王振宇，王澤青，劉占宏，滿金龍，孫世峰，李紅魁，呂曉惠，王志學(xué)＊

1 遼寧科技學(xué)院生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院遼寧省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧本溪 117004

2 遼寧省農(nóng)產(chǎn)品及獸藥飼料產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧沈陽(yáng) 110053

3 遼寧省無(wú)抗養(yǎng)殖科技院，遼寧沈陽(yáng) 110000

4 遼寧輝山乳業(yè)集團(tuán)孫家牧業(yè)有限公司，遼寧沈陽(yáng) 110164

5 遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110161

0 引言

奶牛乳房炎嚴(yán)重影響奶業(yè)生產(chǎn)[1]，并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]，一是導(dǎo)致奶牛淘汰而造成的奶牛育成成本損失；二是導(dǎo)致產(chǎn)奶期提早結(jié)束而帶來(lái)的飼養(yǎng)成本損失；三是導(dǎo)致乳區(qū)永久性失去功能而造成的產(chǎn)能減少損失。目前，奶牛乳房炎治療主要依靠抗生素加地塞米松等[1]，但這會(huì)造成牛奶中抗生素殘留，并且間接危害人體健康。因此，奶業(yè)生產(chǎn)中亟需無(wú)抗治療奶牛乳房炎的藥物。中醫(yī)藥典籍中，如《太平惠民和劑局方》《外科正宗》和《中獸醫(yī)手冊(cè)》中有很多治療人類(lèi)通乳消癰和動(dòng)物乳房炎的理論[3~5]。本試驗(yàn)嘗試使用以青皮、柴胡和黃芪等為主要成分的中獸藥散劑，對(duì)奶牛場(chǎng)中患有乳房炎的產(chǎn)奶期奶牛進(jìn)行治療，并通過(guò)考察奶牛乳房炎病程情況、奶牛免疫情況和牛奶品質(zhì)等，綜合評(píng)估中獸藥散劑的治療效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

遼寧省沈陽(yáng)市法庫(kù)縣某奶牛場(chǎng)的患臨床型乳房炎的荷斯坦牛，試驗(yàn)前未進(jìn)行過(guò)任何治療。

1.1.2 儀器和試劑

牛血細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，酶免公司；光學(xué)顯微鏡（CX33），奧林巴斯公司；酶標(biāo)儀（Thermofisher Multiskan FC），賽默飛世爾中國(guó)；雙人單面垂直凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2D），蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；冷藏柜（SC-320D），海爾集團(tuán)有限公司；電子天平（JA2003），上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司。

中獸藥散劑（300 g/份）包含柴胡40 g、黃芩 40 g、青皮 30 g、黃芪 40 g、生地40 g、丹參 40 g、枳實(shí)10 g和蒲黃5 g等，炮制方法參考專(zhuān)利[6]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組

從患臨床型乳房炎的奶牛中隨機(jī)選取20 頭（金黃色葡萄球菌感染所致），分為2 組（每組10頭），空白對(duì)照組和治療組。空白對(duì)照組：不進(jìn)行任何治療；治療組：使用中獸藥散劑治療，每頭奶牛灌服中獸藥散劑300 g/天。試驗(yàn)周期為12 天。試驗(yàn)期間，觀察奶牛狀態(tài)并記錄。

1.2.2 取樣檢測(cè)

（1）血液樣本

使用真空采血管采集奶牛尾靜脈血液樣本，進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞含量檢測(cè)和IL-1β、IL-6和TNF-α含量檢測(cè)。

白細(xì)胞計(jì)數(shù)。取20 μL血液樣品放入0.38 mL白細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋液[2%冰乙酸（冰乙酸2 mL、蒸餾水98 mL、10 g/L亞甲藍(lán)溶液3 滴]，滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)。

粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞含量檢測(cè)。制備血涂片后，經(jīng)滴加瑞士染液染色、磷酸緩沖液沖洗和干燥后，鏡檢并記錄粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例情況。

IL-1β、IL-6和TNF-α含量檢測(cè)。按照牛血細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別檢測(cè)奶牛血液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

（2）牛奶樣品

體細(xì)胞數(shù)測(cè)定。試驗(yàn)中采用加利福尼亞測(cè)試（CMT）判斷奶牛乳房炎病程情況[7]。按照CMT法的判定標(biāo)準(zhǔn)，用陰性（t）、可疑（n）、弱陽(yáng)性（1）、陽(yáng)性（2）和強(qiáng)陽(yáng)性（3）表示奶牛乳房炎病程情況。

1.3 結(jié)果判定和數(shù)據(jù)處理

治愈奶牛的判定：奶牛行為正常，乳區(qū)通暢且無(wú)紅、腫、熱、痛等炎癥反應(yīng)，且無(wú)復(fù)發(fā)現(xiàn)象。同時(shí)，牛奶中的凝塊、絮狀物消失，牛奶色澤和產(chǎn)量恢復(fù)正常。

治愈率（%）=（治愈奶牛數(shù)/治療的奶?？倲?shù)）×100%。

數(shù)據(jù)處理：應(yīng)用SPSS18.0軟件中的T檢驗(yàn)功能，分別分析兩個(gè)試驗(yàn)組間白細(xì)胞總數(shù)、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例、細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量之間的差異性，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳房炎病程情況

如表1所示，試驗(yàn)初始時(shí)，治療組和空白對(duì)照組中奶牛所產(chǎn)牛奶經(jīng)CMT方法判斷體細(xì)胞數(shù)高于正常水平，表明奶?；加胁煌潭鹊娜榉垦祝⑶绎@示部分奶區(qū)堵塞的奶牛乳房炎病情較重。經(jīng)過(guò)中藥散劑治療7 d時(shí)，治療組中所有奶牛的乳區(qū)全部恢復(fù)通暢，顯示中藥散劑具有較好的通乳作用。治療12 d時(shí)，治療組中，9 頭奶牛牛奶的CMT檢測(cè)呈陰性，顯示牛奶中體細(xì)胞數(shù)恢復(fù)至正常水平，即這9頭奶牛乳房炎被治愈，1 頭為CMT檢測(cè)弱陽(yáng)性，顯示奶牛乳房炎病情較初始時(shí)得到緩解，治愈率達(dá)90%?？瞻讓?duì)照組中，經(jīng)過(guò)12 d喂養(yǎng)后，除1 頭奶牛乳房炎自愈外，其余奶牛乳房炎未見(jiàn)好轉(zhuǎn)，2 頭奶牛新增乳區(qū)堵塞情況即乳房炎病情加重。以上結(jié)果顯示，中藥散劑可使奶牛被堵塞奶區(qū)恢復(fù)通暢，并減少牛奶體細(xì)胞數(shù)，緩解奶牛乳房炎。

表1 奶牛乳區(qū)通暢情況和乳房炎病程情況

2.2 奶牛免疫情況

由圖1A可知，治療組中，在治療的3 d至5 d，奶牛白細(xì)胞總數(shù)逐漸增加至1 d時(shí)的約145%，而后逐漸降低（12 d時(shí)降低至1 d的53%）；對(duì)照組中，未進(jìn)行任何治療和處理，奶牛白細(xì)胞總數(shù)波動(dòng)很小。以上結(jié)果顯示，中獸藥散劑可對(duì)奶牛白細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生影響。

圖1奶牛血液中白細(xì)胞含量及粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞占比

由圖1B和圖1C可知，中藥散劑治療對(duì)奶牛粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例影響較大。在治療組中，1 d至5 d，中藥散劑將奶牛血液中粒細(xì)胞比例由2%以下，提升至33.6%；7 d至12 d，粒細(xì)胞比例先增至46.3%，后降低到32.7%。在對(duì)照組中，奶牛白細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例波動(dòng)較小。其中，淋巴細(xì)胞比例為64.6%~80.4%，粒細(xì)胞比例為小于18.3%。以上結(jié)果顯示，中獸藥散劑可對(duì)奶牛血液中粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例產(chǎn)生影響。

由圖2可知，對(duì)照組奶牛血液中IL-6和TNF-α含量在試驗(yàn)期間波動(dòng)較小，IL-1β含量逐步增加（12 d時(shí)，較初始值增加51.8%）；而治療組奶牛血液中，IL-1β、IL-6和TNF-α含量變化均呈現(xiàn)出，先降低，后逐步增加的現(xiàn)象，即炎癥因子水平先降低，后逐步恢復(fù)。在治療組中，在3 d時(shí)，奶牛血液中TNF-α達(dá)到最低水平，較未治療前降低了69.2%；在5 d時(shí)，奶牛血液中IL-1β含量下降到最低，較未治療前降低了71.0%；在7 d時(shí)，奶牛血液中IL-6含量下降到最低，較未治療前降低了66.3%。以上結(jié)果顯示，中獸藥散劑可對(duì)奶牛血液中炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平產(chǎn)生影響。

圖2 奶牛血液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量

3 討論

3.1 奶牛乳房炎治療情況分析

乳房炎，又名乳癰，是母畜乳房出現(xiàn)臃腫，腫痛，乳汁不暢，乳汁變性的疾病[5]。乳癰多因肝氣郁結(jié)，乳汁淤積不通，邪氣化熱，進(jìn)而邪毒與積乳互結(jié)，阻于乳絡(luò)，也可發(fā)為癰腫[8，9]。朱震亨[10]認(rèn)為可用青皮治療乳癰。陳修園[11]認(rèn)為柴胡等可疏肝理氣，治療乳癰。依據(jù)前人理論和實(shí)踐，本試驗(yàn)中乳房炎奶牛的通乳治療效果（表1），顯示中藥散劑中青皮和柴胡對(duì)奶牛乳房炎治療產(chǎn)生了積極效果。

經(jīng)過(guò)為期12 d試驗(yàn)，治療組中9 頭奶牛乳房炎痊愈，1 頭奶牛的乳房炎癥狀得到緩解，治愈率達(dá)到95%，這顯示中藥散劑對(duì)奶牛乳房炎具有很好療效；對(duì)照組奶牛，除1頭在3 d時(shí)自愈外，其余奶牛乳房炎癥狀不同程度惡化，但沒(méi)有威脅奶牛生命。推測(cè)，中藥散的療效應(yīng)來(lái)自于其中青皮、柴胡和茯苓等藥材的治療作用。

由表1可知，中藥散劑可以在7 d內(nèi)通乳消癰，這顯示其具有疏通奶牛堵塞奶區(qū)的功能。奶區(qū)堵塞的原因可能是，乳腺細(xì)胞纖維化和乳腺細(xì)胞發(fā)炎腫脹導(dǎo)致的乳汁分泌功能障礙，以及細(xì)菌產(chǎn)生的菌膜堵塞乳腺。推測(cè)中藥中所含生物活性成分可以起到通乳消癰的作用。首先，柴胡所含山柰酚可以有效抑制機(jī)體細(xì)胞的纖維化[12]，推測(cè)可以幫助乳腺細(xì)胞恢復(fù)分泌功能，并對(duì)通乳起到了一定作用。其次，青皮、柴胡和黃芩中含有較多的多烯類(lèi)物質(zhì)、黃酮類(lèi)物質(zhì)和部分醇類(lèi)物質(zhì)[13~15]，這些生物活性成分具有較好的抗炎和抗菌活性。例如，青皮中含有的D-檸檬烯，可調(diào)節(jié)iNOS、COX-2、PGE2、TGF-β和ERK1/2信號(hào)通路降低炎癥因子的表達(dá)水平，產(chǎn)生抗炎作用[14]。柴胡中黃酮類(lèi)物質(zhì)，如柴胡皂苷A和D等具有抗炎作用，可通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的作用以及刺激內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的釋放，起到抗炎作用[13]。同時(shí)，柴胡中所含有的法尼醇，可以對(duì)抗金黃色葡萄球菌、杜布蘭念珠菌和白色念珠菌引起的感染，并可以阻止病原菌形成菌膜[16，17]。因此，推測(cè)中藥散劑可能通過(guò)抑制奶牛乳腺細(xì)胞纖維化、抗炎和拮抗病原菌，達(dá)到治療奶牛乳房炎的效果。

3.2奶牛免疫情況分析

本試驗(yàn)中，奶牛血液中白細(xì)胞總數(shù)（圖1A）、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例（圖1B和C），以及細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量（圖2）的變化情況，表明中藥散劑可以調(diào)節(jié)奶牛免疫功能。

第一，中藥散劑中含有黃芪，可以增加T和B淋巴細(xì)胞的增殖和抗體的產(chǎn)生，同時(shí)還可以抑制腹腔巨噬細(xì)胞IL-1和TNF-α的產(chǎn)生[18]。本試驗(yàn)治療中前期（3~7 d）觀察到的結(jié)果與該報(bào)道一致。而散劑中柴胡所含有的多糖成分，可以增強(qiáng)細(xì)胞吞噬活性和抑制炎癥的作用[19]。推測(cè)，中藥散劑可以提高奶牛免疫功能。

第二，白細(xì)胞中粒細(xì)胞對(duì)抗病原菌能力較強(qiáng)，而淋巴細(xì)胞拮抗病毒能力較強(qiáng)。圖1顯示，中藥散劑可顯著增加粒細(xì)胞占比，進(jìn)而增強(qiáng)奶牛對(duì)抗病原菌感染的能力。同時(shí)，淋巴細(xì)胞占比相對(duì)減少，因此滲入到牛奶中的數(shù)量也會(huì)減少。推測(cè)，表1中治療組的牛奶所含體細(xì)胞數(shù)量減少可能與此有關(guān)。

第三，IL-1β、IL-6和TNF-α是導(dǎo)致乳房炎發(fā)病及病程進(jìn)展的主要炎癥因子[20，21]。在治療的3~7 d，奶牛血液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量分別降低至1 d值的64.8%~71.0%（圖2），顯示中藥散劑有效降低了炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，即有效抑制了以上細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而有效治療奶牛乳房炎。

第四，《局方》“神效托里散”和《外科正宗》“透膿散”，認(rèn)為黃芪可作為主藥治療“乳癰”或“癰疽諸毒內(nèi)膿已成，不穿破者”[3，4]。依據(jù)前人理論和實(shí)踐，黃芪能夠治療“癰疽諸毒內(nèi)膿”等癥狀，可能是治療藥物中含黃芪，可以降低細(xì)胞炎癥因子水平，起到消炎作用（圖2）。

另外，奶牛血液中白細(xì)胞總數(shù)先增加后降低至略低于初始值的現(xiàn)象，以及IL-1β、IL-6和TNF-α的含量在達(dá)到最低后逐步升高的情況（圖2），可能表明奶牛機(jī)體在經(jīng)過(guò)初期中藥散劑治療后，逐步適應(yīng)了其作用，而后逐步形成新的免疫穩(wěn)態(tài)，這也顯示中藥散劑治療具有安全性。

4 小結(jié)

綜上所述，試驗(yàn)表明中藥散劑可以通乳消癰，使其產(chǎn)奶恢復(fù)正常。同時(shí)，中藥散劑可有效減少牛奶中體細(xì)胞數(shù)量；可增加奶牛白細(xì)胞中粒細(xì)胞在白細(xì)胞中的比例，提升奶牛抵抗病原菌感染的能力；可以降低IL-1β、IL-6和TNF-α含量，抑制奶牛炎癥反應(yīng)。因此，可推測(cè)中藥散劑可以通過(guò)調(diào)節(jié)奶牛免疫功能，通乳消癰，并達(dá)到治療奶牛乳房炎的目的。