潘美伯 王 玢 王 慧 劉才艷 任敏潔 董銀鳳

(南京中醫(yī)藥大學護理學院，南京 210023)

腦卒中(stroke)是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一。近年來，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)不斷升高，是我國居民的第三位死亡原因[1]。其中，缺血性腦卒中(ischemic stroke)占三級醫(yī)院卒中住院患者的81.9%[2]，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率及并發(fā)癥多等特點。卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后最常見的并發(fā)癥，約1/3的腦卒中患者合并PSD，并明顯增加腦卒中的病死率及疾病負擔[3]。目前，PSD的病理生理學機制復雜不清，針對PSD的防治尚缺乏明確有效的個體化干預策略。

為了深入研究闡明PSD的病理機制以及干預效果，目前動物實驗研究中應(yīng)用最廣泛的大鼠PSD模型主要包括缺血性卒中后進行孤養(yǎng)并給予慢性溫和不可預知性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)及缺血性卒中后孤養(yǎng)聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress，CRS)兩種[4]。各種模型制備方式各有特點，干預時間長短不一，形成抑郁樣癥狀的嚴重程度不盡相同。選擇與PSD的臨床病理變化相似、穩(wěn)定性好、便于操作的大鼠PSD模型對揭示其病理機制及藥物評價研究至關(guān)重要。網(wǎng) 狀Meta分析可通過綜合分析比較不同干預措施并對其進行量化統(tǒng)計分析，并根據(jù)結(jié)局指標的效果進行排序選出最優(yōu)方案。本研究采用網(wǎng)狀Meta分析比較各種PSD模型制備方法的有效性差異，以期為大鼠PSD模型的選擇與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 檢索策略

計算機檢索維普、萬方、知網(wǎng)、Sinomed、Pubmed、WOS、Embase數(shù)據(jù)庫，采用自由詞與主題詞相結(jié)合的方式，檢索時限為各數(shù)據(jù)庫建立到2020年8月22日。中文檢索關(guān)鍵詞為：腦卒中、腦缺血、缺血性腦卒中、大鼠、抑郁、卒中后抑郁、造模方法。英文檢索關(guān)鍵詞為：stroke，strokes，rat，rats，depress*，animal model。以Pubmed為例，詳細檢索式見圖1。

圖1 Pubmed數(shù)據(jù)庫檢索策略Fig.1 Retrieval strategy of Pubmed databases

1.1.1納入標準：①文獻研究類型：隨機對照試驗，不限制盲法的中英文文獻；②研究對象：SD大鼠或Winster大鼠；③干預措施：實驗組建立卒中后抑郁模型，對照組為缺血性腦卒中組，不限制造模持續(xù)時間；④結(jié)局指標：體重(body weight，BW)、糖水偏好實驗(sucrose preference test，SPT)、曠場實驗(open field test，OFT)水平運動評分和曠場實驗垂直運動評分，納入文獻的結(jié)局指標均可提取。

1.1.2排除標準： ①實驗動物不符；②模型制備方法不詳；③對照組為非缺血性腦卒中組；④不包含結(jié)局指標或結(jié)局指標數(shù)據(jù)不完整；⑤實驗設(shè)計未采用隨機對照試驗；⑥重復發(fā)表的中英文文獻。

1.2 文獻篩選及數(shù)據(jù)提取

文獻篩選及數(shù)據(jù)提取由雙人完成：①通過閱讀文獻標題和摘要排除明顯與該文研究不符的文獻，剩余文獻通過全文閱讀根據(jù)納入或排除標準排除文獻；②數(shù)據(jù)提?。合扔梢幻芯空邔?shù)據(jù)提取并且錄入表格中，再由另一名研究者對提取數(shù)據(jù)核對以確保準確性；③文獻篩選和數(shù)據(jù)提取階段若有分歧或存在爭議交由通訊作者裁決。納入文獻一般資料，包括標題、第一作者、年份、大鼠種屬、體重、數(shù)量、性別、造模方式、觀察結(jié)局指標、評價的時間、文獻質(zhì)量等。

1.3 文獻質(zhì)量評價

根據(jù)動物實驗系統(tǒng)評價研究中心(the Systematic Review Centre for Laboratory Animal Experimentation，SYRCLE)動物實驗偏倚風險評估工具(SYRCLE’s risk of bias tool for animal studies)[5]，針對所有納入文獻進行質(zhì)量評價。SYRCLE工具共包括10個條目，22個亞條目，涉及的偏倚類型包括選擇性偏倚、實施偏倚、測量偏倚、失訪偏倚、報告偏倚和其他偏倚，適用于動物實驗偏倚風險的評估。該評估工具中10個條目的評估結(jié)果最終以“Low” “High” 和“Unclear”表示，其中“Low”代表低風險偏倚，“High”代表高風險偏倚，“Unclear”代表不確定風險偏倚。若6項風險偏倚均為低偏倚風險，則文獻質(zhì)量A級；若有一項或以上為中偏倚風險，則記為B級；只要有一項或以上為高偏倚風險，則記為C級[6]。

1.4 統(tǒng)計分析

運用Stata 10.0軟件對納入文獻進行網(wǎng)狀Meta分析。此次研究結(jié)局指標均為計量資料，采用標準化均數(shù)差(mean difference，MD)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，并使用等級概率圖來表示不同模型的排序。對納入文獻的發(fā)表偏倚檢驗，采用Stata 10.0軟件繪制漏斗圖。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索及篩選結(jié)果

初步檢索共2 963篇文獻，排除重復文獻1 443篇，通過閱讀標題和摘要排除文獻1 157篇，通過閱讀全文排除文獻312篇，最終納入文獻51篇，其中英文9篇，中文42篇。篩選流程圖見圖2，納入研究的基本資料見表1。

圖2 文獻篩選流程Fig.2 Flow diagram of literature selection

表1 納入研究的基本特征Table 1 Basic Characteristics of Included Studies

2.2 納入文獻的基本特征

納入51項研究皆為隨機對照試驗(表1)，共998只大鼠。其中，47.06%的研究干預周期為21 d(n=24)，采用CUMS造模的研究42項，共809只大鼠；采用CRS造模的研究共9項，共199只大鼠。在51項卒中后抑郁模型研究的網(wǎng)狀關(guān)系(圖3)中，點與點間連線說明CUMS組與卒中組之間、CRS組與卒中組之間有直接比較關(guān)系；CUMS組與CRS組間尚無直接比較的研究，可采用間接比較進行網(wǎng)狀關(guān)聯(lián)分析比較，線條越寬表示兩個干預措施對比研究頻次越多。其他造模方式未提取到數(shù)據(jù)，因此未納入本研究。

圖3 納入文獻之間網(wǎng)狀關(guān)系Fig.3 Mesh relationship of included studies

2.3 文獻質(zhì)量評價及偏倚風險評價

納入51項研究均為隨機對照試驗，文獻的基本特征見表2，其中96.08%的文獻評價為B級(n=49)，3.92%文獻評價為A級(n=2)；4個及以上條目評價為“低風險”的文獻數(shù)量大于70%(n=37)，且均不存在選擇性結(jié)果報告或其他偏倚。76.47%的研究報道了基線均衡(n=39)，62.75%的研究對結(jié)果的完整性有所說明(n=32)，報道隨機安置的研究為54.9%(n=28)。僅有7.84%的研究描述具體的隨機方法(n=4)，所有研究均未報道是否分配隱藏、動物飼養(yǎng)者的盲法是否被打破及評估時是否隨機抓取動物，僅有25.49%的研究報道了結(jié)果測評者的盲法(n=13)。由于動物實驗與人體實驗的方法學差異，基線均衡時未進行分配隱藏不會產(chǎn)生嚴重的選擇性偏倚，對飼養(yǎng)者未采用盲法、結(jié)果測評時是否隨機抓取不影響其客觀結(jié)局指標的測定，產(chǎn)生高風險測量偏倚的可能性較小。漏斗圖顯示大部分文獻聚攏在漏斗底部(圖4)，左右分布基本對稱，說明納入文獻偏倚較小。

表2 文獻質(zhì)量評價結(jié)果Table 2 Quality evaluation results of studies

圖4 納入文獻之間偏倚的漏斗圖Fig.4 Funnel plot of bias for included studies

2.4 結(jié)局指標的網(wǎng)狀Meta分析結(jié)果

2.4.1體重：納入的研究中有26項研究報告了體重，以MD為效應(yīng)量，95% CI作分析統(tǒng)計，兩種造模方式分別與卒中組作比較，CUMS組14 d【MD=-1.20(-1.69,-0.70)，P<0.05】、21 d【MD=-1.82(-2.29,-1.34)，P<0.05】、28 d【MD=-2.12(-3.49,-0.75)，P<0.05】, 束縛組14 d【MD=-2.96(-4.98,-0.94)，P<0.05】、21 d【MD=-3.11(-4.59,-1.64)，P<0.05】、28 d【MD=-3.29(-5.97,-0.61)，P<0.05】。與缺血性腦卒中組相比，CUMS組和CRS組均自干預后14 d開始至干預后21 d和28 d出現(xiàn)體重的顯著降低，且CRS組大鼠體重降低較CUMS組更加明顯，但兩組間比較差異不顯著(表3)。

2.4.2糖水偏好：納入的研究中共有47項研究報告了糖水偏好數(shù)據(jù)，兩種造模方式分別與卒中組作比較，CUMS組7 d【MD=-1.62(-2.39,-0.85)，P<0.05】、14 d【MD=-2.27(-2.78,-1.76)，P<0.05】、21 d【MD=-18.76(-23.63,-13.88)，P<0.05】、28 d【MD=-3.78(-5.68,-1.88)，P<0.05】, 束縛組14 d【MD=-2.96(-4.98,-0.94)，P<0.05】。與缺血性腦卒中組相比較，CUMS組分別在干預后7、14、21、28 d 出現(xiàn)糖水偏好率的顯著降低，而CRS組僅在干預后14 d的糖水偏好率顯著低于缺血性腦卒中組；CUMS組和CRS組相比較，其糖水偏好率在各時間點的變化差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

2.4.3曠場實驗水平運動評分：納入的研究中共有47項研究報告了曠場實驗水平運動數(shù)據(jù)，CUMS組7 d【MD=-1.62(-2.58,-0.66)，P<0.05】、14 d【MD=-2.64(-3.79,-1.48)，P<0.05】、21 d【MD=-3.66(-4.46,-2.86)，P<0.05】、28 d【MD=-2.11(-2.87,-1.34)，P<0.05】，束縛組28 d【MD=-2.24(-3.54,-0.95)，P<0.05】。與缺血性腦卒中組相比較，CUMS組分別在干預后7、14、21、28 d 出現(xiàn)曠場實驗水平運動評分的顯著降低，而CRS組僅在干預后21、28 d的曠場實驗水平運動評分顯著低于缺血性腦卒中組；CUMS組和CRS組相比較，其曠場實驗水平運動評分在各時間點的變化差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

表3 網(wǎng)狀Meta分析結(jié)果Table 3 Results of network Meta-analysis

2.4.4曠場實驗垂直運動評分：納入的研究中共有47項研究報告了曠場試驗垂直運動數(shù)據(jù)，CUMS組7 d【MD=-0.77(-1.23,-0.33)，P<0.05】、14 d【MD=-2.07(-2.81,-1.34)，P<0.05】、21 d【MD=-3.15(-4.15,-2.15)，P<0.05】、28 d【MD=-1.96(-2.65,-1.26)，P<0.05】，束縛組14 d【MD=-1.72(-2.92,-0.52)，P<0.05】、21 d【MD=-3.65(-5.80,-1.51)，P<0.05】、28 d【MD=-1.63(-2.68,-0.58)，P<0.05】。與缺血性腦卒中組相比較，CUMS組分別在干預后7、14、21、28 d 出現(xiàn)曠場實驗垂直運動評分的顯著降低，而CRS組僅在干預后14、21、28 d的曠場實驗垂直運動評分顯著低于缺血性腦卒中組；CUMS組和CRS組相比較，其曠場實驗垂直運動評分在各時間點的變化差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

2.4.5結(jié)局指標的概率排序：為了比較兩種造模方式的可靠性，對不同干預方式的結(jié)局指標進行概率排序。其中體重、糖水偏好、曠場實驗水平運動評分、曠場實驗垂直運動評分均以Rank 100%為概率排序最佳，數(shù)值越大說明此種造模方式在該指標上越可靠(表4)。如以體重第7天測量為例，CRS組排名第1的概率為94.5%。由表4可知，體重指標上有效性的排序為：CRS型>CUMS型；在糖水偏好指標上從高到低的排序為：CUMS型>CRS型；在曠場實驗水平及垂直評分中兩種造模方式有效性在不同時間各有不同。

表4 各造模方式概率排序Table 4 Ranking list of different treatment

3 討論

卒中后抑郁影響腦卒中的預后及生存質(zhì)量，其病因和病理生理機制改變尚未完全明確[57]，當前臨床治療中存在藥物起效慢、治療周期長、副作用大等問題[58]。選用較為理想的卒中后抑郁的動物模型，不僅有利于闡明卒中后抑郁的病理生理機制及評價藥物治療效果，而且有利于提高實驗的可重復性及向臨床的有效轉(zhuǎn)化。當前關(guān)于卒中后抑郁的相關(guān)基礎(chǔ)研究中，采用的動物模型均為卒中聯(lián)合孤養(yǎng)后復合抑郁造模，如CUMS型、CRS型、懸尾聯(lián)合強迫游泳型、利血平或內(nèi)皮素藥物注射型、中醫(yī)郁癥模型等，其中以CUMS型和CRS型應(yīng)用最廣泛[59-60]。由于基于不同理論依據(jù)的兩種造模方式各有優(yōu)劣，未形成統(tǒng)一標準。

CUMS是指長時間隨機對實驗動物使用包括但不限于禁食和禁水、晝夜顛倒、濕墊層、籠傾斜、壓力、強迫游泳和束縛等一系列應(yīng)激操作[61]。CUMS模型的理論依據(jù)是臨床患者遭遇卒中后經(jīng)歷大量不可預知的負性生活事件，其所致的疾病發(fā)生和表現(xiàn)形式更能模擬人類的抑郁癥狀及由此引起的生化改變。該模型動物的情緒表現(xiàn)與人類相應(yīng)情緒表現(xiàn)相似；產(chǎn)生情緒障礙的生物學機制與人類相同；對于情緒障礙有效藥物有明顯的反應(yīng)性，即符合情緒障礙動物模型的評價標準，因此被廣泛使用在抑郁癥狀研究領(lǐng)域[62]。興趣缺失或快感缺乏是抑郁癥的核心癥狀，在動物實驗中，通常應(yīng)用糖水偏好實驗評價動物的快感缺乏[63]。此外，基于抑郁癥患者對社會的參與度下降，大量研究也證實抑郁模型大鼠表現(xiàn)為運動量減少及回避行為產(chǎn)生[12]。曠場實驗是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法[64]，常用運動評分來檢測其焦慮、抑郁程度。本研究發(fā)現(xiàn)，CUMS在任一檢測時間點使大鼠糖水偏好明顯減弱，曠場運動水平運動及垂直運動評分降低，這種變化趨勢產(chǎn)生相較于CRS更早。可能的原因包括：CUMS干擾晝夜節(jié)律從而引起大鼠抑郁相關(guān)激素分泌改變[65]，不舒適的籠具環(huán)境刺激導致其產(chǎn)生回避型為等。也有研究認為，CUMS造模7-14 d內(nèi)大鼠糖水偏好及曠場運動評分降低更可能是焦慮樣行為的表現(xiàn)[66]。CUMS模型的不足之處在于適用動物品系有一定的局限性，對實驗設(shè)備的要求高，操作復雜，工作量較大，造模周期較長，造模過程中動物死亡率較高等問題。

CRS是指長時間以剝奪身體自由、束縛制動為應(yīng)激源的動物模型[67]，束縛期間禁食、禁水。該模型符合由急性轉(zhuǎn)入慢性的發(fā)展趨勢，利于動物整體評價。其理論依據(jù)是臨床卒中患者遭遇卒中后陷入社會隔離狀態(tài)[68]、腦區(qū)受損導致肢體活動障礙及一定程度的吞咽障礙[69]，進而導致日?；顒幽芰ο陆?，體重減輕，從而引起卒中后抑郁，可用于PSD相關(guān)研究。本研究結(jié)果顯示，干預14 d后兩組較卒中組均出現(xiàn)體重的顯著降低，以CRS組降低最明顯。CRS組每日進行束縛應(yīng)激時肢體活動受限，禁食水一定時間，束縛期間排泄于籠具內(nèi)，形成潮濕環(huán)境，產(chǎn)生刺激性氣味，與CUMS模型中多種刺激類型相同，且由于身體的束縛應(yīng)激，因此對大鼠體重影響更大[70]。臨床研究表明，腦卒中患者卒中后肌力下降、吞咽障礙、自理能力下降、生活質(zhì)量降低是卒中后抑郁形成的重要危險因素[71-72]。由此可見，在PSD模型體重降低的有效性上CRS模型優(yōu)于CUMS模型。CRS 的優(yōu)點是應(yīng)激類型更貼合臨床實際，應(yīng)激因子單一，制作方式較為簡單，工作量小，造模期間動物死亡率低；不足之處是由于對單一應(yīng)激動物容易產(chǎn)生適應(yīng)，抑郁癥狀可能出現(xiàn)較慢或自發(fā)改善。最新的研究提出了一種改進的CRS方式，用多次間斷束縛應(yīng)激代替單一長時間束縛應(yīng)激，在束縛總時長相同的情況下，間斷束縛更容易引起嚙齒動物抑郁樣表現(xiàn)，干預第5周時，間斷束縛組小鼠體重明顯低于持續(xù)束縛組[73]。

雖然本研究納入了足夠數(shù)量的文獻，但異質(zhì)性較大，結(jié)局指標偏多不便進行敏感性檢驗，可能存在一定的偏倚風險，下結(jié)論時需更加謹慎。所納入指標的測量單位不同，盡管用隨機效應(yīng)模型進行統(tǒng)計，但仍存在一定的局限性。此外，對于大鼠的性別、初始體重等對造模后的體重以及行為學影響較大的因素，由于部分文章未報道基線，不便進行差值計算后進行統(tǒng)計分析，削弱了本研究的嚴謹性。由于無法提取足夠的數(shù)據(jù)，其他卒中后抑郁造模方式也并未納入本文研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CUMS與CRS兩種方式均能形成PSD模型，模型效果的結(jié)局指標并無統(tǒng)計學差異，但CUMS模型大鼠在糖水偏好實驗和曠場實驗中抑郁樣行為表現(xiàn)出現(xiàn)時間更早、更穩(wěn)定，而CRS模型對大鼠的體重影響更明顯。盡管兩種模型的有效造模時長相近，但CRS在模擬臨床實際、造模成本大小、造模死亡率高低及工作量大小上可能較CUMS更具優(yōu)勢。由于此次研究納入的文獻量有一定的局限，證據(jù)力度仍有待加強。因此，今后仍需擴大樣本量，納入更多高質(zhì)量的相關(guān)研究，進一步對研究結(jié)論的可靠性予以證實。