孔靜祎 徐京平 劉瀾濤 王添樂 侯 寧 李振華 楊 曉 王 劍

(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所，北京 102206)

近年來，隨著我國社會經(jīng)濟發(fā)展，國民生活方式的變化，尤其是人口老齡化及城鎮(zhèn)化進程的加速，心血管病患病率和死亡率處于持續(xù)上升階段。目前，中國心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村為46.66%，城市為43.81%，心血管病給居民和社會帶來的經(jīng)濟負擔日漸加重。心臟重塑是多種心血管疾病(如高血壓、心肌缺血、心律失常等)的共同病理過程，隨著心臟重塑的進展，心力衰歇和心源性猝死發(fā)生率顯著提高。因此，闡明心臟重塑的發(fā)生機制，尋找調(diào)節(jié)心臟重塑發(fā)生的新型調(diào)控分子對于防治心力衰竭以及改進心臟疾病個性化治療策略具有重要和積極的意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的長鏈非編碼RNA分子[1]。近年來的研究表明LncRNA在心臟發(fā)育和病理重塑過程中發(fā)揮著非常重要的作用。如，小鼠心臟相關(guān)LncRNA AK143260(braveheart，Bvht)通過控制心臟細胞分化調(diào)節(jié)基因中胚層后螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(mesoderm posterior 1，MesP1)，Bvht通過激活參與心臟中胚層向各類心臟前體細胞轉(zhuǎn)化的基因網(wǎng)絡，來刺激干細胞分化為特定的心臟細胞[2-3]。肌球蛋白重鏈相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄本(myosin heavy chain associated RNA transcripts，Mhrt)在心臟組織中特異性表達，功能研究顯示其可以抑制病理性心肌肥厚的發(fā)生[4]。另一種在心臟組織中豐度較高的心肌肥厚相關(guān)表觀遺傳調(diào)節(jié)因子(cardiac-hypertrophy-associated epigenetic regulator，Chaer)，能通過與多梳蛋白抑制復合體2(polycomb repressor complex 2，PRC2)復合體內(nèi)的Zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)相互作用，在心肌肥厚的發(fā)生及相關(guān)基因表達調(diào)控的過程中發(fā)揮重要的功能[5]。此外，長鏈非編碼RNA H19能夠抑制心肌細胞的肥大生長，在心臟組織中過表達H19能夠緩解病理性心室重塑[6-7]。Snhg5(small nucleolar RNA host gene 5)，又稱U50HG, 是非蛋白編碼小核RNA (SnoRNA)宿主基因家族和5′-寡嘧啶家族基因的一個成員，近年來的研究顯示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的功能。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)Snhg5在發(fā)生病理性心臟重塑的小鼠模型心臟樣品中表達水平上調(diào)，提示其在心臟重塑發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要功能，但目前關(guān)于其在心臟組織的功能還未見報道。

為了研究Snhg5在心臟組織中發(fā)揮的功能，本研究建立了心肌細胞特異性Snhg5過表達轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠的成功建立將首次提供體內(nèi)的遺傳學證據(jù)揭示Snhg5在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮的功能，并也有可能為未來探索心臟重塑發(fā)生機制，及發(fā)展心臟疾病的治療策略提供理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒與菌株：α-MHC-Cre-hGH載體由本室保存。

1.1.2實驗動物：40只SPF級FVB小鼠，體質(zhì)量25～28 g，來源于維通利華公司【SCXK(京)2021-0011】。本實驗按照生命組學研究所國家蛋白質(zhì)科學中心北京實驗動物管理與使用委員會的相關(guān)規(guī)定進行實驗，倫理委員會審批號：IACUC-20200515-17MB。

1.1.3工具酶和試劑：所用的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、mRNA Selective PCR Kit (AMW)Ver 1.1均購自TaKaRa(大連)公司，蛋白酶K購自Merck公司。試劑盒QIA prep Spin Miniprep Kit購自Qiagen公司，瓊脂糖為Biowest Agarose瓊脂糖，核酸染料(EL105)購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。蘇木素(HHS16)購自Sigma公司。0.1 mol/L檸檬酸鹽修復液(ZLT9065)、雙氧水(PV-6001)、山羊血清工作液(ZLI-9056)、一抗稀釋液(ZLI-9020)、兔二步法試劑盒(PV6002)購自北京中杉金橋有限公司。TSA Systems相關(guān)顯色試劑購自PerkinElmer公司。Trizol購自Invitrogen公司。Real-time PCR Mix(QPK-201)購自TOYOBO公司。

1.2 方法

1.2.1心肌細胞特異性過表達Snhg5 (α-MHC-Snhg5-hGH)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建：以小鼠心臟組織cDNA為模板擴增獲得小鼠Snhg5，引物為：MHC-Snhg5 1 s(5′-TTTGTCGACGGGCTCGTTCTTTTACG ACG-3′)和Snhg5 1a(5′-TTTAAGCTTTTTGCAA TTGAATGTTTTTTA-3′)，引物兩端分別引入了SalⅠ和HindⅢ酶切位點。PCR擴增體系：1 μL cDNA，25 μL 2 × buffer ，10 μL dNTPs，1 μL KOD酶，1 μL上游引物，1μL下游引物，ddH2O補足50 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；55 ℃復性30 s；72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。將擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，回收1.1 kb左右的目的片段，克隆入T載體中，測序結(jié)果確認序列準確無誤無任何突變。將測序正確的Snhg5 片斷連入用SalⅠ和HindⅢ酶切的α-MHC-Cre-hGH載體，得到了含有α-MHC啟動子、Snhg5基因以及人生長素基因polyA共3個元件的α-MHC-Snhg5-hGH的轉(zhuǎn)基因載體。

1.2.2受精卵的顯微注射：將α-MHC-Snhg5-hGH的轉(zhuǎn)基因載體經(jīng)KpnⅠ和SacⅡ酶切線性化后，通過受精卵原核顯微注射法[8]，共注射FVB小鼠受精卵200枚，然后將獲得的受精卵移入8只母鼠的輸卵管內(nèi)進行妊娠。實驗用FVB小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房。

1.2.3轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定：取出生后10 d左右的子代小鼠，剪下約0.5 cm的尾尖置于1.5 mL離心管中，加入400 μL組織裂解液，50 ℃保溫過夜，制備基因組DNA作為PCR的模板。αMHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因特異引物α-MHC-s和MHC-Snhg5-2a由擎科公司合成，其中MHC-1: 5’-ATGACA GACAGATCCCTCCTATCTCC-3’位于α-MHC啟動了序列上，MHC-Snhg5b-2a位于Snhg5片段上，序列為5’-CGCCATTGTCCTTGTGAA-3’?？蓴U增獲得300 bp的片段，用于陽性轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測。PCR擴增體系：20 μL體系：1μL小鼠DNA，10 μL 2 × mix ，7 μL ddH2O，1μL上游引物，1μL下游引物。PCR擴增的條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

1.2.4Snhg5在不同組織中表達水平的檢測：提取心臟及其他組織RNA，將提取的RNA按 TOYOBO公司的ReverTra? Ace qPCR RT Master Mix進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反轉(zhuǎn)體系為：RNA 2 μg；5×RT Mix (TOYOBO) 2 μL；DEPC水補足至10 μL。反應條件為：37 ℃ ，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。

利用7500 Fast real-time PCR system對上述獲得的cDNA進行檢測。引物序列為：

GAPDH sense: 5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′；

GAPDH antisense: 5′-GGTCCTCAGTGTAGCCC AAG-3′；

Snhg5 sense: 5′-CAGTCCGCCTGTGAAGAT-3′；

Snhg5 antisense: 5′-CTGCCAGAATAAGGAAA TAG-3′；

擴增條件為：95 ℃：20 s，95 ℃：60 s，95 ℃：15 s，60 ℃：15 s，72 ℃：45 s，40個循環(huán)；95 ℃：15 s； 60 ℃：60 s； 95 ℃：30 s； 60 ℃：15 s。

1.2.5小鼠心臟組織學檢測：取兩個月小鼠心臟組織于4% PFA固定過夜后，放入包埋機中進行系列組織脫水和透蠟，包埋蠟塊。利用石蠟切片機制作厚度為5 μm的組織切片，用于H&E和Masson染色觀察心臟組織形態(tài)和纖維化改變情況，以及Laminin免疫熒光染色檢測心肌細胞表面積改變[9]。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準誤表示，使用統(tǒng)計學軟件Graphpad進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)進行非配對t檢驗，P<0.05和P<0.01具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建心肌細胞特異性Snhg5轉(zhuǎn)基因載體(αMHC-Snhg5-hGh)

α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因載體主要含有3個元件：5.5 kb啟動子片斷，1個1.1 kb的Snhg5基因和2.1 kb含有內(nèi)含子的人生長激素(hGH)PolyA序列(圖1A)。對得到的載體進行SalⅠ 和HindⅢ 酶切鑒定，顯示出現(xiàn)10.7 kb 和1.1 kb的片斷，其結(jié)果與預期結(jié)果相符(圖1B)。進一步利用Snhg5全長引物對載體進行 PCR鑒定，轉(zhuǎn)基因載體出現(xiàn)1.1 kb條帶，與預期結(jié)果相符(圖1C)。

圖1 α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建與鑒定注：A. α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)示意圖；B. 轉(zhuǎn)基因載體Sal Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切鑒定圖,1和10：DNA 相對分子質(zhì)量標準,2～9：連入Snhg5片段的α-MHC-Snhg5-hGH質(zhì)粒；C. 轉(zhuǎn)基因載體PCR鑒定圖,1和10：DNA 相對分子質(zhì)量標準；2～8:連入Snhg5片段的α-MHC-Snhg5-hGH質(zhì)粒Fig.1 Construction and identification of α-MHC-Snhg5 transgenic vectorNote：A. Structure diagram of α-MHC-Snhg5 transgenic vector; B. Restriction map of transgenic vectors digested by Sal I and Hind Ⅲ,1 and 10:1 kb DNA relative molecular weight standard， 2～9: α-MHC-Snhg5-hGh vectors; C. PCR identification map of transgenic vectors，1 and 10:1 kb DNA relative molecular weight standard， 2～8： α-MHC-Snhg5-hGh vectors

2.2 α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

利用KpnⅠ和SacⅡ 酶切去除原核載體序列，電泳回收8.7 kb的α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因片段。該片段純化后，用注射用TE稀釋至2.0 ng/μL。通過顯微注射，將該片段導入小鼠受精卵雄原核中。共注射FVB小鼠受精卵200枚，然后將獲得的受精卵移入8只母鼠的輸卵管內(nèi)進行妊娠，有3只假孕母鼠懷孕，獲得子代小鼠14只，陽性小鼠4只，陽性率28.6%。提取了子代小鼠的鼠尾DNA，利用α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因特異引物α-MHC-s和 MHC-Snhg5-2a進行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因首建者小鼠出現(xiàn)300 bp的陽性條帶(圖2)。

圖2 小鼠基因型鑒定結(jié)果圖注：1和10：Mark Ⅰ DNA相對分子質(zhì)量標志物；2～4：轉(zhuǎn)基因首建小鼠；5～8：非轉(zhuǎn)基因小鼠作為陰性對照；9：轉(zhuǎn)基因載體作為陽性對照Fig.2 Results of mouse genotypingNote：1,10: Mark Ⅰ DNA relative molecular weight standard; 2～4: transgenic founder mice;5～8: non-transgenic mice; 9: Transgenic vector as positive control

2.3 α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中Snhg5表達水平的檢測

為檢測Snhg5過表達的組織特異性，利用實時定量PCR檢測了轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中Snhg5的表達情況。結(jié)果顯示α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中的Snhg5表達水平較對照小鼠心臟明顯升高(圖3A)，而其他組織內(nèi)Snhg5無過表達情況 (圖3B)，表明心肌細胞特異性過表達Snhg5的轉(zhuǎn)基因小鼠建立成功。

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠心臟及其他組織中Snhg5表達水平的檢測注：A. 對照和轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟組織中Snhg5表達水平的檢測；B. 對照組和轉(zhuǎn)基因小鼠其他組織中Snhg5的表達水平的檢測 Fig.3 Detection of Snhg5 expression level in the multiple tissues of transgenic miceNote: A. Detection of Snhg5 expression level in heart tissue from control and transgenic mice; B. Detection of Snhg5 expression level in other tissues from control and transgenic mice

2.4 Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠在異丙腎上腺素(ISO)誘導之后更容易發(fā)生心臟重塑

對基礎水平和ISO處理情況下轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠心臟組織的大體形態(tài)和組織學變化情況檢測結(jié)果顯示，盡管2月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠的心臟大體形態(tài)和組織學結(jié)構(gòu)在基礎水平無明顯差異(圖4)，但在ISO處理情況下，轉(zhuǎn)基因小鼠較對照小鼠更容易發(fā)生心臟增大(圖4A)，心臟質(zhì)量與脛骨長度或體重比值明顯增加(圖4B和4C)，心室壁增厚(圖4 D和4E)，以及心肌細胞面積增加(圖4F和4 G)，這些結(jié)果表明，與對照小鼠相比，Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠在ISO處理后更容易發(fā)生心肌肥厚，提示Snhg5會促進心臟重塑的發(fā)生。

圖4 Snhg5過表達加重ISO引發(fā)的心肌肥厚注：A．心臟大體形態(tài)分析；B，C：鼠心臟質(zhì)量與脛骨長度比值，小鼠心臟質(zhì)量骨長度比值統(tǒng)計結(jié)果，n=5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0005；D，E：心臟組織切片的H&E和Masson染色結(jié)果；F. 心臟組織切片的Laminin免疫熒光染色結(jié)果；G. 小鼠心臟切片細胞表面積的統(tǒng)計結(jié)果，n=3，*P<0.05Fig.4 Overexpression of Snhg5 aggravates ISO-induced cardiac hypertrophyNote: A. Cardiac gross morphology analysis of different groups of mice; B, C:Ratio of heart weight to tibia length or body weight,n= 5, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.0005; D, E: H&E and Masson staining results of heart tissue sections; F.Laminin immunofluorescence staining of heart tissue sections; G:Statistical results of cell surface area of heart sections, n=3, *P<0.05

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA導入動物受精卵或胚胎干細胞內(nèi)，以隨機插入或同源重組的方式整合到受體染色體中，并隨細胞的分裂而遺傳給后代的技術(shù)[10]，通過該技術(shù)為生命科學和醫(yī)學科學研究提供了一系列理想的疾病模型。隨著LncRNA在心臟中功能研究的深入，建立心臟組織特異性LncRNA轉(zhuǎn)基因疾病動物模型對于研究LncRNA在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能和相關(guān)機制非常必要，而目前僅有少量心臟組織特異性LncRNA轉(zhuǎn)基因小鼠模型被報道[11-12]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Snhg5在主動脈結(jié)扎手術(shù)(TAC)引起的病理性心肌肥厚和心衰小鼠模型心臟組織中表達水平明顯升高。為了研究Snhg5在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能，本研究中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立了心肌細胞特異性Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠，利用實時定量PCR對不同組織內(nèi)Snhg5的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)Snhg5只在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中表達水平明顯升高，表明該轉(zhuǎn)基因小鼠建立成功，為研究Snhg5在心臟組織中的功能提供了理想的動物模型。

目前關(guān)于Snhg5功能的研究大多局限在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中。Snhg5在多種癌癥中異常表達，影響著腫瘤細胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、細胞周期和自噬等[13]。Snhg5可以作為miRNA的 sponges調(diào)控癌癥的表型和惡性程度[14]。Snhg5還可以通過調(diào)控包括Wnt/β-catenin信號通路在內(nèi)的一些重要的信號通路，以及調(diào)節(jié)上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程[15]，從而影響癌癥的發(fā)生及進展。此外，Snhg5還可作為腫瘤的血清學診斷分子標志物[16]。而迄今為止，關(guān)于Snhg5在心臟穩(wěn)態(tài)維持中是否發(fā)揮功能尚未見報道。通過對建立的心肌細胞特異性Snhg5小鼠進行表型分析，發(fā)現(xiàn)盡管轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟組織形態(tài)在基礎水平與對照小鼠無明顯差別，但在特定病理刺激下更容易發(fā)生心臟重塑，表明Snhg5過表達會促進心臟重塑。

綜上所述，心肌細胞特異性Snhg5過表達轉(zhuǎn)基因小鼠的成功建立不僅有助于揭示Snhg5在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能，還可能成為研究人類心臟疾病發(fā)生機制、開展新藥研發(fā)及療效評價的理想動物模型。