勞文艷，楊秦亮，范子軒，任 超

(1.北京聯(lián)合大學 生物化學工程學院,北京 100023.金訶藏藥(山東)健康產(chǎn)業(yè)有限公司,濟南 2501043 北京聯(lián)合大學 應用文理學院保健食品功能檢測中心,北京 100191)

隨著空氣污染的加重，PM2.5已經(jīng)嚴重危害人類健康。近年來，多地大氣PM2.5濃度達到歷史峰值[1]。流行病學研究表明，PM2.5可影響人體呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等多個系統(tǒng)，其中以呼吸系統(tǒng)毒性最為明顯[2-3]。姜黃素具有抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性[4]，諸多研究證明其在肺功能改善方面具有明顯功效，例如，姜黃素可改善膿毒癥大鼠的肺損傷，調節(jié)免疫功能，降低炎癥反應[5]。姜黃素可改善肺炎鏈球菌致肺炎幼鼠肺組織的損傷，減輕炎癥反應[6]。關于姜黃素能否有效干預PM2.5造成的肺損傷，國內研究較少。本研究通過PM2.5氣管滴注染毒制備大鼠急性肺損傷模型，并用姜黃素進行干預處理，探索姜黃素對大鼠肺部氧化應激水平、炎性因子等的影響，為姜黃素在干預PM2.5肺損傷功能方面的應用提供研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選用體重為180～220 g的SPF級健康SD雄鼠50 只，實驗動物質量合格證為110322210100996787，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SCXK(京)2019-0008(動物批號20210422)。在北京聯(lián)合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心屏障級動物房飼養(yǎng)，動物使用許可證號為SYXK(京)2014-0031。

1.1.2材料與試劑

姜黃素(寧波中藥制藥股份有限公司)，白細胞介素-1β酶聯(lián)免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，乳酸脫氫酶試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，丙二醛試劑盒(南京建成生物工程研究所)，超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，酸性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3儀器

大流量空氣顆粒物采樣器(中國，天虹), 多功能酶標儀(美國，Thermo)，UV2600紫外可見分光光度計(日本，島津)，生化分析儀(美國，BECKMAN)，MK360石英濾膜(瑞典，Munktell)，病理制片系統(tǒng)(德國，Leica)，冷凍離心機(德國，Sigma)。

1.2 方法

1.2.1PM2.5的收集和染毒懸液的制備

通過大容量空氣顆粒物采樣器(配PM2.5切割器)和石英濾膜采集大氣細顆粒物，流量為1.05 m3·min-1，采集時間為2020年10月至2021年2月，每日連續(xù)采集22 h，間隔2 h。采集完成后將石英膜剪切成1 cm×3 cm，低溫超聲振蕩6次，每次超聲25 min，洗脫顆粒物，振蕩液經(jīng)8層紗布過濾，真空冷凍干燥成粉，用無菌生理鹽水配制成PM2.5懸液。

1.2.2實驗分組與染毒

將50只SD大鼠隨機分為5組：空白對照組、PM2.5模型對照組、低劑量姜黃素(100 mg·kg-1)+PM2.5組、中劑量姜黃素(200 mg·kg-1)+PM2.5組、高劑量姜黃素(300 mg·kg-1)+PM2.5組，每組10只。

低、中、高3個劑量的姜黃素 + PM2.5組于染毒前連續(xù)用營養(yǎng)素溶液灌胃14 d，空白組和PM2.5模型組用無菌生理鹽水灌胃，灌胃時間為上午9點，灌胃容量均為10 mL·kg-1。于灌胃第15 d開始，在灌胃后2 h內用4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，按3 mL·kg-1容量進行氣管滴注，PM2.5模型組和姜黃素+PM2.5組按9.0 mL·kg-1氣管滴注PM2.5懸液，連續(xù)染毒3次，每次間隔24 h；空白組氣管滴注無菌生理鹽水。

1.2.3動物處理、樣本采集及測定各樣本指標

1) 血清

在末次染毒24 h后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，股動脈取血，離心分離血液上清液，檢測MDA和SOD水平。

2) 肺泡灌洗液

在處死大鼠后，以止血鉗夾閉左主支氣管，往氣管中插入肺灌洗針頭，結扎固定。向肺部緩慢注入3 mL冷磷酸緩沖液，輕按揉肺部，緩慢抽出灌洗液，反復操作3次。將肺泡灌洗液經(jīng)2次離心取上清，檢測LDH、ACP和AKP水平。

3) 肺組織勻漿

稱取未經(jīng)灌洗的肺葉約0.3 g，剪碎后加入冰無菌生理鹽水，低溫下充分勻漿，離心后取上清液測量TNF-α和IL-1β水平。

4) 肺組織病理學觀察

取未經(jīng)灌洗部分的肺葉，經(jīng)固定，取中段肺組織進行切片，蘇木精—伊紅(HE)染色，盲法閱片，光鏡下觀察肺組織的病理學改變。

以上涉及試劑盒的操作均嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行分析，計量資料以±s表示。均數(shù)比較采用單因素方差分析；組間均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對PM2.5致肺損傷大鼠肺毒性指標的影響

與空白對照組比較，PM2.5模型組BALF中的AKP、ACP和LDH水平顯著提高(P< 0.01)。與PM2.5模型組比較，中、高劑量姜黃素 + PM2.5組BALF中的AKP、ACP和LDH水平降低(P< 0.01)，低劑量姜黃素 + PM2.5組BALF中的ACP和LDH水平降低(P< 0.05，P< 0.01)。低劑量姜黃素 + PM2.5組BALF中的AKP水平差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)(見表1)。由此可見，中高劑量組的姜黃素能有效降低PM2.5滴注引起的大鼠肺損傷的肺毒性指標。

表1 姜黃素對大鼠BALF中LDH、ACP和AKP含量水平的影響Table 1 Effects of Curcumin on the Levels of LDH, ACP and AKP in BALF of Rats

2.2 姜黃素對PM2.5致肺損傷大鼠炎性損傷指標的影響

與空白對照組比較，PM2.5模型組大鼠肺勻漿中的TNF-α和IL-1β含量均顯著升高(P<0.01)。與PM2.5模型組比較，低、中、高3個劑量姜黃素+PM2.5組的TNF-α和IL-1β含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。由此說明，通過姜黃素的干預，能有效降低大鼠肺勻漿中TNF-α和IL-1β的含量。

表2 姜黃素對大鼠肺勻漿中TNF-α和IL-1β含量水平的影響Table 2 The Effect of Curcumin on the Content of TNF-α and IL-1β in Rat Lung Homogenate

2.3 姜黃素對PM2.5致肺損傷大鼠氧化應激損傷指標的影響

與空白對照組相比，PM2.5模型對照組大鼠血清中的MDA值與SOD活性值差異顯著(P<0.05)，MDA值升高，SOD活力降低。與PM2.5模型組相比，中、高劑量姜黃素 + PM2.5組的MDA值均降低(P< 0.05)，SOD活性水平均升高(P< 0.01)。低劑量姜黃素 + PM2.5組的SOD活性水平均升高(P< 0.05)，MDA值降低但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3)。由此說明，中、高劑量組的姜黃素能夠有效干預PM2.5造成的大鼠肺損傷的氧化應激指標，低劑量組的姜黃素也能部分改善大鼠肺損傷的氧化應激指標。

表3 姜黃素對大鼠血清中MDA和SOD活性水平的影響Table 3 The Effect of Curcumin on the Activity Levels of MDA and SOD in Rat Serum

2.4 肺組織形態(tài)學改變

各組大鼠肺組織病理形態(tài)如圖1所示。空白對照組：肺泡結構完整，肺泡間隔正常，未見出血和炎性浸潤。PM2.5模型組：肺泡結構破壞嚴重，肺泡間隔增厚，可見大量壞死組織碎片、出血、炎性細胞和細顆粒物。低劑量姜黃素+PM2.5組：肺泡間隔較厚，小部分肺泡結構可以識別，可見少量壞死組織碎片、炎性細胞和細顆粒物。中劑量姜黃素+ PM2.5組：肺泡間隔輕微增厚，肺泡結構可以識別，未見脫落的組織碎片，少量炎性細胞浸潤。高劑量姜黃素+ PM2.5組：肺泡間隔輕微增厚，肺泡結構較清晰，未見脫落的組織碎片，偶見少量炎性細胞浸潤。由此可見，姜黃素對PM2.5滴注造成的肺損傷有一定的保護作用，實驗過程的3個劑量隨著濃度的升高病理圖片改善效果顯著。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(HE染色，200×)Fig.1 The Effect of Curcumin on the Activity Levels of MDA and SOD in Rat Serum (±SD)注: 對照組(圖1A)、PM2.5模型組(圖1B)、姜黃素低劑量組(圖1C)、姜黃素中劑量組(圖1D)、姜黃素高劑量組(圖1E)

3 討論

多項研究表明，PM2.5滴注造成急性肺損傷的核心機制是氧化應激和炎性損傷[7]。PM2.5能刺激細胞產(chǎn)生大量活性氧，蓄積的活性氧會干擾SOD的表達并引起脂質過氧化代謝終產(chǎn)物MDA的增加[8]，從而引起DNA氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，PM2.5模型組中血清SOD的活力降低，MDA的含量增加，說明氣管滴注PM2.5成功引起了大鼠肺部急性氧化應激損傷。姜黃素干預后，大鼠SOD的活力升高，MDA的含量降低，說明姜黃素能抗氧化并減輕PM2.5導致的氧化損傷。

IL-1β和TNF-α是機體早期炎性反應的敏感指標[9]。PM2.5破壞呼吸系統(tǒng)氣道粘膜纖毛屏障，沉積并刺激血管內皮細胞、支氣管和肺泡上皮細胞，巨噬細胞釋放大量炎性因子，如TNF-α和IL-1β[10]。PM2.5造成肺部實質性細胞膜損傷從而改變肺的通透性，ACP、AKP和LDH會大量溢出細胞外，這3個指標是細胞膜損傷的早期敏感指標，是細胞毒性標志物[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，PM2.5模型組大鼠肺勻漿中的TNF-α和IL-1β以及BALF中的ACP、AKP和LDH水平均升高，表明PM2.5具有引起大鼠急性肺部炎癥及毒性作用。經(jīng)姜黃素干預后，各劑量組的 TNF-α和IL-1β含量均降低，中、高劑量姜黃素組中的ACP、AKP和LDH水平均降低。低劑量姜黃素組中的ACP和LDH差異顯著，AKP差異不顯著。此結果顯示，減輕PM2.5所致急性肺部炎性損傷的效果與劑量有關，中、高劑量姜黃素的效果更顯著。肺病理形態(tài)學結果同樣顯示，高劑量姜黃素干預對PM2.5誘發(fā)的肺泡間隔增厚、肺泡結構破損和炎性細胞浸潤等有減輕作用。

實驗結果表明，一定劑量的姜黃素可以通過減輕氧化應激和炎性損傷，對PM2.5所致的大鼠肺損傷具有一定的保護作用。