范芳芳，李媛，魏寧果，鄒力

陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（西安 710048）

β-胡蘿卜素屬于類(lèi)胡蘿卜素中的一種異構(gòu)體，可溶于脂類(lèi)和非極性溶劑中。由于特殊的共軛雙鍵多烯結(jié)構(gòu)，被稱(chēng)為“最有希望的抗氧化劑之一”[1]。其形態(tài)為暗紅色晶體，具有良好的著色功能[2]。一分子的β-胡蘿卜素在加氧酶的作用下可分解為兩分子的維生素A，又被稱(chēng)為維生素A源[3]。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性能β-胡蘿卜素被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域[4]。自從β-胡蘿卜素被第23版美國(guó)藥典收載，世界范圍內(nèi)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)已批準(zhǔn)使用胡蘿卜素，我國(guó)則在GB 2760—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中就已經(jīng)許可使用[5]。但人體攝入過(guò)量的β-胡蘿卜素會(huì)導(dǎo)致皮膚發(fā)黃，攝入大量的β-胡蘿卜素會(huì)使維生素A與相應(yīng)受體結(jié)合受阻[6]。我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定β-胡蘿卜素在糕點(diǎn)中的允許使用限量為1.0 g/kg[7]。因此，建立糕點(diǎn)中β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)分析體系對(duì)于我國(guó)的食品安全監(jiān)管具有極其重要意義。

β-胡蘿卜素的提取工藝主要有溶劑提取法[8]、超聲波提取法[9-10]、微波提取法[11]、酶解輔助萃取法[12]和超臨界流體CO2萃取法[13]。檢測(cè)方法主要有分光光度法[14]和高效液相色譜法[15]。溶劑提取工藝具有容易操作、適用范圍廣泛且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)[16]而被普遍應(yīng)用。高效液相色譜的檢測(cè)方法較分光光度法具有定量好、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，因此食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用溶劑提取與高效液相結(jié)合的方法對(duì)食品中的β-胡蘿卜素進(jìn)行定量分析。傳統(tǒng)的提取溶劑一般為石油醚、二氯甲烷、丙酮等，但二氯甲烷、丙酮對(duì)人體危害較大，石油醚易揮發(fā)且會(huì)將自身雜質(zhì)帶入實(shí)驗(yàn)結(jié)果中。試驗(yàn)將相對(duì)危害較小、穩(wěn)定性較好的正己烷作為提取溶劑，應(yīng)用于糕點(diǎn)中β-胡蘿卜素的提取。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

LC-30AD超高效液相色譜儀、LC-SPD紫外檢測(cè)器、LabSolutions系統(tǒng)（日本島津公司）；Agilent Proshell SB-C18色譜柱（型號(hào)100 mm×3.0 mm，粒徑2.7 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；水浴恒溫振蕩器（天津市歐諾儀儀器儀表有限公司，型號(hào)為WE-3）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘潭湘儀儀器有限公司，型號(hào)為H1750R）；多樣品渦旋混合器（廣州得泰儀器科技有限公司，型號(hào)為MultiVortex圓盤(pán)形排列，12位）；精確度為0.000 1 g的電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，型號(hào)為BSA224S）；氮吹儀（廣州得泰儀器科技有限公司，型號(hào)為FV-64）；0.2 μm GHP有機(jī)過(guò)濾膜（美國(guó)Waters公司）。

1.1.2 材料與試劑

L（+）抗壞血酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；α-淀粉酶（≥3 700活力單位/g）；氫氧化鉀（分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心）；甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇（色譜純，德國(guó)霍尼韋爾公司）；正己烷（色譜純，賽默飛世爾科技）；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（北京振翔科技有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制（500 μg/mL）：稱(chēng)取0.050 0 gβ-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，以正己烷溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

從β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間液中分別準(zhǔn)確移取0.004，0.008，0.016，0.040和0.080 mL于5個(gè)10 mL棕色容量瓶。用正己烷定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.8，2.0和4.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 皂化

稱(chēng)取5.0 g經(jīng)均質(zhì)處理的試樣于50 mL具塞離心管中，加入0.4 gα-淀粉酶，加10 mL 45～50 ℃超純水，蓋上瓶蓋，渦旋混勻，置于恒溫水浴箱內(nèi)避光振蕩30 min，溫度設(shè)為55 ℃。再加入0.4 g抗壞血酸，12 mL無(wú)水乙醇，渦旋30 s，加入6 mL（50 g/100 g）KOH溶液，繼續(xù)渦旋30 s，然后再次置于恒溫水浴箱內(nèi)振蕩30 min，溫度設(shè)為60 ℃。

1.4.2 提取

向快速冷卻后的上述皂化液中加入20 mL正己烷，渦旋提取3 min，在10 000 r/min條件下冷凍離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于50 mL離心管，加入25 mL水輕微晃動(dòng)30次，進(jìn)一步洗去雜質(zhì)，在10 000 r/min條件下冷凍離心5 min。

1.4.3 富集

取所有上層有機(jī)相至50 mL離心管，于40 ℃氮吹至干，殘?jiān)? mL正己烷復(fù)溶，待測(cè)液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供超高效液相色譜儀分析使用。

1.5 儀器分析條件

色譜柱Agilent Proshell SB-C18（100 mm×3.0 mm，粒徑2.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈-甲醇體系（乙腈∶甲醇=85∶15）等度洗脫；流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量4 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

采用乙腈-甲醇流動(dòng)相體系考察3根色譜柱對(duì)β-胡蘿卜素分離的影響，包括Agilent Proshell SB-C18（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）、Silversil C18色譜柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）和CAPCELL PAK CR150（150 mm×2 mm，5 μm）結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 色譜柱CAPCELL PAK CR150的色譜圖

圖3 色譜柱Silversil C18的色譜圖

不同色譜柱對(duì)于β-胡蘿卜素的保留情況各不相同。CAPCELL PAK CR150色譜柱的分離是由十八烷基引起的疏水性磺酸基引起的強(qiáng)陽(yáng)離子交換模式進(jìn)行，該柱子可以滿足除強(qiáng)極性、小分子類(lèi)化合物外的大部分化合物的分離需求。由圖1可以看出，極性較弱的β-胡蘿卜能夠被充分分離，且峰型較好。POROSHELL SB-C18色譜柱具有小粒徑填料，能夠高效、高分離、快速實(shí)現(xiàn)化合物的保留。由圖2可以看出，β-胡蘿卜素能夠被快速分離，且峰型尖銳平滑分離度高。Silversil C18色譜柱采用低壓設(shè)計(jì)，大幅降低色譜柱壓對(duì)儀器造成的長(zhǎng)時(shí)間潛在影響，其優(yōu)點(diǎn)是延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，但該填料對(duì)脂溶性物質(zhì)β-胡蘿卜素的保留效果不如前2個(gè)柱子。其分離效果見(jiàn)圖3，目標(biāo)峰出現(xiàn)前拖尾現(xiàn)象，且出峰時(shí)間較長(zhǎng)。因此，CAPCELL PAK CR150和POROSHELL SB-C18可以滿足糕點(diǎn)樣品中β-胡蘿卜素的測(cè)定要求。但是綜合出峰時(shí)間及造價(jià)這2個(gè)因素，試驗(yàn)選擇POROSHELL SB-C18色譜柱進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 色譜柱POROSHELL SB-C18的色譜圖

2.2 有機(jī)提取溶劑的選擇

由于β-胡蘿卜素屬于非極性類(lèi)胡蘿卜素，因此常用的提取試劑為正己烷、丙酮、石油醚及二氯甲烷等非極性有機(jī)溶劑。試驗(yàn)以添加了β-胡蘿卜素的樣品為原料對(duì)比不同溶劑的提取效率，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，石油醚的提取效率最高，這與GB 5009.83—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中胡蘿卜的測(cè)定》所選提取試劑一致，其次為正己烷的提取率，二者均能滿足定量分析的要求。考慮到石油醚容易揮發(fā)，長(zhǎng)期使用人體吸入較多，且自身雜質(zhì)的帶入可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，因此試驗(yàn)采用正己烷作為提取溶劑。

圖4 不同溶劑的提取含量圖

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用3D檢測(cè)模式，對(duì)β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描（見(jiàn)圖5）。選擇450 nm為最佳吸收波長(zhǎng)。

圖5 β-胡蘿卜素的光譜圖

2.4 流速的選擇

一般而言，流速越大，出峰時(shí)間越短。試驗(yàn)在確定Agilent Proshell SB-C18為試驗(yàn)色譜柱且相同進(jìn)樣量的條件下加大流速，分別進(jìn)行0.4，0.5，0.8，1.0和1.2 mL/min 5個(gè)流速的對(duì)比篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速為0.5 mL/min時(shí)，試驗(yàn)既能提高測(cè)定效率又能保證有效分離。且流速越大，系統(tǒng)壓力較高，長(zhǎng)期使用對(duì)儀器損害較大。故流速確定為0.5 mL/min。

2.5 皂化與未皂化

對(duì)比進(jìn)行皂化反應(yīng)與不進(jìn)行皂化反應(yīng)的試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 皂化試驗(yàn)提取對(duì)比圖

同一樣品在其他條件相同的情況下，經(jīng)過(guò)皂化反應(yīng)的試驗(yàn)β-胡蘿卜素提取結(jié)果為294 μg/kg，未皂化反應(yīng)的試驗(yàn)β-胡蘿卜素的提取結(jié)果為177 μg/kg。這是由于β-胡蘿卜素被包括在蛋白質(zhì)、淀粉等大分子顆粒里面，皂化反應(yīng)使目標(biāo)物與這些大分子有機(jī)顆粒分離，為提高提取效率提供保障。

2.6 方法驗(yàn)證與試驗(yàn)

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線，觀察線性效果，如表1所示。

表1 β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試數(shù)據(jù)

2.6.2 檢出限

分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用正己烷逐步定量稀釋?zhuān)M(jìn)樣分析，按S/N≥3確定β-胡蘿卜素的檢出限，得出β-胡蘿卜素的檢出限為0.72 μg/100 g。將分析物分別加入空白樣品中，加入含量為方法檢出限（加入標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為0.036 μg/mL，體積為1 mL）含量，進(jìn)行平行試驗(yàn)，連續(xù)11次重復(fù)性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 β-胡蘿卜素的檢出限測(cè)試數(shù)據(jù)

根據(jù)GB/T 32465—2015中7.5.4的要求，11次重復(fù)性測(cè)試的偏差均在方法檢出限±20%范圍內(nèi)，即該方法的檢出限可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.6.3 精密度

將0.72，2.16和10 000.00 μg/100 g三個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的分析物（方法檢出限的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、3倍方法檢出限即定量限濃度及標(biāo)準(zhǔn)限量時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）加入空白樣品中，分別進(jìn)行7次重復(fù)性測(cè)試，計(jì)算β-胡蘿卜素的精密度，如表3所示。

表3 β-胡蘿卜素的精密度測(cè)試數(shù)據(jù)

試驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)符合GB/T 27404—2008中表F.2的參考范圍，故方法精密度達(dá)到要求。

2.6.4 回收率

向空白樣品中分別進(jìn)行三次不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的加標(biāo)試驗(yàn)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)一：2.8 μg/100 g，加標(biāo)溶液質(zhì)量濃度1 μg/mL，體積為0.14 mL；質(zhì)量分?jǐn)?shù)二：28.0 μg/100 g，所需加標(biāo)溶液質(zhì)量濃度10 μg/mL，體積為0.14 mL；質(zhì)量分?jǐn)?shù)三：10 000.0 μg/100 g，所需加標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為500 μg/mL，體積為1 mL。計(jì)算加標(biāo)回收率，如表4所示。

表4 β-胡蘿卜素的實(shí)際樣品加標(biāo)測(cè)試數(shù)據(jù)

該試驗(yàn)加標(biāo)回收率符合GB/T 27404—2008中表F.2的參考范圍，方法加標(biāo)回收率達(dá)到要求。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用上述方法，對(duì)市售的10批糕點(diǎn)樣品中β-胡蘿卜素含量行測(cè)定，結(jié)果測(cè)得β-胡蘿卜素含量為3 000～ 4 000 μg/100 g。

3 結(jié)論

建立正己烷溶劑提取與超高效液相色譜結(jié)合測(cè)定糕點(diǎn)中β-胡蘿卜素定量分析方法。通過(guò)對(duì)色譜柱、流速、提取溶劑優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)糕點(diǎn)中β-胡蘿卜素的準(zhǔn)確高效提取。與傳統(tǒng)的提取方法相比，該方法從流動(dòng)相到提取試劑，只采用甲醇、乙腈、乙醇和正己烷4種有機(jī)試劑，并大大減少有機(jī)溶劑的使用量。操作中去掉分液漏斗等裝置，減少反復(fù)置換容器帶來(lái)的損失。該方法具有綠色環(huán)保、環(huán)境友好、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的大批量測(cè)定。