葉彬，周濤，廉杰，李祎飛*，鄒華

（1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.東珠生態(tài)環(huán)保股份有限公司，江蘇 無錫 214101）

非甾體類消炎藥（Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是應(yīng)用最為廣泛的一類消炎藥，具有解熱、止痛、抗炎等作用，在農(nóng)村地區(qū)使用量大且檢出頻率高，其會通過人和牲畜的排泄、污水排放、廢棄藥物的不合理處置等途徑進(jìn)入農(nóng)村地表水環(huán)境。地表水是農(nóng)業(yè)灌溉和養(yǎng)殖用水的主要來源，NSAIDs不斷被排入到地表水環(huán)境中，易形成“持久性”污染，會對農(nóng)作物和水產(chǎn)品造成潛在危害。已有文獻(xiàn)報(bào)道：萵苣和菠菜中富集的NSAIDs會損害植物線粒體、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)；NSAIDs中的布洛芬和雙氯芬酸會在鯉魚組織中累積，并產(chǎn)生細(xì)胞遺傳毒性。因此，如何有效控制農(nóng)村地表水環(huán)境中NSAIDs的污染在保障農(nóng)業(yè)安全方面具有重要意義。

地表水體具有水域廣、水量大等特點(diǎn)，采用傳統(tǒng)的水處理技術(shù)（混凝沉淀、吸附、離子交換、膜分離等）進(jìn)行集中處理的可行性低，目前，國內(nèi)普遍采用的技術(shù)為生物修復(fù)技術(shù)，其中最主要的一個技術(shù)為植物修復(fù)技術(shù)，如人工濕地。人工濕地是適用于農(nóng)村地區(qū)的分散式污水處理設(shè)施，處理農(nóng)村生活污水中的藥物污染物（如布洛芬和雙氯芬酸）效果較好。但是，地表水和生活污水水質(zhì)差異大，地表水藥物污染物濃度更低，已有少量研究發(fā)現(xiàn)人工濕地去除地表水體中的藥物存在去除不完全且耗時長的問題。因而，深入探索NSAIDs（地表水濃度級別）在人工濕地中的降解機(jī)制，是對濕地技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)以有效控制地表水環(huán)境NSAIDs污染的重要前提。

植物在人工濕地中發(fā)揮重要作用，其根際微生物具有降解有機(jī)污染物的能力。根系分泌物是根際微生物重要的碳源、能源和信號物質(zhì)，微生物對根系分泌物的偏好可以驅(qū)動根際微生物的構(gòu)建。在非生物脅迫下，植物根系分泌物的組分會發(fā)生改變以減輕脅迫的影響，從而推動根際微生物群落的變化。有機(jī)酸是根系分泌物的重要組成部分，在響應(yīng)非生物脅迫過程中其組分會發(fā)生改變以抵制脅迫，如一些有機(jī)酸的釋放速率增大從而吸引有益微生物在根際定殖。在有機(jī)污染物降解方面，已有文獻(xiàn)報(bào)道了有機(jī)酸（如檸檬酸）促進(jìn)微生物降解多環(huán)芳烴的現(xiàn)象。綜上可以推測，根系分泌物中的有機(jī)酸組分在NSAIDs脅迫下會發(fā)生改變，從而促使NSAIDs降解菌在根際定殖。因此，明確根系分泌物中哪些有機(jī)酸具有促進(jìn)根際微生物降解NSAIDs的潛力，尤其是針對人工濕地常用的植物，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，可以為改進(jìn)人工濕地技術(shù)以提高地表水體NSAIDs的去除效率打開新思路，如模擬根系分泌物有機(jī)酸組分，人工配制根際NSAIDs降解菌的促生劑等。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，一方面需要準(zhǔn)確定量濕地植物根系分泌物中的有機(jī)酸，另一方面需要揭示濕地植物根系分泌物中有機(jī)酸組分在NSAIDs長期脅迫下的變化，顯著增多的有機(jī)酸可能具備吸引有益微生物在根際定殖以降解NSAIDs的功能。

針對人工濕地常用的植物蘆葦（），本研究開展了NSAIDs長期脅迫實(shí)驗(yàn)。鑒于NSAIDs在地表水環(huán)境中不是孤立存在的，且NSAIDs混合物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)需要引起高度重視，本研究采用我國水環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估高的5種NSAIDs（雙氯芬酸、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、萘普生）進(jìn)行了混合暴露實(shí)驗(yàn)，各NSAID的濃度為水環(huán)境常見濃度（100 ng·L）。

在實(shí)驗(yàn)過程中，本研究首先優(yōu)化了測定12種有機(jī)酸的高效液相色譜（HPLC）方法，以降低同時檢測10種以上有機(jī)酸時的檢測限和檢測時間。然后，在實(shí)驗(yàn)室分別構(gòu)建水培體系（營養(yǎng)液培養(yǎng)）和人工濕地體系（表面流型人工濕地），收集NSAIDs脅迫下蘆葦幼苗期、展葉期和快速生長期的根系分泌物，分析有機(jī)酸的釋放速率，并同時檢測植物的生長生理指標(biāo)和根部累積的NSAIDs濃度。12種目標(biāo)有機(jī)酸為丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、乙酸、丙酸、檸檬酸、富馬酸、乳酸、反烏頭酸、酒石酸、草酸和奎尼酸，這些是非生物脅迫下根系分泌物中易發(fā)生變化的組分，也是蘆葦根系分泌物中常見的有機(jī)酸。另外，根系分泌物很容易被微生物降解，開展水培研究可以盡量減少微生物的影響從而更全面地了解有機(jī)酸的組分變化；而人工濕地體系更為復(fù)雜，開展?jié)竦伢w系研究可以深入了解實(shí)際條件下有機(jī)酸的釋放情況。通過綜合分析兩個體系中有機(jī)酸組分變化規(guī)律，揭示蘆葦根系分泌物中有機(jī)酸響應(yīng)NSAIDs長期脅迫的特點(diǎn)，從而判斷哪些有機(jī)酸組分具備吸引有益微生物在根際定殖以降解NSAIDs的潛力。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

定量有機(jī)酸的儀器為Scientific-Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司），色譜柱型號為安捷倫ZORBAX SB-AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）。檢測5種NSAIDs的儀器為超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（HPLC-MS/MS，美國Waters公司），冷凍干燥根系分泌物收集液的儀器為Alpha1-4 LSCbasic真空冷凍干燥機(jī)（德國Christ公司）。

雙氯芬酸（DCF）、布洛芬（IBP）、吲哚美辛（IMC）、酮洛芬（KTP）、萘普生（NPX）5種NSAIDs標(biāo)準(zhǔn)品購自英國LGC（英國政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室）公司；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品包括丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、乙酸、丙酸、檸檬酸、富馬酸、乳酸、反烏頭酸、酒石酸、草酸和奎尼酸，其均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。HPLC流動相所需試劑有磷酸二氫鉀、磷酸（調(diào)節(jié)pH）、甲醇，其均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和百靈威科技有限公司。

5種NSAIDs的理化性質(zhì)詳見表1。

表1 5種NSAIDs的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of the five NSAIDs

1.2 HPLC測定有機(jī)酸的方法優(yōu)化

HPLC的初始色譜條件設(shè)計(jì)為進(jìn)樣量20 μL、流速1 mL·min、柱溫30℃，流動相為10 mmol·LKHPO（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.6）與甲醇的混合溶液（97∶3，/）。然后，分別于波長200、205、210、215 nm，柱溫30、31.5、33、34.5、36℃，流動相pH 2.4、2.5、2.55、2.6、2.7的條件下，考察有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（500 mg·L）中各有機(jī)酸的峰型和信號值，確定最優(yōu)的波長、柱溫和流動相pH。由于草酸、富馬酸和反烏頭酸的信號值明顯高于其他有機(jī)酸，這3種有機(jī)酸的濃度級別設(shè)計(jì)為0.08、0.16、0.4、0.8、1.6、4、8、16、40 mg·L，其他有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建的濃度級別為1、2、5、10、20、50、100、200、500 mg·L。

1.3 根系分泌物中有機(jī)酸的釋放速率測定

1.3.1 水培體系中根系分泌物的收集與預(yù)處理

在溫室環(huán)境中構(gòu)建營養(yǎng)液水培體系（圖1A），培育蘆葦幼苗，開展NSAIDs混合物的脅迫實(shí)驗(yàn)。溫室條件：溫度25℃，光照強(qiáng)度10 000 lx，光照時間16 h/8 h（光/暗），濕度75%。在溫室中用蘆葦根狀莖培育幼苗，將植株幼苗經(jīng)自來水、超純水和無菌水清洗后，移入800 mL霍格蘭營養(yǎng)液（滅菌）中繼續(xù)培育，分別在30 d（幼苗期）、60 d（展葉期）和120 d（快速生長期）收集根系分泌物樣本。實(shí)驗(yàn)分為兩組：NSAIDs脅迫組和對照組（無NSAIDs脅迫），每組實(shí)驗(yàn)6個平行，每個平行在營養(yǎng)液中種植一株植物。在植物培育期間，每3 d更新一次營養(yǎng)液，每天補(bǔ)充蒸騰損失的水分，并加入5種NSAIDs，各消炎藥的濃度均為100 ng·L，以保證持續(xù)的NSAIDs脅迫。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置圖Figure 1 Experimental setups

根系分泌物收集時，將蘆葦從營養(yǎng)液中小心取出進(jìn)行清洗，期間避免根部損傷，然后將每株蘆葦分別放入滅菌燒杯（包裹錫箔紙）中，加入無菌水沒過其根部，在溫室條件下培養(yǎng)2 h，而后將收集的根系分泌物溶液經(jīng)0.22 μm膜過濾。為了進(jìn)一步收集根表面殘留的根系分泌物，將蘆葦?shù)母邢?，切面以下部分浸入盛有無菌水的滅菌燒杯中，超聲振蕩10 min（20 kHz、200 W、間隔時間5 s，4℃），同樣將溶液經(jīng)0.22μm膜過濾。將兩次的根系分泌物濾液充分混合，進(jìn)行凍干處理，每組實(shí)驗(yàn)的凍干根系分泌物混合后稱質(zhì)量，儲存在-20℃冰箱。

根系分泌物中有機(jī)酸在HPLC測定前，需要將凍干的根系分泌物進(jìn)行預(yù)處理，具體方式如下：稱取1 mg凍干的根系分泌物溶解在100μL甲醇中，靜置30 min后，加入400 μL無菌水，振蕩10 s后用0.22 μm PTFE膜過濾。

1.3.2 人工濕地體系中根系分泌物的收集與預(yù)處理

在1.3.1所述的溫室環(huán)境中，于實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建微宇宙表面流型人工濕地（圖1B）。濕地直徑20 cm，高40 cm，內(nèi)部填充20 cm深的土壤，土壤表面保持10 cm水深，在每個濕地中種植一株蘆葦。將蘆葦幼苗按照

1.3.1 所述方法處理后，移栽到濕地中培育，收集根系分泌物樣本，收集時間同1.3.1所述。實(shí)驗(yàn)分為兩組：NSAIDs脅迫組和對照組，每組實(shí)驗(yàn)3個平行。每個濕地系統(tǒng)每天補(bǔ)水以彌補(bǔ)蒸騰損失，每3 d換一次水，脅迫處理組每天還需加入5種NSAIDs（100 ng·L）以保持持續(xù)的NSAIDs脅迫。根系分泌物的收集方法和HPLC測定有機(jī)酸的預(yù)處理方法同1.3.1。

1.3.3 根系分泌物中有機(jī)酸釋放速率的定量分析

水培體系和人工濕地體系蘆葦根系分泌物中有機(jī)酸的釋放速率按照公式（1）計(jì)算。

有機(jī)酸釋放速率=有機(jī)酸檢測濃度×樣品體積×根系分泌物總質(zhì)量/（根系分泌物樣品質(zhì)量×收集時間×干根質(zhì)量）×100% （1）式中：有機(jī)酸檢測濃度為HPLC方法測定的根系分泌物中有機(jī)酸的濃度，mg·L；樣品體積為500μL；根系分泌物總質(zhì)量為每組實(shí)驗(yàn)凍干的根系分泌物混合后的總質(zhì)量，mg；根系分泌物樣品質(zhì)量為1 mg；收集時間為2 h；干根質(zhì)量為每組實(shí)驗(yàn)所有蘆葦根部凍干后的總質(zhì)量，g。

1.4 NSAIDs在蘆葦根部的累積濃度測定

蘆葦根組織中NSAIDs濃度的測定：首先采用超聲提取法和固相萃取法（SPE）對樣本進(jìn)行預(yù)處理，然后采用HPLC-MS/MS方法進(jìn)行定量分析。

超聲提取的具體步驟：取一些凍干的蘆葦根組織研磨成粉末，稱取0.5 g加入20 mL Mcllvaine-EDTA緩沖鹽-甲醇提取液，超聲提取30 min，離心20 min（4 000 r·min），收集上清液，重復(fù)上述提取過程，充分混合兩次的上清液，用0.45 μm膜過濾。然后，將濾液經(jīng)氮吹濃縮至20 mL，用超純水稀釋至200 mL，并用磷酸調(diào)節(jié)pH為4，繼續(xù)采用固相萃取法進(jìn)行凈化。固相萃取采用Waters Oasis HLB萃取柱（200 mg，6 mL），首先用10 mL甲醇和10 mL超純水（調(diào)節(jié)pH至4）進(jìn)行活化，然后上樣（3 mL·min），進(jìn)樣完畢后用10 mL超純水淋洗，再負(fù)壓抽干30 min，最后用12 mL甲醇洗脫HLB小柱，收集的洗脫液緩和氮吹至干，用甲醇定容至0.5 mL，過0.22μm PTFE膜待測。

HPLC-MS/MS儀器配備Water Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），運(yùn)行條件：柱溫40℃，毛細(xì)管柱電壓3 kV，離子源溫度150℃，干燥氣溫度500℃，干燥器流量900 L·h，錐孔反吹氣流量50 L·h，碰撞氣流量0.16 mL·min。NSAIDs的檢測為MRM模式，電噴霧離子源（ESI）為負(fù)離子，流動相A為5 mmol·L醋酸銨，流動相B為乙腈，進(jìn)樣量5μL。具體的洗脫程序：0～0.25 min，10% B；0.25～3 min，10%～90% B；3～4 min，90% B；4～4.01 min，90%～10% B；4.01～5 min，10% B。DCF、IBP、IMC、KTP、NPX的質(zhì)譜定量離子對分別為294.0＞250.0、205.1＞161.0、357.9＞110.9、253.0＞197.0、229.1＞170.0。

1.5 蘆葦生長生理指標(biāo)測定

從水培體系或人工濕地體系中取出蘆葦植株，清洗干凈后用紙巾擦干，測量植株高度和主根長，并選擇蘆葦自上而下完全展開的第2～3片葉子進(jìn)行葉綠素a和葉綠素b的測定。

1.6 圖像和數(shù)據(jù)處理

利用液相色譜儀的Chromeleon 7數(shù)據(jù)系統(tǒng)對HPLC色譜圖進(jìn)行分析，利用SPSS 20和Origin 2018處理數(shù)據(jù)和制圖。實(shí)驗(yàn)組和對照組相同生長期各指標(biāo)的差異采用SPSS軟件的獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC法測定有機(jī)酸的優(yōu)化結(jié)果

本研究最終優(yōu)化的HPLC色譜條件為檢測波長210 nm、柱溫34.5℃、流動相pH 2.55，可以在10 min內(nèi)同時定量草酸、酒石酸、奎尼酸、蘋果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸、富馬酸和反烏頭酸（圖2）。

圖2 HPLC優(yōu)化圖譜Figure 2 Optimized HPLC chromatogram

12種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)和回收率如表2所示，相關(guān)系數(shù)為0.994 01～0.999 98，表明各有機(jī)酸的濃度與相應(yīng)色譜峰的峰面積存在良好的線性關(guān)系。各有機(jī)酸的檢測限（LOD）為0.01～0.95 mg·L，定量限（LOQ）為0.02～3.18 mg·L，其中LOD均低于1 mg·L。另外，各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率在90.70%～127.58%范圍內(nèi)，回收率良好。

表2 12種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)和回收率Table 2 Standard curve parameters and recovery rates for 12 organic acids

2.2 水培體系蘆葦根系分泌物中有機(jī)酸對NSAIDs長期脅迫的響應(yīng)

優(yōu)化的HPLC法可以定量分析水培體系蘆葦根系分泌物中11種有機(jī)酸（圖3），即奎尼酸、乙酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、丙酸、丙二酸、草酸、蘋果酸和反烏頭酸。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組的有機(jī)酸釋放速率可知，在NSAIDs脅迫下，實(shí)驗(yàn)組幼苗期蘆葦?shù)挠袡C(jī)酸釋放速率與對照組相比差異較小，而展葉期和快速生長期蘆葦?shù)目崴帷幟仕?、丙二酸、草酸和蘋果酸的釋放速率顯著高于對照組，并且丙酸在快速生長期也顯著增多。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)組快速生長期蘆葦根系釋放乙酸、乳酸和琥珀酸的速率顯著低于對照組。

圖3 水培體系中蘆葦在NSAIDs長期脅迫下有機(jī)酸的釋放速率Figure 3 Organic acids'secretion rates of Phragmites australis roots under long-term NSAIDs stress in the hydroponic system

如表3所示，水培體系中，NSAIDs脅迫下蘆葦在3個生長期的株高和主根長整體略低于對照組，且無顯著性差異，但葉綠素a和葉綠素b含量顯著低于對照組（幼苗期葉綠素a除外）。NSAIDs在蘆葦根部的累積濃度如圖4所示，5種NSAIDs在蘆葦根組織中均被檢出，幼苗期、展葉期和快速生長期的NSAIDs累積濃度分別為30、54 ng·g和101 ng·g，隨著植物的生長，NSAIDs在植物根部的累積呈現(xiàn)遞增趨勢，在快速生長期累積水平較高。

圖4 水培體系中蘆葦根部NSAIDs的累積濃度Figure 4 Accumulated concentrations of NSAIDs in the roots of Phragmites australis in the hydroponic system

表3 水培體系中蘆葦?shù)纳L生理指標(biāo)Table 3 Growth and physiological indices of Phragmites australis under NSAIDs stress in the hydroponic system

已有文獻(xiàn)報(bào)道了植物具有吸收藥物并在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和累積的特點(diǎn)。通常情況下，藥物在植物體內(nèi)累積后會產(chǎn)生過量的活性氧物質(zhì)（ROS），從而誘發(fā)氧化應(yīng)激現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)水培體系中蘆葦根部的NSAIDs濃度隨著植物的發(fā)育而增加，至快速生長期已達(dá)到較高水平（圖4），并且葉綠素含量受到顯著抑制（表3），表明氧化應(yīng)激和氧化損傷發(fā)生的可能性很大。

根系分泌物中的有機(jī)酸是植物根際微生物的一種優(yōu)質(zhì)碳源，可以為微生物提供營養(yǎng)和能量，從而吸引有益微生物在根際定殖，例如：在芘污染土壤中，添加蘋果酸和琥珀酸可以顯著提高芘降解菌的生物量。本研究采用滅菌營養(yǎng)液和滅菌器皿構(gòu)建水培體系，但無法實(shí)現(xiàn)完全的滅菌環(huán)境，由此可以推測，本研究發(fā)現(xiàn)的NSAIDs脅迫下快速生長期蘆葦釋放速率顯著提高的6種有機(jī)酸（奎尼酸、檸檬酸、丙酸、丙二酸、蘋果酸和草酸），可能具備吸引有益微生物在根際定殖以減輕脅迫影響的潛力。需要注意的是，釋放速率顯著降低的乙酸、乳酸和琥珀酸相較于其他有機(jī)酸，仍然具有較高水平的釋放量，可能同樣會吸引NSAIDs降解菌在根際定殖。

2.3 人工濕地體系蘆葦根系分泌物中有機(jī)酸對NSAIDs長期脅迫的響應(yīng)

在人工濕地體系中，優(yōu)化的HPLC法檢測到蘆葦根系分泌物中11種有機(jī)酸（圖5），包括奎尼酸、檸檬酸、丙酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、草酸、乳酸、反烏頭酸、乙酸和富馬酸。在NSAIDs脅迫下，蘆葦在幼苗期分泌的有機(jī)酸中除奎尼酸和乙酸外均顯著低于對照組，但從展葉期開始，乳酸、丙酸、琥珀酸、草酸、檸檬酸等有機(jī)酸的釋放速率顯著高于對照組，至快速生長期，除乙酸外的10種有機(jī)酸的釋放速率均顯著高于對照組。

圖5 人工濕地體系中蘆葦在NSAIDs長期脅迫下有機(jī)酸的釋放速率Figure 5 Organic acids'secretion rates of Phragmites australis roots under long-term NSAIDs stress in the constructed wetland system

如表4所示，在NSAIDs脅迫下，人工濕地體系中蘆葦3個生長期的株高和主根長基本均低于對照組，且無顯著差異，但葉綠素a和葉綠素b在幼苗期和展葉期整體上顯著低于對照組，隨著植物的生長差異逐漸減小（快速生長期）。NSAIDs在蘆葦根部的累積濃度如圖6所示，4種NSAIDs可以檢出（DCF除外），在幼苗期、展葉期和快速生長期的總濃度分別為8、11、15 ng·g，表明NSAIDs會隨著植物的發(fā)育逐漸累積在根部，但累積水平較低。NSAIDs中KTP在蘆葦根部的累積濃度最高，這可能是由于KTP的lg值在5種消炎藥中最低，而lg較低的有機(jī)污染物較易在水-土界面被植物根系吸收。

圖6 人工濕地體系中蘆葦根部NSAIDs的累積濃度Figure 6 Accumulated concentrations of NSAIDs in the roots of Phragmites australis in the constructed wetland system

表4 人工濕地體系中蘆葦?shù)纳L生理指標(biāo)Table 4 Growth and physiological indices of Phragmites australis under NSAIDs stress in the constructed wetland system

本研究構(gòu)建的人工濕地體系比水培體系復(fù)雜得多，更接近實(shí)際條件，體系中微生物群落更豐富、生物量更大，根系分泌物中有機(jī)酸對根際微生物的調(diào)節(jié)作用也會更加明顯。蘆葦為減輕NSAIDs的脅迫影響可能更傾向于吸引有益微生物在體外降解NSAIDs，從而減少根系對NSAIDs的吸收，本研究發(fā)現(xiàn)人工濕地體系中蘆葦根部累積的NSAIDs要顯著低于水培體系（圖4和圖6），這也間接支持了這一猜測。在人工濕地中，蘆葦?shù)闹旮吆椭鞲L整體上大于水培體系，且葉綠素在快速生長期沒有受到顯著抑制（表3和表4），可能由于蘆葦根系對NSAIDs的吸收量降低，減少了因NSAIDs累積造成的不利影響（如氧化應(yīng)激）。

隨著蘆葦?shù)陌l(fā)育，在水培和人工濕地體系的快速生長期蘆葦根系分泌物中，均檢測到6種有機(jī)酸在NSAIDs脅迫下釋放速率顯著增大，即奎尼酸、檸檬酸、丙酸、丙二酸、蘋果酸和草酸，表明這些有機(jī)酸可能在吸引有益微生物在根際定殖以降解NSAIDs的過程中發(fā)揮重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道了有機(jī)酸對微生物降解有機(jī)污染物的促進(jìn)作用，如檸檬酸可以吸引枯草桿菌以加速菲的降解，有機(jī)酸混合物（檸檬酸、蘋果酸、乳酸、草酸和琥珀酸）可以促進(jìn)寡養(yǎng)單胞菌對多環(huán)芳烴的降解。通常微生物降解有機(jī)污染物有兩種方式：以有機(jī)污染物為唯一碳源；以其他碳源為生長基質(zhì)的同時共代謝有機(jī)污染物。基于此，可以推測奎尼酸、檸檬酸、丙酸、丙二酸、蘋果酸和草酸這6種有機(jī)酸在促進(jìn)根際有益微生物降解NSAIDs的過程中發(fā)揮的作用主要包括：促進(jìn)直接以NSAIDs為碳源的微生物生長；促進(jìn)以這些有機(jī)酸為碳源共代謝NSAIDs微生物的生長。

3 結(jié)論

（1）本研究優(yōu)化的檢測有機(jī)酸的高效液相色譜（HPLC）方法，可以在10 min內(nèi)分離12種有機(jī)酸（草酸、酒石酸、奎尼酸、蘋果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸、富馬酸和反烏頭酸），檢測限為0.01～0.95 mg·L，低于1 mg·L。

（2）在非甾體類消炎藥（NSAIDs）脅迫下的水培體系中，隨著蘆葦?shù)陌l(fā)育，根系釋放的奎尼酸、檸檬酸、丙二酸、草酸、蘋果酸、丙酸明顯增多；株高和主根長未顯著降低，但葉綠素a和葉綠素b受到顯著抑制；5種NSAIDs在蘆葦根組織中均有檢出，且隨著植物的生長呈現(xiàn)遞增趨勢，在快速生長期可達(dá)101 ng·g，累積水平較高。

（3）在NSAIDs脅迫下的人工濕地體系中，隨著蘆葦?shù)陌l(fā)育，根系分泌物中有10種有機(jī)酸的釋放速率顯著增大，包括水培體系明顯增多的有機(jī)酸；株高和主根長未顯著降低，葉綠素未受到顯著抑制；在蘆葦根組織中檢出4種NSAIDs（雙氯芬酸除外），且其濃度隨著植物的生長呈現(xiàn)遞增趨勢，在快速生長期為15 ng·g，累積水平較低。

（4）綜合來看，濕地植物蘆葦在響應(yīng)NSAIDs長期脅迫的過程中，可能傾向于通過釋放特定的有機(jī)酸促進(jìn)根際微生物降解NSAIDs，從而減少根系對NSAIDs的吸收，釋放速率明顯增多的奎尼酸、檸檬酸、丙酸、丙二酸、蘋果酸和草酸具備提高人工濕地處理地表水NSAIDs效率的潛力。