韓惠超 葉世蕓* 殷少文 劉巧 張艷琴

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴陽(yáng)市第三人民醫(yī)院；3.貴州得軒堂護(hù)康藥業(yè)股份有限公司）

1 前言

苦參為豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲利尿的功效，主要用于治療赤白帶下、陰腫陰癢[1]。其特征明確的成分為苦參生物堿和苦參黃酮[2]，其中黃酮類化合物主要有抗炎、抗病毒等作用[3-5]。中藥的有效成分是物質(zhì)群，而非單一的化學(xué)成分[6]。目前，關(guān)于苦參黃酮質(zhì)量控制的研究較少，覆蓋全國(guó)七大產(chǎn)區(qū)的苦參黃酮類成分指紋圖譜研究?jī)H有一篇[1]，且采用的是多個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)的方法[7-10]?；诖耍疚氖占珖?guó)14個(gè)產(chǎn)地共30批次苦參藥材為檢測(cè)樣品，覆蓋了東北、華北、華東、華中、華南、西南、西北7個(gè)產(chǎn)區(qū)，采用單一波長(zhǎng)方法，通過(guò)指紋圖譜和含量測(cè)定，對(duì)苦參黃酮類成分含量的地區(qū)差異進(jìn)行研究，以期為苦參的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

2 材料

2.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-20AT型，日本島津公司）；色譜柱（Ultimate? XB-C18，規(guī)格：250×4.6mm，5 μm，月旭科技股份有限公司）。

2.2 藥品與試劑

三葉豆紫檀苷對(duì)照品（批號(hào)161108，純度≥98%）；苦參醇F對(duì)照品（批號(hào)170901，純度≥98%）；苦參酮對(duì)照品（批號(hào)161011，純度≥98%）（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）。甲醇、乙醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定，本文采集的30批不同產(chǎn)地的苦參飲片，均為豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，來(lái)源信息見表1。

表1 苦參飲片的來(lái)源

3 方法與結(jié)果

3.1 建立指紋圖譜

3.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取適量的三葉豆紫檀苷、苦參酮、苦參醇F對(duì)照品；加入甲醇，配制成每1 mL含三葉豆紫檀苷0.725 mg、苦參酮1 mg、苦參醇F 0.830 mg的對(duì)照品溶液，搖勻。

3.1.2 供試品溶液的制備

稱取苦參粉末0.5 g（過(guò)3號(hào)篩），置于50 ml錐形瓶中；加入75%的乙醇25 mL，稱定；超聲提取1 h，補(bǔ)足重量，搖勻，靜置；經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

3.1.3 色譜條件

采用Ultimate? XB-C18（250×4.6mm，5 μm）色譜柱，乙腈（A）—水（B）為流動(dòng)相梯度洗脫，程序：0～25 min，40%～50%A；25～30 min，50%～70%A；30～38min，70%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：295 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35℃；流速：1 mL/min。

3.1.4 精密度試驗(yàn)

取S1號(hào)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，以苦參酮為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均＜3%，表明儀器具有良好的精密度。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S1號(hào)供試品溶液，在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，以苦參酮作為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均＜3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取S1號(hào)供試品溶液6份，分別進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，以苦參酮作為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD和相對(duì)峰面積RSD均＜3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.1.7 指紋圖譜的生成

按“3.1.2”項(xiàng)的方法制備30批樣品的供試品溶液，按“3.1.3”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 A版）進(jìn)行分析，詳見圖1。

圖1 31批苦參飲片指紋圖譜

3.1.8 相似度評(píng)價(jià)

采用上述評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，計(jì)算30批樣品之間的相似度。結(jié)果顯示，30批樣品相似度范圍在0.914～1.000之間，均＞0.9。

3.2 含量測(cè)定

3.2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“3.1”項(xiàng)配置的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)針測(cè)定，測(cè)得三葉豆紫檀苷、苦參酮、苦參醇F的線性方程分別為Y=107X+4229.4（R2=0.999 6）、Y=2×107X-26 918（R2=1）、Y=4×107X-309 64（R2=0.999 9），分 別 在0.002 84～0.181 20、0.005 87～0.375 00、0.003 25～0.207 50范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按“3.1”項(xiàng)的色譜條件重復(fù)進(jìn)針6次，測(cè)得三葉豆紫檀苷、苦參酮、苦參醇F、峰面積值RSD分別為0.82%、0.79%、1.12%，均＜3.0%，表明該儀器的精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取苦參粉末0.5 g（編號(hào)：S1），精密稱定，按“3.1”項(xiàng)提取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、16 h時(shí)，進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得三葉豆紫檀苷、苦參酮、苦參醇F的峰面積值RSD分別為0.57%、1.79%、2.17%（n=6），均＜3.0%，表明樣品在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取該藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“3.1”項(xiàng)提取供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得三葉豆紫檀苷、苦參酮、苦參醇F峰面積值RSD分別為0.82%、0.79%、1.13%，均＜3.0%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

3.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知濃度的苦參粉末9份，每份約0.25 g，精密稱定后按高、中、低劑量加入標(biāo)準(zhǔn)品，按“3.1”項(xiàng)提取供試品進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

（續(xù)表2）

3.2.6 30批樣品含量測(cè)定

取30批苦參藥材，按“3.1”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，測(cè)定各批苦參藥材中三葉豆紫檀苷、苦參酮、苦參醇F的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3.3 聚類分析

將30批苦參樣品中3種黃酮類成分的含量測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 21.0軟件，選用組內(nèi)連接聚類法進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。以d=10劃分，30批樣品共聚為3類：樣品S6、S16聚為第Ⅰ類，各個(gè)成分的含量均相對(duì)較高，分別來(lái)自廣西和黑龍江；樣品S8、S17聚為第Ⅱ類，各個(gè)成分的含量均相對(duì)較低，分別來(lái)自貴州和湖南；其余26批樣品聚為第Ⅲ類，均來(lái)自內(nèi)蒙、云南、四川等地，樣品中總含量在9.33～16.63 mg/g之間。

圖2 31批苦參樣品聚類分析圖

4 討論

本文在前期研究中，考察了回流提取法、超聲提取法這2種提取方法，比較了不同提取溶劑（甲醇、乙醇），結(jié)果表明無(wú)顯著差異，考慮到方法的經(jīng)濟(jì)性，故選擇乙醇回流提取的方法。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、回流時(shí)間、料液比為影響因素，三葉豆紫檀苷，苦參醇F，苦參酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化苦參提取條件。

指紋圖譜相似度結(jié)果顯示，30批苦參樣品的相似度良好，表明苦參藥材化學(xué)成分大部分產(chǎn)地的一致性較好；不同產(chǎn)地30批苦參藥材中3種黃酮類成分含量測(cè)定的直觀分析結(jié)果顯示，質(zhì)量最高的苦參產(chǎn)于廣西，質(zhì)量最低的苦參產(chǎn)于湖南。

聚類分析結(jié)果顯示，廣西、黑龍江產(chǎn)樣品中3種成分的總含量較高，貴州、湖南產(chǎn)樣品中3種成分的總含量較低，其余26批樣品均聚為一大類，以內(nèi)蒙、四川、云南等地為主要類別，產(chǎn)區(qū)之間的差異亦不明顯。馬鴻雁等[8]研究發(fā)現(xiàn)，甘肅樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，而本文研究發(fā)現(xiàn)，貴州、湖南等5個(gè)省份樣品的含量均低于甘肅，推測(cè)出現(xiàn)這種情況的原因可能與苦參的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，有待后續(xù)研究的進(jìn)一步探討。

綜上所述，本文所建指紋圖譜和3種黃酮類化合物成分的含量測(cè)定方法可行，能夠?yàn)榭鄥⑺幉牡馁|(zhì)量控制提供參考，值得推廣。