諸培佳 俞潔霏 鄔亦華 顧 曄 張江蓉

(1. 上海申德醫(yī)院內(nèi)科，上海 200336)(2. 上海國(guó)際醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌科，上海 200120)(3. 上海國(guó)際醫(yī)學(xué)中心內(nèi)科，上海 200120)(4. 上海市交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院老年科，上海 200092)

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性C57BL/6 J小鼠，10周齡，體質(zhì)量25～35 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：【SCXK(京)2016-0011】。按照海申德醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，倫理委員會(huì)審批號(hào)：【SCXK(滬)2017-0005】。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑：miR-208b antagomir腺病毒及空載腺病毒購(gòu)自上海漢恒生物公司；TTC和TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche；Power SYBR green PCR master mix、TaqMan Universal PCR Mix、TaqMan microRNA Assay均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Bcl-2及Bax單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz，β-actin單克隆抗體購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司；SDS-PAGE凝膠、電泳液等購(gòu)自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器：CM1520冷凍切片機(jī)購(gòu)自Leica；熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI；逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自Promega；液氮罐購(gòu)自四川樂山東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀/穩(wěn)壓電源購(gòu)自Bio-rad；離心機(jī)購(gòu)自Heraeus；紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀和超低溫冰箱購(gòu)自Thermo；成像系統(tǒng)購(gòu)自Pierce；小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自Harvard Apparatus。

1.2 方法

1.2.1心肌梗死小鼠模型制備：參考Li等[6]和史建偉[7]建立心肌梗死小鼠模型。小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，手術(shù)區(qū)域消毒，使用50 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg地西泮進(jìn)行腹腔注射麻醉，行氣管插管并連接呼吸機(jī)。麻醉后沿胸骨左側(cè)4～5肋間切皮，鈍性分離皮下組織與肌肉，打開胸腔，用胸骨撐開器固定肋骨，充分暴露心臟，分離心包膜，使用7/0滑線結(jié)扎左心耳下緣2～3 mm處的冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎處缺血區(qū)的左心室前壁逐漸變?yōu)榛野咨?，且體表心電圖顯示ST段抬高0.2 mV，說明心肌梗死小鼠造模成功。在成功構(gòu)建心肌梗死小鼠的心肌梗死周圍區(qū)域(心肌顏色灰白區(qū)周邊)選擇5點(diǎn)(0、3、6、9點(diǎn)及中央)，分別用微量注射器注射0.9%生理鹽水、腺病毒載體溶液及攜帶miR-208b腺病毒溶液各25 μL后，清除胸腔積血，閉合肋間傷口，逐層縫合胸壁，并抽取胸腔負(fù)壓，待小鼠自主呼吸恢復(fù)至正常，撤除呼吸機(jī)。整個(gè)手術(shù)過程嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，并將小鼠置于SPF環(huán)境下繁殖飼養(yǎng)(溫度25 ℃、相對(duì)濕度55%)1周。為防止術(shù)后感染，術(shù)后3 d內(nèi)所有小鼠均注射青霉素。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組：將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組(MI組)、空載體組(Ad組)、miR-208b antagomir組(實(shí)驗(yàn)組)。所有處理均同造模組，但是未進(jìn)行前降支結(jié)扎小鼠作為假手術(shù)組(Sham組)。其中MI組小鼠在MI模型構(gòu)建成功后于心肌梗死周圍區(qū)域注射等量的0.9%生理鹽水，Ad組小鼠于心肌梗死周圍區(qū)域注射等量的腺病毒載體溶液，實(shí)驗(yàn)組小鼠于心肌梗死周圍區(qū)域注射等量的攜帶miR-208b腺病毒溶液，病毒量為0.1 mL(4×107TU)。

1.2.3超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能：術(shù)后，精心飼養(yǎng)1周后各組隨機(jī)選取6只小鼠將其麻醉，采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、短軸縮短率(FS)等心功能指標(biāo)。

1.2.4qRT-PCR：qRT-PCR檢測(cè)心肌梗死小鼠心肌組織中miR-208b的表達(dá)。各組隨機(jī)選取6只小鼠，將小鼠心臟組織進(jìn)行胰蛋白酶消化，離心后提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用TaqMan探針和miR-208b特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)，62 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)源參照，用2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)。miR-208b引物序列，F(xiàn)：5′-TCCACACAGAGGGGACTCTT-3′，R：5′-TGAGCATGAAGGCATAGCAC-3′；U6引物序列，F(xiàn)：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′。

1.2.5TTC染色法：TTC染色法測(cè)定小鼠心肌梗死面積。手術(shù)后精心飼養(yǎng)1周后，各組隨機(jī)選取6只小鼠，處死取出心臟，用PBS溶液沖洗用紗布吸干心臟表面水分，置于-20 ℃冰箱中冷凍20 min后切片，進(jìn)行TTC染色，37 ℃避光孵育15 min， 5 min晃動(dòng)容器一次，染色后PBS溶液沖洗，拍照。圖中灰白色區(qū)域?yàn)樾募」Ｋ绤^(qū)，磚紅色為正常區(qū)域，用Image Pro Plus 6.0計(jì)算心肌梗死面積。心肌梗死%=100%×(梗死面積/心臟切面總面積)。

1.2.6熒光TUNEL法：熒光TUNEL法測(cè)定心肌梗死小鼠心肌梗死周圍區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡。各組隨機(jī)選取6只小鼠，將小鼠心梗周圍組織切片進(jìn)行石蠟包埋，按照TUNEL試劑盒操作步驟進(jìn)行脫蠟及水合，待細(xì)胞通透后加入TdT和dUTP，DAPI復(fù)染后加入抗熒光淬滅劑，封片。經(jīng)熒光染色后凋亡的細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色，正常細(xì)胞為藍(lán)色，每張切片尋找5個(gè)視野，記錄其平均值。凋亡率%=100%×凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))。

2017年1-12月神經(jīng)外科出院患者1258例,發(fā)生醫(yī)院感染59例,65例次,實(shí)際感染率4.69%,感染例次率5.17%。

1.2.7Western blot：Western blot檢測(cè)心肌梗死小鼠心臟組織中Bcl-2及Bax的蛋白表達(dá)。各組隨機(jī)選取6只小鼠，將小鼠心肌梗死周圍組織裂解后，提取總蛋白并測(cè)定濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后，封閉液溫室封閉1 h后加入一抗，4 ℃孵育過夜，TPBS漂洗后加入二抗，孵育1 h后漂洗，加入ECL發(fā)光試劑，曝光后拍照，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死小鼠心肌組織中miR-208b的表達(dá)

小鼠心肌梗死7 d后，與Sham組比較，MI組和Ad組小鼠心肌梗死周圍區(qū)域miR-208b的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，說明miR-208b在心肌組織中增加；實(shí)驗(yàn)組小鼠miR-208b的表達(dá)顯著較MI組下調(diào)(P<0.05)，說明攜帶miR-208b antagomir的腺病毒已成功轉(zhuǎn)染至心肌梗死小鼠的心肌組織(圖1)。

圖1 心肌梗死小鼠心肌組織中miR-208b的表達(dá)注：與Sham組比較，*P<0.05;與MI組比較，#P<0.05Fig.1 Expression of miR-208b in myocardial tissue of mice with myocardial infarction Note：Compared with the sham group, *P<0.05;Compared with the MI group, #P<0.05

2.2 miR-208b干預(yù)對(duì)心肌梗死小鼠心肌梗死面積的影響

各組小鼠心肌梗死7 d后，MI組、Ad組和實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌梗死面積分別為(51.890±5.903)%、(50.224±5.626)%、(29.808±6.544)%，實(shí)驗(yàn)組心肌梗死面積明顯小于MI組、Ad組(P<0.05)，說明心肌梗死小鼠miR-208b的表達(dá)明顯上調(diào)，miR-208b干預(yù)可減輕心肌梗死的影響(圖2)。

2.3 miR-208b干預(yù)對(duì)心肌梗死小鼠心功能的影響

與Sham組比較，MI組、Ad組及實(shí)驗(yàn)組小鼠LVEDd與LVESD水平明顯升高，LVEF和FS%顯著降低(P<0.05)；與MI組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠LVEDd與LVESD水平明顯降低，LVEF和FS%顯著升高(P<0.05)，MI組和Ad組小鼠LVEDd與LVESD水平和LVEF和FS%比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.4 miR-208b干預(yù)對(duì)心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

Sham組、MI組、Ad組和實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌細(xì)胞的凋亡率分別為(8.688±0.892)%、(45.099±5.355)%、(44.820±5.407)%和(37.178±2.842)%。MI組、Ad組和實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞的凋亡率明顯高于Sham組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌細(xì)胞的凋亡率明顯小于MI組(P<0.05)，MI組和Ad組小鼠心肌細(xì)胞的凋亡率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上說明心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞的凋亡明顯上升，miR-208b干預(yù)可抑制心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞的凋亡(圖3)。

圖3 心肌梗死小鼠心肌梗死周圍區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡注：與Sham組比較，*P<0.05;與MI組比較,#P<0.05Fig.3 Apoptosis of myocardial cells around myocardial infarction in mice with myocardial infarction Note：Compared with the sham group, *P<0.05; Compared with the MI group, #P<0.05

2.5 miR-208b干預(yù)對(duì)心肌梗死小鼠心肌組織Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4組小鼠心臟組織中Bcl-2及Bax的表達(dá)差異顯著(P<0.05)，MI組和Ad組心肌梗死小鼠心臟組織中Bcl-2的表達(dá)明顯較Sham組下調(diào)(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2的表達(dá)明顯較MI組及Ad組上調(diào)(P<0.05)；MI組和Ad組心肌梗死小鼠心臟組織中Bax的表達(dá)明顯較Sham組上調(diào)，實(shí)驗(yàn)組Bax的表達(dá)明顯較MI組及Ad組下調(diào)(P<0.05)；MI組及Ad組小鼠Bcl-2和Bax的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。說明心肌梗死小鼠Bcl-2明顯下調(diào)，Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，由此可知miR-208b干預(yù)能明顯上調(diào)心肌梗死小鼠心臟Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)(圖4)。

圖4 miR-208b干預(yù)對(duì)心肌梗死小鼠心肌組織Bcl-2和Bax表達(dá)的影響注：與Sham組比較，*P<0.05;與MI組比較,#P<0.05Fig.4 Effect of miR-208b intervention on the expression of Bcl-2 and Bax in myocardial tissue of mice with myocardial infarction Note：Compared with the sham group, *P<0.05; Compared with the MI group, #P<0.05

3 討論

心肌細(xì)胞是不可再生的，局部心肌細(xì)胞會(huì)因心肌梗死后而受到損傷并凋亡，喪失其原有的功能，進(jìn)而引起心室重構(gòu)，梗死部位膠原及纖維增生形成瘢痕組織，降低心肌的收縮性，出現(xiàn)心臟失代償性擴(kuò)大，心功能減弱，進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[8]。隨著近年來基因治療的崛起，眾多相關(guān)研究表明miRNA能改善心肌梗死后大鼠的心功能[9-10]。

microRNA(miRNA)是內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3′ UTR特異性結(jié)合而抑制靶基因mRNA表達(dá)或使其降解，從而調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖與凋亡[11-12]。劉鵬飛等[13]使用攜帶miRNA-486的腺病毒轉(zhuǎn)染心肌梗死后大鼠的心肌梗死區(qū)，發(fā)現(xiàn)可降低心肌梗死面積，改善大鼠心功能。miRNA-208b屬于miRNA-208家族，由Myh7基因編碼，在心肌及骨骼肌組織中特異性表達(dá)，與心臟發(fā)育及心肌損傷等生理及病理相關(guān)。李建民等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者miR-208b水平明顯升高，其早期診斷效能優(yōu)于心肌肌鈣蛋白(cTn Ⅰ)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)，通過檢測(cè)miR-208b水平可有助于AMI的早期診斷及治療[14]。另有研究表明，miR-208b在組織損傷時(shí)可快速釋放入血，并在心肌組織中特異性高表達(dá)；急性心肌梗死時(shí)，miR-208b表達(dá)升高，可作為AMI診斷和預(yù)后的敏感生物標(biāo)志物[15-16]。Alavi-Moghaddam 等[4]研究顯示，AMI組miR-208b的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組；且miR-208b表達(dá)升高與AMI患者的長(zhǎng)期生存期降低有關(guān)。但是，目前miR-208b對(duì)心肌梗死后心肌凋亡的相關(guān)研究較少，所以本研究使用攜帶miR-208b的腺病毒轉(zhuǎn)染心肌梗死小鼠，研究其通過調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡對(duì)心臟的保護(hù)作用。

本研究中使用結(jié)扎前降支的方法，重現(xiàn)AMI的發(fā)病過程。在構(gòu)建AMI模型的過程中發(fā)現(xiàn)5只小鼠死亡，小鼠心肌梗死模型構(gòu)建的成功率為72.22%，又選取同一批次10只小鼠進(jìn)行AMI模型構(gòu)建并成功后，使用腺病毒轉(zhuǎn)染心肌梗死小鼠。7 d后發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，MI組及Ad組小鼠心肌梗死周圍區(qū)域miR-208b的表達(dá)顯著下調(diào)，實(shí)驗(yàn)組小鼠miR-208b的表達(dá)顯著較MI組上調(diào)，說明miR-208b在心肌梗死小鼠中表達(dá)下調(diào)，且腺病毒已成功轉(zhuǎn)染心肌梗死小鼠并在其心肌組織中表達(dá)。本研究結(jié)果還顯示，實(shí)驗(yàn)組心肌梗死面積明顯小于MI組；MI組、Ad組、實(shí)驗(yàn)組小鼠LDH和CK水平明顯大于Sham組，實(shí)驗(yàn)組小鼠LDH和CK水平明顯小于MI組。以上結(jié)果提示，miR-208b干預(yù)可明顯減少心肌梗死面積，改善心功能。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的程序性死亡，心肌梗死后機(jī)體為了保持細(xì)胞所處環(huán)境的穩(wěn)定，局部心肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)凋亡，引起心室重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌細(xì)胞的凋亡率明顯小于MI組；實(shí)驗(yàn)組Bcl-2的表達(dá)明顯較MI組上調(diào)，Bax的表達(dá)明顯較MI組下調(diào)。提示miR-208b可能是通過調(diào)控Bcl-2及Bax的表達(dá)影響心肌細(xì)胞的凋亡，延緩心室重構(gòu)，進(jìn)而改善心肌梗死小鼠的心功能，實(shí)現(xiàn)其心肌保護(hù)作用。

因此，AMI小鼠心肌梗死周邊區(qū)域miR-208b的表達(dá)明顯升高，通過干預(yù)AMI小鼠心肌miR-208b的表達(dá)可明顯改善其心功能，可能與其減弱心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。