唐佳代，劉力萍，龍亞飛，孟卓妮，吳德光，張春林

（1.茅臺學(xué)院釀酒工程系，貴州 遵義 564500；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564500）

醬香大曲以小麥、水和母曲為原料，經(jīng)發(fā)酵貯存制成，在醬香型白酒生產(chǎn)過程中起到微生物制劑、復(fù)合酶制劑和風味物質(zhì)載體等作用。依據(jù)成品曲的色澤可以分為黃曲、黑曲和白曲，黃曲皮厚，黑曲和白曲皮薄且曲心呈菊花狀，黃曲呈金黃色或棕黃色，曲香濃郁；黑曲呈黑色或棕褐色，帶有糊味；白曲呈麥粉色，有生麥味。制曲過程中，小麥磨碎度、拌料水分適中，入倉堆積處于發(fā)酵倉中層，溶氧較好易形成黃曲。若入倉堆積的曲坯處于發(fā)酵倉中下層，溶氧少，濕氣重，水分大，曲坯發(fā)酵過程中熱曲時間長則易形成黑曲。當入倉堆積時，曲坯處于發(fā)酵倉上層，門窗密封性不好，水分揮發(fā)快，熱曲時間短則易形成白曲。除感官特性差異外，其糖化力、酯化力、發(fā)酵力、液化力、水分和酸度等理化指標和發(fā)酵性能存在差異。

作為微生物制劑，醬香大曲中微生物主要包括酵母菌、霉菌、細菌和放線菌，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、纖維素酶等豐富多樣的酶系，具有酒化、酯化等能力，從而促進酒中多種風味物質(zhì)的形成。例如，根霉、曲霉等淀粉酶、糖化酶產(chǎn)生菌將小麥中的淀粉降解為葡萄糖，葡萄糖通過糖酵解途徑生成丙酮酸，酵母利用丙酮酸通過糖代謝合成途徑形成高級醇、乙醛、乙酸化合物等；青霉、曲霉等蛋白酶產(chǎn)生菌將小麥中的蛋白質(zhì)降解為氨基酸，再經(jīng)Ehrlich途徑可產(chǎn)生多種-酮酸、醛和高級醇；上述化合物經(jīng)輔酶催化產(chǎn)生乙醇、酯類等風味化合物。探究醬香大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，以此為基礎(chǔ)研究醬香型大曲功能真菌并應(yīng)用于釀酒是目前提高酒質(zhì)和生產(chǎn)穩(wěn)定性的手段之一。

近年來，高通量測序技術(shù)因其安全性和可靠性高，能全面展現(xiàn)樣本微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)及豐度等優(yōu)勢，普遍被應(yīng)用于白酒領(lǐng)域。基于高通量測序分析不同感官特性醬香大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合不同感官特性醬香大曲理化指標，分析其微生物群落結(jié)構(gòu)與理化、發(fā)酵特性的關(guān)聯(lián)性。同時，掌握更多醬香型白酒釀造過程中的真菌信息，以期為進一步利用白酒釀造微生物資源奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲、黑曲、白曲為貴州省仁懷市某酒廠拆倉曲，樣品采集于2020年11月，該酒廠某一制曲車間中5 個曲房中的拆倉曲（黑、白、黃曲）各一塊，粉碎混合后用四分法進行縮分取樣，備用。

氫氧化鈉（分析純） 天津大茂化學(xué)試劑廠；硫酸（分析純） 川東化工集團；己酸、乙醇、乙酸（均為分析純） 上海滬試實驗室器材股份有限公司；乙酸鈉（分析純） 南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204N電子天平 上海菁海儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱、HH-8J數(shù)顯恒溫水浴鍋常州潤華電器有限公司；DK-98-II電爐 天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊醫(yī)療股份有限公司；BCD-640WAGM冷藏柜青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同感官特性醬香大曲理化特性分析

按照QB/T 4257ü2011《釀酒大曲通用分析方法》對3 種不同感官特性醬香大曲的水分含量、液化力、發(fā)酵力和酯化力進行測定。

1.3.2 醬香型大曲中DNA提取、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增和測序

保藏醬香大曲樣品送至成都羅寧生物科技有限公司，使用Zymo Research BIOMICS DNA提取試劑盒提取黃曲、黑曲和白曲樣品中的DNA。在真菌ITS區(qū)域進行擴增，擴增引物ITS3（5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR擴增用酶為KOD-Plus-Neo（KOD-401B），擴增體系為50 μL：5 μL 10hPCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5 μL 2 mmol/L dNTPS，3 μL 25 mmol/L MgSO，1.5 μL上游引物ITS3，1.5 μL下游引物ITS4，2 μL DNA模板，31 μL超純水，1 μL KOD-Plus-Neo。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性20 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，25～30 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；4 ℃保溫。擴增產(chǎn)物純化后用2%的瓊脂糖凝膠，每個樣本進行3 次重復(fù)，取線性期PCR產(chǎn)物等量混合后建庫。進一步在Illumina HiSeq 2500測序平臺開展高通量測序。

1.3.3 高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析

高通量測序所得序列通過FLASH拼接雙端序列、過濾去除低質(zhì)量序列、基于Uchime算法去除嵌合體，進而得到有效數(shù)據(jù)?；赨search（http://drive.com/uparse/）軟件，使用UPARSE算法在97%的一致性水平上進行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類。并基于UCLUST分類法與UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫（8.2）進行基因序列比對和注釋分析。使用R語言（3.6.0）分析多樣性和多樣性。通過QIIME（v 1.9.0）軟件對樣品多樣性指數(shù)進行分析，用于衡量多樣性指標主要有Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)。其中Chao1和ACE指數(shù)用于衡量樣本中物種的豐度，兩者數(shù)值與樣本物種總數(shù)呈正比：Chao1指數(shù)主要依據(jù)有單條或雙條序列OTU數(shù)目判斷物種豐度；ACE指數(shù)依據(jù)有單條序列OTU數(shù)目與出現(xiàn)頻次低于10 次的物種衡量樣本中物種總數(shù)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于綜合衡量樣本物種多樣性：Shannon指數(shù)表示樣本中各物種和物種間在樣本中分布的均勻性，數(shù)值與物種均勻性呈正比；Simpson指數(shù)衡量樣本中物種多樣性，與樣本多樣性呈正比。使用LEfse工具（https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/Home）進行差異物種分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同感官特性醬香大曲理化特性分析

醬香大曲的理化指標是衡量大曲成熟與否的重要標志，在一定程度上反映大曲品質(zhì)。水分含量過低不能為微生物提供良好的生長繁殖條件，過高大曲易生霉，從而導(dǎo)致大曲的質(zhì)量降低。酸度是微生物綜合作用的結(jié)果，主要受其分解代謝產(chǎn)生的有機酸影響，以及脂肪和蛋白質(zhì)的水解，酸度過高或過低均不利于微生物生長繁殖。液化力是衡量大曲發(fā)酵性能高低的重要指標，液化力高將為產(chǎn)酒、產(chǎn)香奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。發(fā)酵力是反映大曲產(chǎn)酒能力的重要指標之一，酯化力則是反映大曲產(chǎn)香能力的重要指標。糖化力代表大曲中現(xiàn)有的酶和微生物將淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖類的能力。不同感官特性醬香大曲的理化指標結(jié)果如表1所示。

表1 不同感官特性醬香大曲理化指標Table 1 Physicochemical indexes of Daqu

不同感官特性醬香大曲樣品中水分質(zhì)量分數(shù)分別為白曲12.89%、黃曲11.63%、黑曲12.44%，均低于13%。樣品酸度由高到低依次為黑曲＞白曲＞黃曲，分別為白曲0.262 mmol/g、黃曲0.252 mmol/g、黑曲0.316 mmol/g。醬香大曲酸度范圍應(yīng)在0.10～0.35 mmol/g。水分含量和酸度均符合相應(yīng)標準規(guī)定。酸度適宜時能夠抑制雜菌生長，為有益菌提供生存環(huán)境，并作為反應(yīng)物參與酯化反應(yīng)。不同感官特性大曲樣品液化力由高到低依次為黃曲＞白曲＞黑曲，糖化力由高至低為白曲＞黃曲＞黑曲，發(fā)酵力由高到低依次為黃曲＞黑曲＞白曲，酯化力高到低依次為黃曲＞黑曲＞白曲。表1結(jié)果與胡寶東等所測醬香大曲6 項理化指標相比均較高，該研究樣品為經(jīng)6 個月貯存的生產(chǎn)用曲，而本研究采用未經(jīng)貯存的拆倉曲，醬香大曲貯存6 個月后各理化指標均有一定程度降低。6 項理化指標與張麗等研究中貯存時間為0～2 個月間的醬香大曲理化指標基本吻合。3 種大曲樣品的理化指標差異主要體現(xiàn)在液化力和糖化力，兩指標越高代表大曲對原料中淀粉轉(zhuǎn)化率越高。DB52/T 871ü2014《醬香型白酒釀酒用大曲》中規(guī)定醬香大曲糖化力為100～300 U，大曲既作為糖化發(fā)酵劑，又需具備投糧、增香等作用，糖化力過高淀粉較多轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，降低投糧作用并導(dǎo)致起酵速度增快，堆子升溫增快不利于醬香型白酒發(fā)酵。酯化力和發(fā)酵力屬于大曲生化功能的動態(tài)指標，與大曲中微生物多樣性及其代謝有密切聯(lián)系。綜合來看，黃曲各項指標更符合實際生產(chǎn)要求。

2.2 不同感官特性醬香型大曲真菌多樣性分析

醬香型大曲樣品提取基因組DNA后，對ITS區(qū)進行測序，進行雙端拼接獲得到優(yōu)質(zhì)序列，優(yōu)質(zhì)序列再經(jīng)過濾嵌合體后共獲得386 150 條有效序列，平均長度為366 bp。

Venn圖可直觀展現(xiàn)不同感官特性醬香大曲樣品中的共有OTU和特有OTU，由圖1可知，3 種樣品共同的OTU有273 個，黃曲樣品特有的OTU為237 個，白曲樣品特有OTU為135 個，黑曲樣品特有OTU為203 個。

圖1 醬香大曲樣品Venn圖Fig.1 Venn diagram showing unique and shared OTUs among different colored Jiang-flavored Daqu

OTU數(shù)稀釋曲線（圖2）反映了樣本物種豐富度隨測序深度的變化趨勢，以及持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率。該曲線以樣本中隨機抽取一定數(shù)量序列數(shù)與序列所代表的物種數(shù)繪制的曲線。圖2中黃曲、白曲和黑曲樣品的稀釋曲線前期急劇上升，隨著抽取序列的增加后趨于平緩。該結(jié)果表明抽取序列前期隨著抽取序列數(shù)增加，檢出大量真菌物種；當抽檢超過20 000 個序列后，真菌物種不再隨測序數(shù)量的增加而顯著增多，表明樣本測序量充分，測序結(jié)果能真實反映不同感官特性醬香大曲的真菌多樣性。

圖2 大曲真菌OTU數(shù)稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve of OTU number in Daqu

在97%一致性水平上進行大曲樣品多樣性指數(shù)值分析，結(jié)果如表2所示。覆蓋率與樣本中物種被測出的概率呈正比，各樣本覆蓋率均大于0.98，認為測序結(jié)果能夠真實反映樣品物種豐度及物種多樣性。在不同感官特性醬香大曲中，黃曲樣品的Chao1、ACE、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均最高，說明黃曲中物種分布較為均勻且檢測出物種總數(shù)最高。真菌群落多樣性和真菌總數(shù)由高至低依次為：黃曲＞黑曲＞白曲。

表2 大曲真菌α多樣性指數(shù)Table 2 Fungal diversity indexes of Daqu

2.3 不同感官特性醬香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分析

如圖3所示，醬香大曲樣品中豐度水平前10的物種有曲霉屬（）、枝孢屬（）、球針殼屬（）、嗜熱子囊菌屬（）、絲衣霉菌屬（）、根霉屬（）、酵母屬（）、亞隔孢殼屬（）、青霉屬（）和糞盤菌屬（）。黃曲中相對豐度超過1%有（33.84%）、（12.48%）、（11.05%）、（1.83%）、（1.78%）、（1.47%）、（1.35%）、（1.33%）和（1.25%）。白曲中豐度超過1%的包括（37.92%）、（20.71%）、（13.33%）、（2.29%）、紅曲霉屬（）（1.32%）、絲孢畢赤氏酵母屬（）（1.22%）、（1.21%）、（1.13%）、伊薩酵母屬（）（1.09%）。黑曲中相對豐度超過1%有（39.55%）、（13.64%）、（11.52%）、（2.42%）、（1.96%）、（1.44%）、（1.40%）、（1.26%）、（1.26%）。

圖3 屬水平上大曲真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Fungal community structure of Daqu at the genus level

為探究不同大曲樣品組在高豐度類群上的相似性程度，選取豐度排名前50的屬，從物種和組兩個層面進行聚類分析，并繪制成相對豐度聚類熱圖（圖4），便于更直觀體現(xiàn)不同真菌屬在組間中豐度和樣本間真菌多樣性異同。熱圖中顏色代表物種豐度；縱向表示不同物種在各樣品間豐度的相似情況，兩物種間距離越近，枝長越短，說明兩個物種在各樣品間的豐度越相似；橫向表示不同樣品的各物種豐度的相似情況，兩樣品間距離越近，枝長越短，說明這兩個樣品的各物種豐度越相似。如圖4所示，橫向聚類結(jié)果顯示黃曲與黑曲樣品間枝長較短、距離較小，表明其物種豐度相似度較大，白曲與黃曲、黑曲間距離較大，表明其物種豐度相似度較低。

圖4 屬水平物種相對豐度聚類熱圖Fig.4 Heatmap showing relative abundance of species at the genus level

主成分分析（principal component analysis，PCA）通過將測序多維數(shù)據(jù)進行降維，直觀反映所獲得PC得分及變量得分，從而實現(xiàn)樣品真菌多樣性相似性可視化。如圖5所示，PC1、PC2分別占80.3%、6.9%，共能解釋87.2%的物種差異。黃曲與黑曲樣品在PC1上距離較小，說明黃曲與黑曲樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似；白曲與黃曲、黑曲之間在PC1上距離較遠，說明白曲與黃曲、黑曲樣品組間真菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上有較大差異。

圖5 不同大曲樣品真菌屬水平群落PCA圖Fig.5 PCA plot for fungal community structure at the genus level among different Daqu samples

LEfse分析可以進行組間類群的差異檢驗，找到在組間差異顯著的物種，也就是對組間差異貢獻大的類群。LEfSe統(tǒng)計結(jié)果的顯著差異物種線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值分布柱狀圖，可展示每個組內(nèi)顯著富集的物種及其重要性程度。通過LEfse分析（圖6），從不同感官特性醬香大曲中檢出6 個真菌類群，其中屬于高豐度菌屬的有黑曲中的、白曲中的和。造成不同感官特性醬香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要是、、和若干豐度較低的菌屬。

圖6 不同大曲樣品真菌顯著差異物種LDA值分布Fig.6 LDA scores of significantly differential fungi among different Daqu samples

3 結(jié) 論

采用高通量測序分析對比不同感官特性的醬香大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)，并分析與其理化特性之間的關(guān)聯(lián)性。由于在曲房堆積貯存過程中溫度與濕度差異，醬香成品曲表現(xiàn)為不同感官特性。所測不同感官特性醬香大曲樣品中水分含量、酸度均符合相關(guān)標準。樣品間黃曲的液化力、發(fā)酵力和酯化力均較高，液化力由高到低依次為黃曲＞白曲＞黑曲，發(fā)酵力和酯化力由高到低依次為黃曲＞黑曲＞白曲，糖化力由高至低為白曲＞黃曲＞黑曲。大曲的液化力和糖化力主要與其中細菌、霉菌及其代謝相關(guān)，發(fā)酵力和酯化力主要與酵母菌相關(guān)，繼而展開3 種醬香大曲中真菌群落及多樣性差異分析。

通過在UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示在醬香大曲樣品中鑒別出豐度優(yōu)勢真菌屬：黃曲中為、和；白曲中為、和；黑曲中為、和。樣品菌屬豐度最高的均為，該結(jié)果與已有研究結(jié)果相印證。具有耐熱和耐酸特性，在醬香大曲和釀酒環(huán)境中種類最為豐富的霉菌，可產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，有利于提高酒曲的液化力、發(fā)酵力和酯化力。在高豐度菌屬中黃曲豐度優(yōu)勢真菌屬與黑曲相似度較高，豐度前3的菌屬相同；白曲樣品的豐度優(yōu)勢菌屬與黃曲、黑曲有一定程度差異。PCA與菌屬聚類豐度熱圖結(jié)果表明，黃曲與黑曲樣品在PC1上樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似且物種豐度相似度較大；白曲與黃曲、黑曲樣品組間真菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上有較大差異，且物種豐度相似度較低。為探究3 種不同感官特性醬香大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)差異，應(yīng)用LEfse分析進行組間類群的差異檢驗，找到組間差異顯著的物種。LEfse分析結(jié)果顯示，造成不同感官特性醬香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要是、、和一些豐度較低的菌屬。與酒曲酒化力、發(fā)酵力與酯化力息息相關(guān)，初步判斷在優(yōu)勢菌屬同為條件下，所造成菌屬差異是造成黃曲和黑曲酒化力、發(fā)酵力與酯化力較高的主要因素，發(fā)酵過程能夠產(chǎn)生較多的醇類、酯類和醛類等風味化合物，而黑曲本身的焦糊味較重，大量投用不利于白酒風味，故在生產(chǎn)中投用黃曲比例最大。、和等在大曲樣品中豐度較高菌屬可產(chǎn)生阿魏酸酯酶、-淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等生物活性酶類，促進白酒中風味成分和健康因子的生成與富集。

基于高通量測序技術(shù)結(jié)合理化指標分析，初步探究了不同感官特性醬香大曲理化特性差異與真菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)差異間的關(guān)聯(lián)性。進一步將完善不同感官特性醬香大曲中微生物組學(xué)與風味組的相關(guān)性研究，獲取醬香大曲中功能微生物，為提高醬香大曲發(fā)酵性能奠定理論與物質(zhì)基礎(chǔ)。