后脫水、石蠟包埋，制成3 μm厚的切片行蘇木素和伊紅染色。

1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)皮膚組織中CD4+T細(xì)胞及CD11c+樹突狀細(xì)胞 取各組小鼠的病理切片行脫蠟、修復(fù)、封閉后，用大鼠抗鼠CD4+抗體(Biolegend，1 ∶500稀釋)、大鼠抗鼠CD11c抗體(Biolegend，1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，PBS泡洗后予相應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，再次PBS泡洗后予DAPI熒光封片劑封存，共聚焦顯微鏡下觀察圖像并保存。

1.2.6 Western blot測(cè)定皮膚組織中TYK2及其磷酸化 液氮研磨各組小鼠的皮膚組織，通過裂解、離心獲取樣品上清液。根據(jù)BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白提取液的濃度。等量蛋白質(zhì)(約50 μg)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%的BSA封閉1 h后兔抗TYK2磷酸化抗體(Abmart，1 ∶500稀釋)4 ℃過夜，TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。將兔抗TYK2磷酸化抗體剝脫后，用5%的脫脂牛奶封閉1 h，兔抗TYK2抗體(Abmart，1 ∶1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。均以GAPDH(銳抗，1 ∶5 000稀釋)作為內(nèi)源性對(duì)照，用ECL試劑在多功能凝膠成像儀中檢測(cè)目的條帶。利用ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MSCs減輕銀屑病樣皮炎小鼠皮損嚴(yán)重程度

在第6天，與空白組相比，IMQ組及IMQ+MSC組均出現(xiàn)明顯的紅斑、鱗屑，PASI評(píng)分明顯升高；在第8天，與IMQ組比較，IMQ+MSC組小鼠的紅斑、鱗屑減輕，PASI評(píng)分下降(圖1A～1E)。表明MSCs減輕了銀屑病樣皮炎小鼠皮損的嚴(yán)重程度。

圖1 各組小鼠外觀(1A)及紅斑(1B)、鱗屑(1C)、皮損厚度(1D)評(píng)分、總PASI評(píng)分(1E)Figure 1 Clinical pictures(1A) and erythema score(1B), scale score(1C), skin thickness score(1D), total PASI score(1E) in each group.

2.2 MSCs減輕銀屑病樣皮炎小鼠的組織病理改變

建模第6天，咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)IMQ組及IMQ+MSC組小鼠的HE染色可見角化不全、Munro微膿腫、表皮增厚;而在MSCs治療2 d后，與IMQ組相比，IMQ+MSC組未見明顯角化不全、Munro微膿腫，表皮厚度明顯變薄(圖2A、2B)。建模第8天，在IMQ組的皮損中可見大量CD4+T細(xì)胞及CD11+樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)，而IMQ+MSC組中CD4+T細(xì)胞及CD11+樹突狀細(xì)胞明顯減少(圖3)。證明MSCs可減輕銀屑病樣皮炎小鼠的組織病理改變及減少CD4+T細(xì)胞、CD11+樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)。

圖2 各組銀屑病樣皮炎小鼠皮膚組織病理學(xué)(2A,HE，200×)及第8天表皮厚度(2B)統(tǒng)計(jì)Figure 2 Histopathology (HE staining,200×) of lesions of psoriasis-like mice(2A) and epidermal thickness in each group(2B).

圖3 免疫熒光檢測(cè)第8天各組小鼠CD4+T細(xì)胞、CD11c+樹突狀細(xì)胞(200×)Figure 3 Immunofluorescence results of CD4+ T cells and CD11c+ dendritic cells in each group(200×).

2.3 MSCs抑制銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化

Western blot比較各組的TYK2及其磷酸化水平(圖4),結(jié)果顯示各組的總TYK2表達(dá)水平未見差異,但I(xiàn)MQ組TYK2磷酸化水平升高(1.233±0.163比0.634±0.117,P<0.05)，IMQ+MSC組在治療后比IMQ組下降(0.501±0.074比1.233±0.163,P<0.05)，證明MSCs抑制了銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化。

圖4 Western blot分析各組小鼠的TYK2及其磷酸化水平Figure 4 The levels of TYK2 and pTYK2/TYK2 of each group analyzed by Western blotting.

3 討論

本研究探討MSCs對(duì)銀屑病樣皮炎小鼠TYK2磷酸化的影響,結(jié)果顯示MSCs的治療可減輕咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎小鼠紅斑、鱗屑及PASI評(píng)分，并改善病變皮損的表皮厚度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，通過Western blot檢測(cè)各組皮損的TYK2及其磷酸化水平，證明MSCs抑制了銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化水平，表明MSCs可通過抑制TYK2磷酸化減輕銀屑病樣皮炎小鼠皮損的嚴(yán)重程度。

銀屑病的臨床表現(xiàn)以局限或廣泛分布的鱗屑性紅色斑塊為主，也可伴有系統(tǒng)疾病，皮損組織病理特征為角化過度、角化不全、Munro微膿腫、棘層肥厚及中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[10-11]。咪喹莫特乳膏作為一種Toll樣受體7/8配體和強(qiáng)效免疫激活劑，反復(fù)涂抹可誘導(dǎo)并加重炎癥性皮損，被廣泛用于銀屑病皮膚炎癥模型[12]。本研究結(jié)果與既往研究[8]一致，咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)銀屑病樣的紅斑、鱗屑，組織病理也表現(xiàn)出銀屑病的特征，包括角化過度、角化不全、Munro微膿腫和真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等；MSCs的治療可明顯緩解銀屑病樣皮炎小鼠的紅斑、鱗屑、皮損厚度等臨床表現(xiàn)，減輕表皮厚度、CD4+T細(xì)胞和CD11c+樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)，驗(yàn)證了MSC具有強(qiáng)大的抗炎、免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)銀屑病樣皮炎小鼠有著良好的療效。

TYK2作為JAK家族的成員之一，參與不同細(xì)胞因子如IL-12、IL-23啟動(dòng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞[13]，并在銀屑病中參與了Th17細(xì)胞的增殖、活化[1]。在一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究中，TYK2被確定為銀屑病易感位點(diǎn)[14]。TYK2抑制劑顯著減輕銀屑病樣皮炎小鼠皮損的嚴(yán)重程度及減少炎癥因子產(chǎn)生[1, 4]。TYK2被認(rèn)為是銀屑病的治療靶標(biāo)之一[15]。目前已完成的Ⅱ期臨床研究表明口服選擇性TYK2抑制劑對(duì)中重度銀屑病有著良好的臨床療效[1,13]。本研究結(jié)果顯示MSCs的治療抑制了銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化，證明MSCs一定程度上是通過抑制TYK2的磷酸化減輕銀屑病樣皮炎小鼠的嚴(yán)重程度。

綜上所述，MSCs可通過抑制TYK2磷酸化緩解銀屑病樣皮炎小鼠的紅斑、鱗屑、皮損厚度及相關(guān)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。