嚴(yán)偉明 葉 倩 龍 盤 陳小紅 陳艷津王雨彤 危冬昱 張作明 陳梅珠 陳 濤

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院 福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院 廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院，福州 350025)(2.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天臨床醫(yī)學(xué)中心，西安 710032)(3.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，成都 610083)

大鼠眼球石蠟組織切片被廣泛應(yīng)用于眼科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中[1-2]。然而，由于眼球結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，各部分組織密度相差較大，按常規(guī)方法制作眼球石蠟組織切片，易出現(xiàn)眼球結(jié)構(gòu)變形、紊亂、視網(wǎng)膜脫離等不理想效果[3-4]。探索一種制作大鼠全眼球石蠟組織切片的改進(jìn)方法對(duì)眼科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究具有一定的意義。本研究結(jié)合前期相關(guān)文獻(xiàn)研究方法，對(duì)大鼠全眼球石蠟組織切片制作方法進(jìn)行新的探索，以期尋求一種較為簡(jiǎn)單、方便、有效的方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可 證號(hào)：SCXK(陜)2019-001)，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，倫理審查編號(hào)：P20190715-3。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與器材

戊巴比妥鈉溶液(1%體積質(zhì)量比，上海行知化工廠，批號(hào)#921019)；速眠新(吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司，批號(hào)#(2004)005013)；A固定液：4%多聚甲醛(上海遠(yuǎn)慕試劑公司，批號(hào)#YM-MY803J)；B固定液：10%中性福爾馬林(浙江同和生物公司，批號(hào)#20170017)；C固定液(混合固定液)：冰醋酸(天津富宇試劑，批號(hào)#200-580-7)、甲醛(廣東西隴科學(xué)公司，批號(hào)#1804242)、生理鹽水、75%乙醇(合肥辰宇化工有限責(zé)任公司，批號(hào)#67-17-5)，按1∶2∶7∶10比例配制。

組織包埋機(jī)(常州市雅博電子設(shè)備有限公司，型號(hào)#YABO400)；自動(dòng)脫水機(jī)(常州市雅博電子設(shè)備有限公司，型號(hào)#YABO600)；旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(上海賽默飛世爾儀器有限公司，型號(hào)#Finesse 325)；自動(dòng)恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)(西安瑞豐儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)# GTK-2002)。

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物分組：取上述18只SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，即A固定液組、B固定液組和C固定液組，每組6只。

1.3.2眼球固定：用戊巴比妥鈉溶液腹腔注射過(guò)量劑量麻醉處死各組大鼠后，立即取其左、右眼球(取眼球時(shí)盡量保留較長(zhǎng)的視神經(jīng)以便后期進(jìn)行組織切片時(shí)定位經(jīng)視神經(jīng)的切片)，處理眼球周圍多余組織后，將眼球分別固定于3種相應(yīng)固定液中；固定2 h后，在各組大鼠左眼中央角膜處用1 mL注射器扎一小孔，右眼用銳利刀片沿瞳孔-視神經(jīng)軸方向在眼球顳側(cè)鞏膜剖一小開(kāi)口(長(zhǎng)約0.5 cm，不需全部切開(kāi)側(cè)面)，之后再將左、右眼球放回各自固定液中繼續(xù)固定24 h。

1.3.3組織脫水、透明、浸蠟：將固定24 h后的各組大鼠眼球置于自動(dòng)脫水機(jī)中，經(jīng)以下步驟處理：(1)梯度脫水：70%乙醇(3 h)-85%乙醇(1 h)-95%乙醇(1 h×3)-100%乙醇(1 h×3)；(2)透明：二甲苯(15 min × 2)；(3)浸蠟：石蠟(56～58 ℃，2 h×2)。

1.3.4蠟塊包埋與切片制作：在組織包埋機(jī)上，按瞳孔-視神經(jīng)軸方向，橫向固定眼球進(jìn)行包埋，待凝聚成蠟塊后，在旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)上，每個(gè)眼球沿瞳孔-視神經(jīng)軸取經(jīng)視神經(jīng)連續(xù)3張切片，厚度為4 μm，攤片、撈片后，在烤片機(jī)上70 ℃烤片20 min。

1.3.5蘇木精-伊紅(HE)染色：各切片按以下流程操作：(1)脫蠟至水：二甲苯(10 min × 3)-100%乙醇(1 min)-95%乙醇(1 min)-80%乙醇(1 min)-自來(lái)水(5 min)；(2)HE染色：蘇木精液(5 min)-自來(lái)水(1 min)-0.5%鹽酸乙醇液(5 s)1% 氨水 (10 s)-自來(lái)水(5 min)-伊紅(2 min)-自來(lái)水(1 min)-95%乙醇(1 min×2)-100%乙醇(1 min)-100%乙醇(2 min)-二甲苯 (2 min × 2)；(3)中性樹(shù)脂封片。

1.3.6觀察：在光學(xué)顯微鏡下對(duì)眼球石蠟組織切片效果進(jìn)行觀察并拍照。重點(diǎn)觀察整個(gè)眼球形狀與結(jié)構(gòu)、虹膜睫狀體結(jié)構(gòu)、晶狀體完整性、有無(wú)視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整性等。

2 結(jié)果

采用A固定液(4%多聚甲醛)和B固定液(10%中性福爾馬林)固定的眼球，經(jīng)過(guò)角膜扎孔(左眼)或者眼球鞏膜側(cè)壁剖開(kāi)(右眼)，整體眼球結(jié)構(gòu)都有較明顯的皺縮變形；晶狀體固定較差，結(jié)構(gòu)存留少(圖1A，B)；虹膜睫狀體略有皺縮(圖2A，B)；視網(wǎng)膜脫離，甚至發(fā)生視網(wǎng)膜斷裂，各細(xì)胞層細(xì)胞核連續(xù)性較差，甚至發(fā)生斷裂(圖3A，B)。相對(duì)于左眼，右眼眼球總體結(jié)構(gòu)保存較好(圖1-2-A，B)；存在一定程度視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，未見(jiàn)明顯視網(wǎng)膜劈裂(以B固定液，即10%中性福爾馬林效果較顯著)(圖2-2-B，C)。

圖1 各組大鼠全眼球石蠟組織切片蘇木精-伊紅染色-整體觀(×40)注：1：左眼；2：右眼；A、B、C：4%多聚甲醛固定液、10%中性福爾馬林固定液、混合固定液；黑色箭頭：視網(wǎng)膜脫離；標(biāo)尺：1 000 μmFig.1 Hematoxylin-eosin staining of whole eyeball paraffin-sections of all rat groups-the holistic view (×40)Note: 1: the left eye; 2: the right eye; A, B, C: the fixative of 4% paraformaldehyde, 10% neutral formalin, and a mixed fixative solution, respectively; Black arrowhead:the sign of retinal detachment; Scale bar: 1 000 μm

采用C固定液固定后的大鼠眼球，左眼(角膜扎孔)或右眼(眼球鞏膜側(cè)壁剖開(kāi))整體眼球結(jié)構(gòu)完整性較好，無(wú)明顯形態(tài)皺縮(圖1C)；虹膜睫狀體結(jié)構(gòu)舒展(圖2C)；視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整，視網(wǎng)膜神經(jīng)組織與色素上皮層連接緊密，未見(jiàn)明顯視網(wǎng)膜脫離發(fā)生，各細(xì)胞層細(xì)胞核連續(xù)性較好(圖3C)。相對(duì)于左眼(圖1-1-C)，右眼晶狀體固定效果較好，結(jié)構(gòu)較完整(圖1-2-C)。

3 討論

全眼球石蠟組織切片可對(duì)眼球組織形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行整體的觀察；進(jìn)一步采用全眼球石蠟組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，能方便清楚地得知某些分子或蛋白在整個(gè)眼內(nèi)組織的表達(dá)定位情況[5-6]。然而由于眼球結(jié)構(gòu)精密，由多個(gè)部分組成(眼球壁外、中、內(nèi)3層，包括眼內(nèi)容物如晶狀體、玻璃體等)，各部分結(jié)構(gòu)密度差異較大，若按常規(guī)方法進(jìn)行全眼球石蠟組織切片制作，難以得到較好的組織形態(tài)，容易出現(xiàn)眼球皺縮、眼內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜斷裂等[7]。不少研究對(duì)此技術(shù)進(jìn)行探索和改進(jìn)，包括改進(jìn)固定液，改變固定時(shí)間、脫水時(shí)間，更換質(zhì)量較好的石蠟以及對(duì)眼球進(jìn)行適當(dāng)解剖處理等[8-10]。其中，有研究改進(jìn)了眼球固定液，采用冰醋酸、甲醛、生理鹽水、75%乙醇，按比例1∶2∶7∶10配制，固定小鼠眼球，所制作出的小鼠眼球石蠟組織切片效果較好[11]。然而，該研究未報(bào)道此固定液對(duì)于大鼠眼球組織的固定效果。

大鼠眼球較小鼠眼球體積大，內(nèi)容物間距更大，組織密度變化更明顯。制作大鼠全眼球石蠟組織切片，一般都需提前對(duì)大鼠眼球進(jìn)行適當(dāng)解剖處理再進(jìn)行固定，如在眼球鞏膜兩側(cè)開(kāi)窗，去除晶狀體(由于晶狀體密度較高，不容易固定及切片)，或者去除角膜等[4]。經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠眼球未經(jīng)適當(dāng)解剖處理，采用上述固定液直接進(jìn)行固定也難取得較好切片效果(可能原因?yàn)楣潭ㄒ狠^難完全滲透眼球內(nèi)部組織)。綜合上述多種方法，本研究采用在眼球固定2 h后直接在角膜中央扎孔或沿瞳孔-視神經(jīng)軸方向從眼球顳側(cè)鞏膜剖一小開(kāi)口再固定24 h，以探討切片制作效果。在固定2 h后，眼球結(jié)構(gòu)有一定硬度；此時(shí)再進(jìn)行眼球解剖處理，可防止解剖操作造成眼球結(jié)構(gòu)變形。本研究采取的剖開(kāi)眼球鞏膜側(cè)壁或角膜扎孔的目的同其他眼球解剖方法一致，即加強(qiáng)固定液浸潤(rùn)眼內(nèi)組織，且利于后期石蠟的浸潤(rùn)。在本研究中，通過(guò)左眼、右眼對(duì)比，可以看到即使在使用混合固定液組，左眼(即在角膜中央扎孔的方法)，比其他固定液組的眼內(nèi)結(jié)構(gòu)完整；這在一定程度體現(xiàn)了混合固定液可較充分滲透組織取得固定效果的優(yōu)點(diǎn)。具體原理在于混合固定液中的甲醛有固定組織蛋白的作用；冰醋酸對(duì)組織具有膨脹作用，且可加強(qiáng)固定液對(duì)組織浸透；乙醇可使組織收縮，在一定程度對(duì)抗冰醋酸的膨脹作用。這些液體成分的共同作用可使眼球組織得到較充分的固定，同時(shí)不會(huì)發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)變形。然而，這種眼部解剖方法配合使用混合固定液，仍存在一定的組織固定欠充分情況。本研究中，右眼眼球是在眼球鞏膜側(cè)壁剖開(kāi)約0.5 cm的窗口，這相對(duì)于角膜中央針扎孔的方法更有利于固定液直接進(jìn)入眼內(nèi)組織，取得更徹底固定的效果。在本研究中，混合固定液組中右眼眼球晶狀體的組織成分明顯較左眼完整，而在其他兩組的右眼其眼內(nèi)結(jié)構(gòu)也明顯較左眼的完整，以此說(shuō)明了這種眼球鞏膜側(cè)壁剖切的解剖方法可取得相對(duì)較好的組織固定結(jié)果。

此外，在眼球組織脫水過(guò)程中本研究將透明劑二甲苯的時(shí)間設(shè)為15 min×2，是為了防止由于二甲苯浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致眼球組織變硬變脆，影響后期眼球石蠟組織切片效果。其他研究中也對(duì)透明劑二甲苯使用時(shí)長(zhǎng)采用相類似的改進(jìn)方法[4]。

本研究結(jié)果表明，制作大鼠全眼球石蠟組織切片采用混合固定液，固定眼球2 h后，行眼球鞏膜側(cè)壁縱剖，繼續(xù)固定24 h后，進(jìn)行脫水(包括二甲苯透明15 min × 2)、包埋、切片等后續(xù)處理，所制作出的大鼠全眼球石蠟組織切片HE染色較清楚，眼球結(jié)構(gòu)較完整，無(wú)明顯變形，晶狀體結(jié)構(gòu)固定效果較好，虹膜睫狀體結(jié)構(gòu)舒展，無(wú)明顯視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜細(xì)胞核層連續(xù)性較好。該方法解剖操作較簡(jiǎn)便、快捷，可在一定范圍內(nèi)推廣進(jìn)行大鼠全眼球石蠟組織切片制作。