范培

（衡水學(xué)院，河北 衡水 053000）

蓮房是蓮蓬取出蓮子后的廢棄物，以此為原料可以提取出一系列天然色素混合物。這些天然色素主要是原青花素，原花青素是一類多酚化合物的總稱，是由多種兒茶素或表兒茶素組成的混合物。原花青素是目前國際上認為最有效清除自由基的純天然抗氧化劑之一，其抗氧化性能是其他維生素類的幾十倍，因此具有很好的研究價值[1-3]。原花青素普遍存在于植物細胞中，其清除自由基的性能適合應(yīng)用于食品、藥品的生產(chǎn)制作中。

蓮在我國的種植歷史很長，其生成的蓮子既可入藥也可食用，廣受人民群眾喜愛，但是蓮的花托——蓮房一般都被丟棄。干燥的蓮房質(zhì)量很輕，質(zhì)地疏松多孔，內(nèi)部多呈裂隙狀如海綿，顏色呈棕色[4]。蓮房中含有的各種活性物質(zhì)可入藥，具有止血、化瘀、祛濕的功效[5]。而原花青素是蓮房中的主要活性成分之一。

目前關(guān)于蓮房中提取色素的研究還處于初級階段，主要的研究都在其藥用價值上。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道，蓮房中提取色素的方法有微波輔助丙酮提取法[6]、脈沖超聲輔助提取法[7]和雙酶輔助乙醇提取法[8]等，對于用乙醇作為提取劑進行提取并結(jié)合超聲輔助提取用響應(yīng)面優(yōu)化法進行工藝優(yōu)化的相關(guān)報道比較少。因此本研究主要是從這方面進行實驗設(shè)計和操作，為后期蓮房中提取色素并進行工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的參考依據(jù)。

實驗設(shè)計采用的是Box-Behnken實驗設(shè)計原理，而實驗所得各項結(jié)果采用Design Expert 11軟件進行處理分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

蓮房，河北省衡水市衡水湖，采摘完整無變色的優(yōu)質(zhì)蓮蓬，去蓮子，用蒸餾水清洗后撕成細條狀，60℃下烘干至質(zhì)量恒定，粉碎，過60目篩，避光密閉保存?zhèn)溆茫粺o水甲醇、無水乙醇、濃硫酸、香草醛，所有試劑均為分析純。

TU-1800 紫外可見分光光度計；恒溫水浴鍋；TH-600BQ 超聲波清洗機；800A 研磨粉碎機；FA2004 電子天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗前期準(zhǔn)備工作

用量筒準(zhǔn)確量取400 mL 無水乙醇轉(zhuǎn)移至500 mL的容量瓶中，加蒸餾水至刻度搖勻，配制成80%體積濃度的乙醇水溶液備用。其余20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%不同體積濃度的乙醇水溶液按照同樣的方法配制好備用。再量取30 mL 濃硫酸并加入到蒸餾水中定容至100 mL 搖勻，得到體積濃度為30%的硫酸溶液備用。用電子天平準(zhǔn)確稱取30 g香草醛固體，溶解至1 L 的甲醇液體中，配制成30 g/L 的香草醛甲醇溶液。所有配制液體均放置于避光處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗色素提取

準(zhǔn)確稱取0.200 g 的干燥蓮房粉末于錐形瓶中，用配制好的某一體積濃度乙醇水溶液浸泡，此時在恒定溫度下用超聲波清洗機超聲一定時間，然后將錐形瓶中的混合液體離心分離，提取上清液定容后再進行硫酸-香草醛法[9]顯色處理，然后在預(yù)熱好的分光光度計中進行吸光度測定。

1.2.3 實驗吸光度測定

先將離心分離后的提取液定容后，再利用硫酸-香草醛法將配制好的溶液混合，并在溫度為30℃的條件下進行20 min 的避光顯色處理，然后將溶液放于1 cm 的比色皿中，在波長500 nm 條件下用紫外可見分光光度計進行吸光度測定?？瞻滓旱闹苽溥^程與試樣相同，但不加入提取液。

1.2.4 單因素實驗設(shè)計

單因素實驗過程中需先在根據(jù)大量文獻資料總結(jié)所選取的幾個單因素范圍內(nèi)分別進行實驗條件的摸索，并測定試樣的吸光度值，最后確定各單因素實驗的變化趨勢及最優(yōu)條件，確定其中幾個對實驗結(jié)果影響較大的單因素進行實驗設(shè)計，為實驗設(shè)計提供合理范圍。根據(jù)已有的科學(xué)研究基礎(chǔ)選取出超聲提取溫度、超聲提取時間、乙醇濃度、液料比和超聲功率等幾個因素進行實驗。其中結(jié)合所查文獻經(jīng)單因素實驗，摸索得到超聲提取溫度實驗范圍為25℃～50℃，超聲提取時間實驗范圍為5～20 min，乙醇濃度實驗范圍為20%～100%，液料比實驗范圍為25∶1～125∶1，超聲功率實驗范圍為300～800 W。

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)前期單因素實驗所得結(jié)果作為實驗設(shè)計的基礎(chǔ)，本實驗根據(jù)Box-Behnken 實驗設(shè)計原理，在幾組單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取對蓮房中色素提取效果影響比較大的超聲提取溫度、超聲提取時間、乙醇濃度、液料比四個因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進行設(shè)計，其具體因素水平數(shù)據(jù)如表1。根據(jù)實驗設(shè)計表中所示，需要按照不同的實驗條件再次進行實驗，測定一系列吸光度值，并將所得結(jié)果用Design Expert 11 軟件進行處理分析。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平設(shè)計表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

本實驗的幾組單因素實驗部分分別從超聲提取溫度、超聲提取時間、乙醇濃度、液料比和超聲功率五個因素進行實驗考查選擇合理范圍，選取事先從大量文獻中查得的實驗范圍，對吸光度值及其對應(yīng)的考查因素進行繪圖并分析實驗結(jié)果，進而選取合適的各單因素實驗范圍，再進行實驗設(shè)計、檢測和數(shù)據(jù)處理。

2.1.1 超聲提取時間對提取效果的影響

由圖1可知，超聲提取時間對從蓮房中提取色素的效果有較大的影響。實驗中選取超聲提取時間的范圍為5～60 min，但經(jīng)過實驗并分析實驗結(jié)果后可知，一旦超聲時間超過25 min，提取液經(jīng)測定其吸光度值變化不大，并且溶液出現(xiàn)顏色上的變化，應(yīng)該是提取時間過長，造成蓮房中大量其他物質(zhì)被溶出而影響了實驗效果，因此提取時間不易過長。經(jīng)吸光度值-超聲提取時間繪圖，峰值出現(xiàn)在10～15 min，為后期實驗設(shè)計提供了合理的取值范圍。

圖1 超聲提取時間對提取效果的影響

2.1.2 超聲提取溫度對提取效果的影響

由圖2可知，超聲提取溫度對從蓮房中提取色素的效果也有較大影響。實驗中預(yù)設(shè)的提取溫度范圍為25℃～90℃，經(jīng)實驗檢測并分析結(jié)果表明，溫度過高會引起溶出雜質(zhì)多，并且吸光度值不再有明顯的變化，說明溫度過高不利于提取的順利進行，因此將溫度控制在25℃～50℃。在圖2中可直觀看到，吸光度值-超聲提取溫度的峰值出現(xiàn)在溫度為30℃左右時，吸光度值達到高點，可視為在此條件下出現(xiàn)了提取的最優(yōu)效果，由此確定了響應(yīng)面法設(shè)計實驗的超聲提取溫度取值范圍。

圖2 超聲提取溫度對提取效果的影響

2.1.3 料液比對提取效果的影響

由圖3可知，料液比對從蓮房中提取色素的效果影響比較大。實驗過程是選取了料液比的范圍為5∶1～150∶1，通過實驗結(jié)果分析，吸光度-料液比的峰值出現(xiàn)在當(dāng)料液比在50∶1 左右時，可視為達到了最佳提取效果，由此可確定響應(yīng)面法設(shè)計實驗的料液比取值范圍。

圖3 料液比對提取效果的影響

2.1.4 乙醇濃度對提取效果的影響

由圖4 可知，乙醇濃度對色素提取效果影響較大。實驗過程中當(dāng)乙醇濃度由低到高變化時，提取效果變化較大，當(dāng)吸光度值-乙醇濃度的曲線峰值出現(xiàn)在濃度達到50%左右時，此時吸光度值達到最高，提取效果最佳。由此可確定，乙醇濃度為響應(yīng)面法設(shè)計實驗的重要影響因素之一，其取值范圍也可確定下來。

圖4 乙醇濃度對提取效果的影響

2.1.5 超聲提取功率對提取效果的影響

經(jīng)單因素實驗表明，在提取過程中超聲功率范圍在300～800 W之間時，由實驗提取液定容顯色后測得的吸光度值變化不大，所得吸光度值-超聲功率曲線趨于水平趨勢，可視為超聲功率變化對提取效果的影響不大，在后面進行響應(yīng)面法設(shè)計實驗時其影響可忽略不計。

因此，在接下來的實驗設(shè)計中，只選取單因素實驗中的超聲提取時間、超聲提取溫度、料液比和乙醇濃度四個因素，并把四個因素的變化考查范圍進行了確定。

2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計

以選擇的幾組單因素實驗結(jié)果為依據(jù)，用Design Expert 11 軟件的Box-Behnken 實驗設(shè)計方案進行實驗設(shè)計，可知后續(xù)實驗共需制備27個試樣，并將檢測吸光度值作為響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果，后期進行數(shù)據(jù)分析，具體設(shè)計結(jié)果如表2所示。

表2 超聲提取蓮房色素響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)處理結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面設(shè)計雙因素影響結(jié)果分析

圖5 各因素交互作用對蓮房中色素提取的影響

由圖5（a～f）可知，實驗設(shè)計所選取的四個考查因素對于提取蓮房中的色素都有很大的影響。其中由圖5（a、b、f）中幾個雙因素交互作用效果圖可知，圖中所顯示的等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明料液比、超聲提取時間對提取效果的影響更為顯著一些。隨著超聲提取時間、料液比、超聲提取溫度、乙醇濃度數(shù)值的逐漸增加，表示色素提取效果的吸光度值呈現(xiàn)由低到高再逐漸降低的趨勢，吸光度值變化比較明顯，進而使整體曲面的變化效果比較明顯，能夠顯示出這幾個因素對提取色素的效果影響比較大，是進行實驗的四個重要考查因素，其中對實驗效果的影響規(guī)律：料液比＞超聲提取時間＞超聲提取溫度＞乙醇濃度。

3 結(jié)論

在本次衡水湖產(chǎn)蓮房中提取色素的實驗研究過程中，以單因素實驗為基礎(chǔ)，通過響應(yīng)面法組合設(shè)計實驗條件進行實驗測定吸光度值，整合實驗數(shù)據(jù)，用Design Expert 11軟件分析出從蓮房中提取色素的最優(yōu)條件，及各因素對實驗結(jié)果的影響大小。經(jīng)分析軟件處理結(jié)果圖可知，提取蓮房中色素的最優(yōu)條件：超聲提取溫度37.5℃，超聲提取時間12.5 min，料液比75∶1，乙醇濃度60%。經(jīng)過對實驗結(jié)果圖的處理分析可知，在以上最佳提取條件下進行色素提取，可以達到最理想的提取效果，其中對提取效果影響最大的因素是料液比，其次為超聲提取時間、超聲提取溫度、乙醇濃度。

本實驗研究的目的是通過實驗得到可靠的實驗數(shù)據(jù)，再通過Design Expert 11軟件進行結(jié)果分析，找到幾個對從蓮房中提取色素影響較大的幾個因素，并確定最優(yōu)條件，為后期提取天然色素的實驗方法和實驗條件提供依據(jù)，為提高衡水湖產(chǎn)蓮房的利用率，進而提高其經(jīng)濟效益提供參考。