苗鈞魁，張雅婷，金永霈，劉小芳，于 源，冷凱良,2,*，楊增光，蔣永毅

（1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島市極地漁業(yè)資源開發(fā)工程研究中心，山東青島 266071；2.青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室，山東青島 266200；3.青島菲優(yōu)特檢測有限公司，山東青島 266111）

隨著全球漁業(yè)資源的衰退，南極磷蝦資源作為可持續(xù)的漁業(yè)替代資源，受到越來越多的關(guān)注[1]。南極磷蝦生物量可達6.5～10 億噸[2]，南極海洋生物資源養(yǎng)護委員會（CCAMLR）制定的謹慎性捕撈限額為561 萬噸，而目前實際捕撈量約為20～30 萬噸，因此，南極磷蝦資源具有巨大的開發(fā)潛力[3]。南極磷蝦富含優(yōu)質(zhì)的蛋白、脂肪、蝦青素、礦物質(zhì)等成分，是優(yōu)質(zhì)的食品和保健品原料。以南極磷蝦為原料開發(fā)的磷蝦油產(chǎn)品，因其具有良好的營養(yǎng)功效而備受關(guān)注[4-5]。

南極磷蝦油富含磷脂、EPA、DHA 等多ω-3 多不飽和脂肪酸、蝦青素等多種功效成分[6]，相較于魚油，其中ω-3 多不飽和脂肪酸與磷脂形成的磷脂復(fù)合物具有更好的生物利用度和生物活性[7]，并且可以更好的促進蝦青素等脂溶性活性物質(zhì)的吸收[8]。在營養(yǎng)健康方面，南極磷蝦油具有心血管預(yù)防[9-10]、抗炎[11-12]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)/糖代謝[13-14]、保護神經(jīng)功能[15-16]等多種功效。2008 年磷蝦油獲得美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）公認安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）認證，2009 年歐盟也批準其作為新資源食品[6]，2013 年被中國衛(wèi)計委（現(xiàn)為國家衛(wèi)生健康委員會）批準為新食品原料，2019 年4 種磷蝦油產(chǎn)品已獲得保健食品批號。磷蝦油未來極有可能獲得與魚油同等的認可程度，具有廣闊的市場前景[17]。

隨著市場熱度的不斷提升，各類磷蝦油產(chǎn)品層出不窮，品質(zhì)差異很大，對于磷蝦油產(chǎn)品品質(zhì)指標的檢測需求也相應(yīng)提升。行業(yè)標準SC/T 3506-2020《磷蝦油》中對于蝦油產(chǎn)品品質(zhì)鑒定的主要指標包括：EPA、DHA、磷脂、蝦青素、酸價等，以上檢測方法均需要專業(yè)檢測人員和設(shè)備投入，檢測周期長，檢測成本高，極大的增加了生產(chǎn)企業(yè)的成本，因此亟需一種低成本的快速檢測方法實現(xiàn)南極磷蝦油多指標檢測，以滿足產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需求。

近紅外光譜檢測方法通過化學計量學建立近紅外吸收光譜與待測成分含量間的關(guān)系模型，能夠?qū)崿F(xiàn)對于目標成分的快速準確測定[18]，現(xiàn)已發(fā)展成為多指標快速檢測的主要方法，在食品[19]、醫(yī)藥[20]、農(nóng)業(yè)[21]等眾多行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。在油脂產(chǎn)品定性和定量檢測方面，近紅外檢測方法也具有很好的應(yīng)用前景[22]。張瑜等[23]利用可見-近紅外檢測方法對魚油摻假進行定量分析，通過建立偏最小二乘回歸（Partial least squares regression，PLSR）模型實現(xiàn)對對魚油摻假物含量的檢測；王楠等[24]建立了魚油中EPA 和DHA 含量的近紅外快速檢測方法，其中兩種成分的預(yù)測模型RC均達到0.94 以上。但近紅外檢測技術(shù)在磷蝦油檢測方面的應(yīng)用研究尚未見報道。本文收集了10 種不同規(guī)格的南極磷蝦油樣品，依據(jù)SC/T 3506-2020《磷蝦油》測定魚油中磷脂、EPA、DHA、蝦青素的含量及酸價，采用偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）建立近紅外檢測模型，通過多種處理方法的比較，擇優(yōu)確定最優(yōu)模型條件，從而實現(xiàn)對南極磷蝦油樣品中磷脂、EPA、DHA、蝦青素含量和酸價等多指標的快速準確測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦油 青島南極維康生物科技有限公司提供，采樣于2018 年10 月～2019 年11 月，分別為：脫磷脂蝦油樣品1 份，標為1 號。未經(jīng)精制處理的毛油樣品2 份，標為2、3 號。搜集到的代表性南極磷蝦油成品樣品7 份，分別標為4～10 號。

Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀，配備液體透射檢測模塊、RESULT M 樣品光譜采集的集成軟件以及TQ analyst 數(shù)據(jù)處理軟件 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 為提升近紅外檢測方法的準確度，需擴大待測樣品的數(shù)量。不同南極磷蝦油樣品經(jīng)充分混合后可形成相同均一性的新樣品，因此將原始樣品按照等比例兩兩混勻，得到總計50 個磷蝦油樣品，使各指標含量梯度分布更加均勻。混合后樣品于-20 ℃冰箱中密封儲存以待后續(xù)實驗使用。

將于-20 ℃中取出的凝固態(tài)南極磷蝦油樣品置于40 ℃水浴中加熱至其成為可流動的液體，將融化后樣品分為兩部分，分別進行NIR 光譜采集和5 種成分含量的化學值測定。

1.2.2 近紅外光譜采集 液體樣品采用專用的液體透射檢測模塊采集光譜圖像。參照王楠等利用近紅外光譜技術(shù)快速測定魚油中EPA 和DHA 含量的方法對南極磷蝦油進行檢測[24]。研究儀器開始掃描工作前，開機預(yù)熱30 min。隨后將南極磷蝦油樣品倒入比色皿中，高度約為比色皿高度的四分之三，要求樣品均勻，且無明顯氣泡存在干擾實驗結(jié)果，比色皿用擦鏡紙擦拭干凈確保無樣品殘留干擾。光譜掃描波數(shù)為10000～4000 cm-1，樣品掃描次數(shù)為4次得平均光譜。共50 個樣品，掃描完成后得到的各樣品平均光譜數(shù)據(jù)50 個，用于近紅外檢測模型的建立及驗證。

1.2.3 化學真實值測定 樣品光譜采集完成后，依據(jù)水產(chǎn)行業(yè)標準SC/T 3506-2020《磷蝦油》對10 個初始南極磷蝦油樣品的磷脂、DHA、EPA、蝦青素和酸價進行測定，其中磷脂采用GB/T 5537-2008 第一法鉬藍比色法測定；EPA 和DHA 采用GB 5009.168-2016 第二法中水解-提取法測定；蝦青素采用SC/T 3053-2019 高效液相色譜法測定；酸價采用GB 5009.229-2016 第二法測定。每個樣品平行測試3次，測量結(jié)果取算數(shù)平均值。

1.2.4 模型建立和驗證 建模前，先借助軟件TQ Analyst，完成所有樣品的原始NIR 圖譜數(shù)據(jù)處理工作。采用PLS 作為建模的化學計量法，分別借助導(dǎo)數(shù)與平滑結(jié)合的6 種光譜處理技術(shù)處理所采集的光譜，確定出最佳處理手段，其中最佳光譜范圍由軟件TQ analyst 自動推薦。

檢驗?zāi)Ｐ偷脑u價參數(shù)包括建模相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient in calibration，RC）、校正殘差均方根（Root mean square error of calibration，RMSEC）、誤差交互驗證相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient in cross validation，RCV）、交互驗證殘差均方根（Root mean square error of cross validation，RMSECV）、交叉驗證用樣品真實值標準差（SD）與RMSECV 的比值（The ratio of the RMSECV to standard deviation of reference data in the validation，RPDCV）、外部驗證相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient in external validation，REV）、外部驗證殘差均方根（Root mean square error of external prediction，RMSEP）以及外部驗證用樣品真實值的標準差（SD）與RMSEP 的比值（The ratio of the RMSEP to standard deviation of reference data in the prediction, RPDEV）[25]。

內(nèi)部驗證采取交叉驗證模型來進行，校正樣品中的每個樣品依次作為臨時驗證樣品，除被選中的臨時驗證樣品外的其余樣品作為建模樣品，構(gòu)成模型來對臨時驗證樣品進行預(yù)測，依次循環(huán)完所有樣品以得到交叉預(yù)測值。在50 個樣品中隨機抽取10 個樣品作為建模的外部驗證集，40 個樣品作為建模集，并建模過程中會對造成預(yù)測模型明顯偏差的點位進行剔除。本實驗中50 個樣品的建模集合驗證集的樣本數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦油5 種成分含量指標描述性統(tǒng)計

表1為5 種不同成分建模集和驗證集的樣本數(shù)、平均值與標準偏差以及范圍。表中數(shù)據(jù)顯示各種成分含量差值較大，建模集中磷脂、EPA、DHA、酸價和蝦青素的最大值與最小值的比值分別為3.70、2.77、3.00、20.30 和8.80，驗證集中磷脂、EPA、DHA、酸價和蝦青素的最大值與最小值的比值分別為3.37、1.64、2.42、4.95 和3.61，符合近紅外光譜建模條件中樣品含量分布范圍廣的要求。

表1 磷蝦油樣品建模集和驗證集樣品成分含量Table 1 Component content of krill oil samples in calibration set and validation set

2.2 光譜數(shù)據(jù)

南極磷蝦油樣品的NIR 原始光譜如圖1所示。圖譜顯示了10000～4000 cm-1范圍內(nèi)所有樣品的掃描全光譜。如圖所示，所有樣品的光譜具有基本相同的特征，表明磷蝦油近紅外吸收特性在掃描的光譜范圍內(nèi)基本相同。

圖1 南極磷蝦油樣品近紅外全光譜Fig.1 NIR spectrum of Antarctic krill oil samples

南極磷蝦油作為脂肪類物質(zhì)在8621 cm-1脂肪烴羰基C-O 伸縮振動的四級倍頻、8258 cm-1脂肪烴亞甲基的C-H 伸縮振動的二級倍頻、5735 cm-1甲基的C-H 的伸縮振動和5853cm-1脂肪烴端甲基的C-H 振動處具有顯著吸收峰；4500 cm-1為O-H的伸縮振動，體現(xiàn)為水的特征峰。

2.3 模型的建立與優(yōu)化

近紅外光譜測量過程中，經(jīng)常出現(xiàn)光譜偏移或飄移，導(dǎo)數(shù)處理可有效地消除基線和其他背景的干擾，分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度，常用的處理方式有光譜的一階導(dǎo)數(shù)處理（first derivation，F(xiàn)D）和二階導(dǎo)數(shù)處理（second derivation，SD）。經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后的近紅外光譜見圖2 和圖3。磷蝦油的近紅外光譜經(jīng)導(dǎo)數(shù)處理后8000 cm-1范圍內(nèi)的特征吸收峰被消除，特征吸收峰集中在4000～7000 cm-1范圍內(nèi)，縮小了有效光譜范圍，提高了模型的計算速度和準確性。

圖2 南極磷蝦油樣品一階導(dǎo)數(shù)處理近紅外光譜Fig.2 FD processing NIR of Antarctic krill oil sample

圖3 南極磷蝦油二階導(dǎo)數(shù)處理近紅外光譜Fig.3 SD processing NIR of Antarctic krill oil sample

平滑是最常用的降噪方法，其實質(zhì)是一種加權(quán)平均法，強調(diào)中心點的中心作用。通常的平滑方式為兩種，Savitzky-Golay 卷積平滑（SG）和Norris 平滑（N）。Savitzky-Golay 卷積平滑可以降低譜圖的數(shù)據(jù)分辨率，并平滑掉小的譜峰。Norris 平滑常用于增加被寬譜帶覆蓋的尖峰。

對南極磷蝦油的磷脂、EPA、DHA、蝦青素和酸價5 種指標分別進行FD、FD+SG、FD+N、SD、SD+SG 和SD+N 等6 種單一或復(fù)合方式處理，結(jié)果如表2～表6所示。

表2 南極磷蝦油磷脂近紅外光譜不同方式處理預(yù)測模型效果比較Table 2 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for phospholipid in Antarctic krill oil

表6 南極磷蝦油蝦青素近紅外光譜不同處理方式模型結(jié)果比較Table 6 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for astaxanthin in Antarctic krill oil

近紅外建模相關(guān)系數(shù)（RC）、交互驗證相關(guān)系數(shù)（RCV）和外部驗證相關(guān)系數(shù)（REV）值與1 越相近證明模型的精準度越高；定標標準分析誤差（RMSECV）、驗證標準分析誤差（RMSEP）越小，證明模型的擬合度越高，RMSECV 和RMSEP 越接近，證明模型的穩(wěn)定性越高。

磷蝦油中磷脂、EPA、DHA 和酸價四個指標的原始光譜近紅外預(yù)測模型圖見圖4，其主要參數(shù)RC、REV 和RCV 均大于0.92，其中EPA 和DHA更達到0.97 以上，經(jīng)處理后四個指標的的模型三類相關(guān)系數(shù)得到提升，都達到0.95 以上，說明近紅外檢測方法適用于這四個指標的快速檢測，可以得到較好的預(yù)測結(jié)果。在不同的處理條件下，RMSECV 和RMSEP 也較為接近，說明近紅外預(yù)測模型預(yù)測穩(wěn)定性較好。

圖4 南極磷蝦油樣品磷脂建模集以及外部驗證Fig.4 Antarctic krill oil sample phospholipid modeling set and external verification

蝦青素的各種處理方式得到的模型預(yù)測結(jié)果均不理想，可能的主要原因，一是南極磷蝦油產(chǎn)品中蝦青素含量較低，普遍低于250 mg/kg，不適合采用近紅外檢測方法進行定量；二是蝦青素在磷蝦油中并非單一組分，其主要以蝦青素酯形式存在，各類蝦青素酯之間存在差異，且含量較低[26-27]，在近紅外檢測條件下無法進行統(tǒng)一定量。

表3 南極磷蝦油EPA 近紅外光譜不同方式處理預(yù)測模型效果比較Table 3 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for EPA in Antarctic krill oil

表4 南極磷蝦油DHA 近紅外光譜不同方式處理預(yù)測模型效果比較Table 4 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for DHA in Antarctic krill oil

表5 南極磷蝦油酸價近紅外光譜不同方式處理預(yù)測模型效果比較Table 5 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for acid value in Antarctic krill oil

經(jīng)綜合比較，磷脂、EPA、DHA 和酸價的最優(yōu)預(yù)測模型的最佳處理方式、主成分因子數(shù)及光譜范圍如表7所示。

表7 南極磷蝦油磷脂、EPA、DHA 和酸價指標最優(yōu)近紅外預(yù)測模型參數(shù)Table 7 Parameters of optimal NIR prediction model for phospholipid, EPA, DHA and acid value in Antarctic krill oil

磷脂、DHA 和EPA 酸價最佳處理方式略有不同，分別為：FD、FD、SD+N；酸價經(jīng)處理后，RCV 雖得到改善，但RMSECV 和RMSEP 顯著增加，故采用不經(jīng)處理的模型參數(shù)。由于蝦青素近紅外預(yù)測模型效果不好，因此未列在表中。

2.4 最優(yōu)近紅外預(yù)測模型指標評價

本文采用偏最小二乘法建立并處理了南極磷蝦油中磷脂、EPA、DHA 和酸價的近紅外光譜預(yù)測模型，確定了最優(yōu)的模型參數(shù)，通過交互驗證和外部驗證，四種組分的RC、REV 和RCV 三類相關(guān)系數(shù)，除酸價的RCV 略低為0.917 外，其余均在0.95 以上，并且RMSECV 和RMSEP 值也均較小，并且較為接近，均證明預(yù)測模型的準確度和穩(wěn)定性較好。

除上述指標外，另一個衡量預(yù)測模型準確度的重要指標是RPD，當其大于2.5 時，方可表明模型具有較好的預(yù)測準確度。如表8 中所示，磷脂、EPA、DHA 和酸價四種指標的RPDEV 和RPDCV 基本滿足這一指標要求，僅有酸價的RPDCV 為2.365，略小于2.5，這可能是由于建模樣品數(shù)量仍然偏少，RESECV 偏大導(dǎo)致，可通過后續(xù)的樣品量增加來進行改善。

表8 南極磷蝦油磷脂、EPA、DHA 和酸價最優(yōu)近紅外預(yù)測模型指標描述Table 8 Indicators description of optimal NIR prediction model for phospholipid, EPA, DHA and acid value in Antarctic krill oil

3 結(jié)論

本研究為南極磷蝦油品質(zhì)關(guān)鍵指標磷脂、DHA、EPA、酸價的含量近紅外模型的構(gòu)建以及快速檢測提供了理論上的依據(jù)和數(shù)據(jù)上的支持，充分驗證了近紅外快速檢測方法在磷蝦油品質(zhì)指標檢測中應(yīng)用的可行性。為進一步提升模型的精確度，可通過擴大對主要磷蝦油生產(chǎn)廠家的代表性樣品數(shù)量與樣品指標范圍，構(gòu)建更精準成分預(yù)測模型。此外，除本文中涉及到的5 種指標之外，近紅外檢測方法可能還適用于脂肪酸組成和過氧化值等指標的檢測[28-29]。

南極磷蝦油產(chǎn)品質(zhì)量檢測包含9 項以上主要指標，采用傳統(tǒng)化學檢測方法不但需要氣相、液相等大型儀器設(shè)備的投入，還需要配備檢測人員并且消耗大量的檢測試劑。按照常規(guī)檢測機構(gòu)對全部指標檢測的收費標準，每個樣品檢測至少需要收費千元以上。與傳統(tǒng)檢測方法相比，近紅外快速檢測方法無需配備專業(yè)的人員，不需消耗試劑，僅需通過簡單處理即可完成對南極磷蝦油中的主要指標的檢測分析，可極大的提高檢測效率，降低檢測成本，隨著近年來便攜式近紅外設(shè)備的不斷發(fā)展[30]，在磷蝦油產(chǎn)品生產(chǎn)與流通環(huán)節(jié)其均可作為有效的檢測手段。進一步，通過對于檢測方法的持續(xù)優(yōu)化，有望實現(xiàn)磷蝦油加工過程中的在線品質(zhì)監(jiān)控，對于提高生產(chǎn)效率和提升磷蝦油產(chǎn)品品質(zhì)具有積極作用。