崔藝燕，李家洲，田志梅，鄧盾，魯慧杰，劉志昌，容庭，馬現(xiàn)永，2*

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評定工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510640；2. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，廣東茂名 525000）

茶（Camellia sinensis）是中國的傳統(tǒng)飲料，是僅次于水的全球第二大最常用的飲料［1］。2019 年，全球茶葉產(chǎn)量約為650 萬t［1］。中國茶渣的排放量約為每年16 萬t［2］。大量茶葉廢料在開放的環(huán)境中產(chǎn)生和丟棄，這些可再生的生物質(zhì)資源給環(huán)境帶來了巨大的壓力，同時也浪費了茶葉中的生物活性成分。茶渣的資源化利用已成為亟待解決的問題。

實際上，茶渣中含有許多營養(yǎng)物質(zhì)。干茶渣的主要營養(yǎng)成分包括粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）、碳水化合物、粗纖維（crude fiber，CF）等［3-4］。此外，茶渣所含的生物活性化合物與普通茶相同，且含量相似［5］。茶渣富含功能物質(zhì)，如多酚、生物堿、皂苷、多糖和有機酸［5-8］，以及具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗肥胖和抗糖尿病等活性［5，8］。動物研究表明，茶渣不僅能提高動物的免疫力，調(diào)節(jié)肌肉纖維類型，還能改善動物的消化能力、肉品質(zhì)、抗氧化能力和腸道形態(tài)［9-11］。因此，茶渣是一種很有前途的飼料添加劑。但茶渣中含有皂苷、咖啡因等抗營養(yǎng)因子［8］，適口性差，不適合作為飼料添加劑直接使用。選擇綠色有效的生物技術(shù)改良茶渣，對于茶資源的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

固態(tài)發(fā)酵是一種經(jīng)濟有效的生產(chǎn)技術(shù)，具有規(guī)模小、操作簡單、生產(chǎn)成本低、不污染環(huán)境等優(yōu)點。真菌的菌絲遍布表面，生長迅速，代謝活性高［12］。真菌可以產(chǎn)生代謝物并促進化合物的生物轉(zhuǎn)化［13］。真菌分泌豐富的蛋白酶、纖維素酶等酶系，使大分子物質(zhì)分解為葡萄糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，從而改善飼料品質(zhì)?？祵幠久梗═richoderma koningii）常用于植物病原菌的生物防治中，在各種農(nóng)業(yè)廢棄物飼料轉(zhuǎn)化中也較為常見。康寧木霉能夠在不利的環(huán)境條件下繁殖，能夠使用多種碳源和氮源［12］。研究發(fā)現(xiàn)，康寧木霉發(fā)酵桑葉（Morus alba）后的CP 含量高達31.27%，產(chǎn)蛋白酶活性高達107.173 U·mL-1［14］。康寧木霉也是分解高粱（Sorghum bicolor）秸稈CF 的優(yōu)勢菌種［15］。目前，茶渣的研究集中在有機肥［4，16］、蘑菇基質(zhì)［17］、吸附重金屬、處理廢水［18］、制備磚［7］等方向，茶渣飼料化利用以直接飼喂反芻動物為主［3，9］，對茶渣進行發(fā)酵處理的較少。同時，未見康寧木霉發(fā)酵茶渣的相關(guān)研究。因此，本研究目的是通過單因素和正交試驗，篩選出康寧木霉茶渣發(fā)酵條件。利用康寧木霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵茶渣，以提高茶渣的營養(yǎng)價值和功能成分，降低抗營養(yǎng)因子的含量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020 年1-10 月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新大樓進行。茶渣由康師傅飲料有限公司提供，60 ℃干燥后，研磨成粉，過0.425 mm 篩。茶渣CP、EE、CF、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）的含量分別為25.93%、2.67%、25.48%、45.45%和25.23%。康寧木霉從陳皮分離篩選所得，菌絲放射狀生長，菌落背面淺黃色，孢子為黃綠色。

1.2 試驗方法

1.2.1真菌擴增及孢子液的制備 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基用作擴增培養(yǎng)基。將0.2 mL 2×108~3×108個孢子·mL-1孢子液涂布到PDA 培養(yǎng)基的表面，28 ℃培養(yǎng)5~7 d。為制備孢子液，首先用無菌刀片刮擦長滿真菌的培養(yǎng)基表面。用5 mL 無菌水把真菌及表面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中，加入3 顆玻璃珠，渦旋勻漿15 min。最后，采用無菌脫脂棉進行過濾，混合液過濾2 次得孢子懸浮液。使用血球計數(shù)板（XB.K.25，上海市求精生化試劑儀器有限公司）對孢子的濃度進行計數(shù)，使用濃度為1×107個孢子·mL-1。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 將40 g 茶渣混合物（相應(yīng)基質(zhì)比例）放入200 mL 培養(yǎng)瓶中，121 ℃滅菌20 min。冷卻后，在無菌條件下，每個瓶中加入相應(yīng)量的孢子懸浮液，用無菌玻璃棒將孢子懸液和底物攪拌50 次以上，最后用透氣蓋封口。

1.3 單因素試驗

在自然pH 下，研究基質(zhì)比例（茶渣∶玉米粉）、料液比（基質(zhì)∶水）、接種量、溫度和時間對茶渣發(fā)酵效果的影響。以CP、EE、還原糖、黃酮、皂苷和咖啡因含量為測定指標，選出較好的單因素水平，據(jù)此進行下一個單因素試驗，每水平3 個重復(fù)。

1.3.1基質(zhì)比例對發(fā)酵茶渣的影響 茶渣∶玉米粉比例設(shè)為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，料液比為4∶6，接種量為4%，溫度為28 ℃，時間為8 d。

1.3.2料液比對發(fā)酵茶渣的影響 按1.3.1 確定的基質(zhì)比例，料液比設(shè)為3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3，其他條件同1.3.1。

1.3.3接種量對發(fā)酵茶渣的影響 按1.3.2 確定的料液比，接種量設(shè)為2%、4%、6%、8%、10%，其他條件同1.3.2。

1.3.4溫度對發(fā)酵茶渣的影響 按1.3.3 確定的接種量，溫度設(shè)為25、28、31、34、37 ℃，其他條件同1.3.3。

1.3.5時間對發(fā)酵茶渣的影響 按1.3.4 確定的溫度，時間設(shè)為0、2、4、6、8、10、14、22 d，其他條件同1.3.4。

1.4 正交試驗

為了獲得發(fā)酵茶渣的優(yōu)化組合，以基質(zhì)比例（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）和發(fā)酵時間（D）為影響因素，進行L9（34）正交試驗，設(shè)計依據(jù)為單因素試驗結(jié)果。正交試驗設(shè)計如表1 所示，每個因素設(shè)3 個水平，共9 組，每組3 個重復(fù)，試驗中發(fā)酵pH 自然，料液比為5∶5。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.5 驗證試驗及對比試驗

根據(jù)正交試驗得出的最優(yōu)組合（A1B2C1D2 或A1B2C1D3），進行茶渣發(fā)酵（6 個重復(fù)）。比較最優(yōu)條件下發(fā)酵茶渣和正交試驗表中的各個指標，驗證最優(yōu)組合發(fā)酵茶渣效果優(yōu)于正交試驗各組合發(fā)酵。對比試驗即比較茶渣混合物在最優(yōu)條件下發(fā)酵前后的營養(yǎng)價值。

1.6 指標測定

發(fā)酵產(chǎn)物冷凍干燥，粉碎過0.425 mm 篩。CP 含量測定參照GB/T6432-2018［19］，EE 含量測定參照GB/T6433-2006［20］，還原糖含量采用二硝基水楊酸法測定（DNS 試劑，D7800，Solarbio；按照說明書測定），黃酮含量測定根據(jù)Wang 等［21］的方法，皂苷含量測定參照孫萬里［22］的方法，咖啡因含量測定參照GB/T8312-2013［23］。

1.7 發(fā)酵效果評價

參照Wang 等［21］和Guarda 等［24］的方法，使用綜合評分評估發(fā)酵效果。CP、EE、還原糖、黃酮、皂苷、咖啡因分別占比25%、20%、10%、15%、15%、15%。每個樣品的總分是所有指標的總和。每個指標的平均值為平均分數(shù)，最佳結(jié)果定義為對應(yīng)的最高分，最低結(jié)果定義為0 分，最佳/差結(jié)果與平均結(jié)果設(shè)置中間分（表2）。

表2 評分標準Table 2 Scoring criteria

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。單因素試驗、驗證試驗和對比試驗結(jié)果采用單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan 氏法進行多重比較。正交試驗結(jié)果采用極差分析和一般線性模型進行方差分析。結(jié)果用平均值和均值標準誤表示，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)比例（茶渣∶玉米粉）對發(fā)酵茶渣的影響

由表3 可知，隨著茶渣含量的增加，發(fā)酵茶渣的CP、皂苷、咖啡因含量增加（P<0.05），而還原糖含量則降低（P<0.05）。當(dāng)基質(zhì)比例為9∶1 時，發(fā)酵茶渣的CP 和皂苷含量最高（P<0.05）?；|(zhì)比例對發(fā)酵茶渣的黃酮含量無顯著影響（P>0.05）?；|(zhì)比例為7∶3 的發(fā)酵茶渣綜合評分最高。

表3 基質(zhì)比例（茶渣∶玉米粉）對發(fā)酵茶渣的影響Table 3 Effects of substrate ratio（tea dregs∶cornmeal）on fermented tea dregs（DM basis）

2.2 料液比（基質(zhì)∶水）對發(fā)酵茶渣的影響

由表4 可知，EE 含量隨著基質(zhì)的增加而顯著降低（P<0.05），而還原糖含量則顯著增加（P<0.05）。料液比為4∶6 時，黃酮含量最高，隨后是5∶5、6∶4、3∶7，7∶3 時最低（P<0.05）。料液比為3∶7 的茶渣皂苷含量顯著高于其他比例（15.03%~24.27%，P<0.05）。料液比為7∶3 的茶渣咖啡因含量顯著低于其他比例（10.95%~14.72%，P<0.05）。各組間CP 含量差異不顯著（P>0.05）。料液比為5∶5 的發(fā)酵茶渣綜合評分最高。

表4 料液比（基質(zhì)∶水）對發(fā)酵茶渣的影響Table 4 Effects of solid-liquid ratio（substrate∶water）on fermented tea dregs（DM basis）

2.3 接種量對發(fā)酵茶渣的影響

由表5 可知，不同接種量對發(fā)酵茶渣CP、EE、皂苷和咖啡因含量無顯著影響（P>0.05）。接種量為8%和10%的茶渣還原糖含量顯著高于其他接種量（P<0.05）。接種量為2%、4%、8%的茶渣黃酮含量顯著高于6%和10%的發(fā)酵茶渣（P<0.05）。接種量為8%的發(fā)酵茶渣綜合評分最高。

表5 接種量對發(fā)酵茶渣的影響Table 5 Effects of inoculation amount on fermented tea dregs（DM basis）

2.4 溫度對發(fā)酵茶渣的影響

由表6 可知，當(dāng)溫度為31 ℃時，發(fā)酵茶渣的CP 含量顯著高于25 和28 ℃（P<0.05），31~37 ℃的CP 含量無顯著差異（P>0.05）。25 和31 ℃時，發(fā)酵茶渣還原糖含量顯著高于其他溫度（P<0.05）。25 ℃發(fā)酵茶渣的黃酮含量較其他溫度顯著提高24.81%~46.12%（P<0.05）。34 ℃的皂苷含量最低。31 和34 ℃時，咖啡因含量顯著高于其他溫度（P<0.05）。不同溫度的發(fā)酵茶渣EE 含量差異不顯著（P>0.05）。溫度為31 ℃的發(fā)酵茶渣綜合評分最高。

表6 溫度對發(fā)酵茶渣的影響Table 6 Effects of temperature on fermented tea dregs（DM basis）

2.5 時間對發(fā)酵茶渣的影響

由表7 可知，隨著發(fā)酵時間的增加，CP 和咖啡因含量增加。與未發(fā)酵茶渣相比，發(fā)酵22 d 的茶渣CP 和咖啡因含量分別顯著提高34.15% 和45.60%（P<0.05）。發(fā)酵2 d 的茶渣還原糖含量較未發(fā)酵茶渣顯著增加1039.13%（P<0.05），此后隨著時間增加而顯著減少（P<0.05），但均顯著高于未發(fā)酵茶渣（P<0.05）。發(fā)酵6 d，黃酮含量顯著提高并達到最高值（P<0.05），隨發(fā)酵時間增加而逐漸降低。隨發(fā)酵時間的增加，茶渣皂苷含量逐漸降低。與未發(fā)酵茶渣相比，22 d 的茶渣皂苷含量顯著降低36.22%（P<0.05）。發(fā)酵時間對茶渣粗脂肪含量無顯著影響（P>0.05）。發(fā)酵6 d 的茶渣綜合評分最高。

表7 時間對發(fā)酵茶渣的影響Table 7 Effects of time on fermented tea dregs（DM basis）

2.6 正交試驗極差分析

通過極差分析法，比較表8 中極差（R）大小可知，對CP 含量影響因素大小排序為：發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（D）、基質(zhì)比例（A）、接種量（C）。根據(jù)Ki值的大小判斷最優(yōu)水平，得到各因素對CP 含量的最優(yōu)組合為A1B2C1D3。同理，對EE 含量影響因素大小排序為：A、C、B、D，EE 含量最優(yōu)的組合為A3B1C1D3。還原糖、黃酮、皂苷、咖啡因的最優(yōu)組合分別為A2B2C1D2、A3B1C2D3、A2B2C1D1、A1B1C1D1。根據(jù)綜合得分最優(yōu)組合A1B2C1D3，茶渣發(fā)酵最優(yōu)方案為A1B2C1D3，即基質(zhì)比例為7.0∶2.5，發(fā)酵溫度為31 ℃，接種量為7%，發(fā)酵時間為7 d。

表8 正交試驗極差分析Table 8 Range analysis of orthogonal test

2.7 正交試驗方差分析

由表9 可知，基質(zhì)比例（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（D）顯著影響發(fā)酵茶渣CP 含量，說明因素A、B、D是影響發(fā)酵茶渣CP 含量的主要因素。根據(jù)F值得到，對CP 含量影響因素大小排序為：B、D、A、C。由表10 可知，對因素A分析，A1 的CP 含量顯著高于A2、A3，因此選擇A1。同理，因素B選擇B2，因素D選擇D2、D3。因素A、B、D對CP 含量的最優(yōu)組合為A1B2CiD2 或A1B2CiD3。

表9 正交試驗方差分析Table 9 Analysis of variance of orthogonal test

表10 正交試驗方差分析多重比較Table 10 Multiple comparison analysis of variance of orthogonal test

同理，因素A是影響EE、黃酮含量的主要因素，因素A、B是影響咖啡因含量的主要因素。對EE、黃酮、咖啡因含量的最優(yōu)組合為A3BiCiDi、A2BiCiDi 或A3BiCiDi、A2B2CiDi 或A3B2CiDi。各 因 素 對 還 原糖、皂苷得分無顯著影響。

上述組合中A1、A2、A3、B2、D2、D3 出現(xiàn)次數(shù)最多。根據(jù)成分重要程度，CP 含量最為重要，選擇CP含量最優(yōu)的組合A1B2CiD2 或A1B2CiD3 作為茶渣發(fā)酵最優(yōu)方案。

2.8 驗證試驗

綜合極差分析（A1B2C1D3）和方差分析（A1B2CiD2 或A1B2CiD3）結(jié)果，茶渣發(fā)酵的最優(yōu)組合為A1B2C1D2 或A1B2C1D3。由于分析得到的最優(yōu)組合不在表1 正交試驗設(shè)計之內(nèi)，因此對該組合進行了驗證試驗（表11）。測得發(fā)酵茶渣CP 和黃酮含量高于正交試驗表最高CP 含量（27.06%）和黃酮含量（5.92 g·100 g-1），咖啡因低于正交試驗表最低咖啡因含量（115.38 mg·100 g-1），EE 含量與正交試驗表最高EE 含量（1.53%）接近，還原糖和皂苷含量在正交試驗表的范圍內(nèi)。

由表11 可知，與未發(fā)酵茶渣相比，發(fā)酵茶渣A1B2C1D2 和A1B2C1D3 的CP、還原糖、黃酮、咖啡因含量均顯著提高（P<0.001），皂苷含量顯著降低（P<0.001），EE 含量與未發(fā)酵茶渣無顯著差異（P>0.05）。發(fā)酵茶渣A1B2C1D2 和A1B2C1D3 的營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)含量無顯著差異（P>0.05）。

表11 發(fā)酵茶渣營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)Table 11 Nutrient components and active substance of fermented tea dregs（DM basis）

2.9 發(fā)酵對茶渣游離氨基酸的影響

由表12 可知，與未發(fā)酵茶渣相比，發(fā)酵茶渣（A1B2C1D2、A1B2C1D3）的異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、?；撬?、絲氨酸、磷酸絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、γ-氨基正丁酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、總氨基酸、風(fēng)味氨基酸的含量以及必需氨基酸/總氨基酸、風(fēng)味氨基酸/總氨基酸顯著提高（P<0.05 或P<0.001），氨含量和非必需氨基酸/總氨基酸顯著降低（P<0.05 或P<0.001）。發(fā)酵茶渣（A1B2C1D2、A1B2C1D3）生成了苯丙氨酸、谷氨酰胺、β-丙氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、鳥氨酸。與A1B2C1D2 發(fā)酵茶渣相比，A1B2C1D3 發(fā)酵茶渣的蘇氨酸、?；撬?、絲氨酸、磷酸絲氨酸含量顯著降低（P<0.05 或P<0.001），賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量顯著提高（P<0.05 或P<0.001），兩種發(fā)酵茶渣的其他氨基酸含量差異不顯著（P>0.05）。

表12 發(fā)酵茶渣游離氨基酸Table 12 Free amino acids of fermented tea dregs（DM basis，mg·100 g-1）

3 討論

3.1 基質(zhì)比例對發(fā)酵茶渣的影響

不同的基質(zhì)比例影響著微生物的代謝活動。通過正交試驗得知，基質(zhì)比例是影響發(fā)酵茶渣CP、EE、黃酮、咖啡因含量的主要因素。隨著茶渣含量的增加，發(fā)酵茶渣的CP、皂苷、咖啡因含量增加，而還原糖含量降低。這是符合猜測的，茶渣的CP、皂苷、咖啡因含量較高，當(dāng)茶渣添加比例增加，這些成分的含量也隨之增加。還原糖含量降低主要是由于玉米粉添加比例的降低造成的。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵底物含糖量和生物質(zhì)產(chǎn)量呈正相關(guān)［25］。玉米粉經(jīng)過高溫高壓后，可產(chǎn)生大量還原糖。玉米粉添加量減少，發(fā)酵底物的還原糖含量隨之減少。即玉米粉含量較高的發(fā)酵底物能夠為康寧木霉提供更多的能量，有利于菌體生長。在相同條件下，孢子萌發(fā)生長需要消耗的還原糖含量相似，那么底物固有還原糖含量高，在被微生物消耗后余下的還原糖含量則高。另外，還原糖也來源于纖維素的降解。菌體代謝強，纖維素酶活性高，則產(chǎn)生的還原糖含量高。黃酮存在于茶渣中，在玉米粉中未檢測到。猜測隨著茶渣添加量的增加，黃酮含量應(yīng)當(dāng)提高，單因素試驗結(jié)果表明基質(zhì)比例對發(fā)酵茶渣的黃酮含量無顯著影響。但是正交試驗方差分析表明，基質(zhì)比例是影響黃酮含量的主要因素，7∶3 與7.0∶3.5 的黃酮含量顯著高于7.0∶2.5。這可能與康寧木霉對黃酮的代謝轉(zhuǎn)化有關(guān)，目前缺乏相關(guān)研究。單因素試驗中基質(zhì)比為7∶3 的發(fā)酵茶渣綜合評分最高，即以較少的玉米粉配合茶渣發(fā)酵，生產(chǎn)含量較高的CP 和還原糖以及含量較少的皂苷和咖啡因的發(fā)酵產(chǎn)物。

3.2 料液比對發(fā)酵茶渣的影響

水分對微生物生長、生物合成和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生及分泌具有重大影響［26］。據(jù)報道，在水分增加或減少的情況下，酶的產(chǎn)生會受到不利影響［27］。隨著水分含量的增加，還原糖含量顯著降低，這可能由于高水分導(dǎo)致纖維素酶產(chǎn)生減少，對纖維素降解能力減弱，導(dǎo)致還原糖的減少。另外，水分含量高會改變底物顆粒的結(jié)構(gòu)，減少氣體體積，減緩微生物生長［28］。康寧木霉是好氧菌，發(fā)酵基質(zhì)水分高，則溶氧量較低，菌絲集中生長在發(fā)酵基質(zhì)表面，內(nèi)部菌絲較少或活力較弱，對纖維素降解不足，產(chǎn)生的還原糖含量則較低。料液比為7∶3 時，還原糖含量最高，而EE 含量是最低的，還原糖與EE 趨勢是相反的，這也說明了微生物代謝產(chǎn)生不同代謝物的適合條件是不同的。EE 的成分不是單一的，脂肪、色素、脂溶性物質(zhì)的合成代謝是十分復(fù)雜的，可考慮研究脂肪酸的組成、脂溶性物質(zhì)的含量來探討EE 的變化。結(jié)果表明，低水分有利于皂苷和咖啡因的降解，這可能與菌體生長速度較快和還原糖的大量生成有關(guān)。料液比為5∶5 的發(fā)酵茶渣綜合評分最高，與以往研究一致，即霉菌的生長繁殖所需的水分含量為40%~50%［29］。

3.3 接種量對發(fā)酵茶渣的影響

接種量可能會明顯影響發(fā)酵過程中的微生物生長速率［30］。較高的接種量可能會加快真菌的生長速度，但同時會增加營養(yǎng)物質(zhì)的消耗速度［31］，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡會減緩真菌的生長。接種量較小，延長了發(fā)酵過程所需的時間。在單因素和正交試驗中，不同接種量對發(fā)酵茶渣CP、EE、皂苷和咖啡因含量無顯著影響?？赡苡捎诮臃N量均處于一個較合適的范圍導(dǎo)致本試驗中接種量對這些指標無顯著影響。8 d 的生長，所有培養(yǎng)基中康寧木霉均達到了最大生物量，對茶渣的代謝轉(zhuǎn)化達到最高值。接種量為8%和10%的茶渣還原糖含量顯著高于其他接種量，可能是由于孢子初始數(shù)量較高，加快了康寧木霉的生長和代謝，還原糖是生命活動中末端代謝物，初始階段還原糖生成較多。二者沒有差異主要是孢子數(shù)已達到了能轉(zhuǎn)化利用的最大值，在底物一致的情況下，生長代謝強度不能繼續(xù)增加。結(jié)果表明，接種量為6%和10%的發(fā)酵茶渣黃酮含量較低，暫未能解釋不同接種量對黃酮含量的影響，可能是隨機效應(yīng)。

3.4 溫度對發(fā)酵茶渣的影響

溫度對微生物代謝有重要影響，溫度過高過低均會抑制微生物的生長和代謝。發(fā)酵溫度一般為25~32 ℃，與微生物的生長動力學(xué)密切相關(guān)［32］?？祵幠久沟淖罴焉L溫度是25~30 ℃，但是康寧木霉對外界條件的適應(yīng)性相對較廣，生長溫度范圍較廣［33］。不同溫度對真菌代謝物的生成或轉(zhuǎn)化有重要影響，與最佳生長溫度不一定一致。發(fā)酵溫度為25~31 ℃時，CP 產(chǎn)量顯著增加。正交試驗中，發(fā)酵溫度是影響發(fā)酵茶渣CP 含量的主要因素，31 ℃的CP 含量顯著高于29、33 ℃的。這些結(jié)果表明，康寧木霉在31 ℃下能夠提高茶渣CP 含量。康寧木霉發(fā)酵茶渣在25 和31 ℃能產(chǎn)生較高含量的還原糖。還原糖的含量是還原糖的產(chǎn)生和消耗的差值，除了纖維素的降解外，菌體生長旺盛也會產(chǎn)生和消耗還原糖［34］。在25 ℃，菌體生長慢，消耗的還原糖較產(chǎn)生的少，則還原糖含量高。31 ℃菌體生長快，產(chǎn)生和消化還原糖均較多，有可能其差值與25 ℃的還原糖含量一致，具體機制需要更深入的研究才能解釋。25 ℃的黃酮含量最高，表明康寧木霉在較低溫度時累積黃酮。也有可能是，在較高的溫度條件下，菌體代謝加快，對茶渣黃酮的利用加強，黃酮被消耗，因此其他溫度的黃酮含量較低。這需要更多的研究來驗證這些猜測?？祵幠久乖?4 ℃降解皂苷的效果最佳，可能是降解皂苷的酶系在34 ℃時活力最高。咖啡因含量在31 和34 ℃時含量較高，說明康寧木霉在31~34 ℃時適合累積咖啡因。正交試驗表明，發(fā)酵溫度是影響發(fā)酵茶渣咖啡因含量的主要因素，31 ℃時咖啡因含量顯著高于29 ℃?？Х纫蚬I(yè)可考慮通過優(yōu)化條件對茶渣資源再利用生產(chǎn)咖啡因。溫度過高或過低對康寧木霉的生命活動或產(chǎn)生一定的脅迫作用，對營養(yǎng)成分、功能成分的累積、合成效率有不同的效果。

3.5 時間對發(fā)酵茶渣的影響

發(fā)酵時間是影響茶渣營養(yǎng)價值的因素之一。康寧木霉發(fā)酵茶渣CP 含量隨時間增加而增加，這與朱飛等［35］的研究結(jié)果一致，黑曲霉發(fā)酵茶渣CP 含量隨時間的延長而提高。這可能是由于茶渣中菌體蛋白的不斷累積所致。EE 不受發(fā)酵時間影響，可能是康寧木霉對茶渣中的EE 利用較少，也有可能是康寧木霉代謝與合成的EE 成分相互抵消，如康寧木霉的綠色孢子，色素可溶于乙醚。還原糖是許多生物過程和酶反應(yīng)的最終產(chǎn)物，真菌代謝產(chǎn)生的纖維素酶可以催化纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖［36-37］。還原糖在第2 天達到最高值，與以往研究一致［34］。這是康寧木霉進入快速增長期，菌體生長迅速，代謝活性高的表現(xiàn)。菌體生長分泌各種淀粉酶、糖化酶將淀粉分解為低分子的還原糖，則還原糖含量提高。雖然，還原糖含量隨時間延長較第2 天下降，但依然高于未發(fā)酵的茶渣。這與綠色木霉發(fā)酵甘草（Glycyrrhiza uralensis）藥渣的還原糖含量先升后降的情況一致［38］。這說明，真菌發(fā)酵茶渣能產(chǎn)生大量的還原糖，為菌體的生長提供營養(yǎng)的同時，還改善了發(fā)酵茶渣的風(fēng)味。黃酮含量在第6 天最高，此后下降。這說明菌體對黃酮的轉(zhuǎn)化達最高值，隨著康寧木霉的生長，黃酮又被吸收代謝。有研究表明，黑曲霉和綠色木霉發(fā)酵降低了桑葉茶黃酮含量［39］。隨時間延遲，康寧木霉對黃酮的消耗高于產(chǎn)生速度，表現(xiàn)為發(fā)酵6 d 后，隨時間延遲，黃酮含量降低。黃酮具有很強的抗氧化能力，這是改善動物腸道和免疫功能的主要特性之一［40-41］。微生物代謝降解抗營養(yǎng)因子被認為是最有前途的處理方法。高水平的皂苷會降低動物對營養(yǎng)的吸收，限制茶渣在飼料中的使用［42］。結(jié)果表明，隨著時間的延長，茶渣皂苷含量降低。以往有研究表明，真菌能降解皂苷［43］。但未有文獻表明康寧木霉能降解皂苷，暫不清楚降解機理。咖啡因是茶葉中含量最豐富的生物堿［5］，其含量的提高降低了茶渣對動物的適口性。然而，適量的咖啡因具有抗氧化、抗糖尿病和減肥的作用［44］。結(jié)果表明，發(fā)酵茶渣的咖啡因含量隨時間增加而提高?？Х纫蜃鳛橐环N中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮劑［5］，適量使用發(fā)酵茶渣可以刺激動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進血液循環(huán)。單因素試驗中發(fā)酵6 d 的綜合評分最高，可見茶渣發(fā)酵6 d 即可使用，同時6~10 d的評分接近，說明發(fā)酵茶渣在一定時間保存，營養(yǎng)價值不會降低。正交試驗中，發(fā)酵6 和7 d 的CP 含量差異不顯著，均顯著高于發(fā)酵5 d。在實際生產(chǎn)中，選擇發(fā)酵6 d 能減少生產(chǎn)成本，加快飼料的生產(chǎn)和應(yīng)用。

3.6 發(fā)酵對茶渣營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)的影響

發(fā)酵后的茶渣CP 含量較高，原因可能是康寧木霉利用發(fā)酵基質(zhì)的營養(yǎng)成分來合成菌體蛋白質(zhì)，繼而增加了CP 含量。與以往研究一致，即黑曲霉發(fā)酵能夠提高茶渣的CP 含量［35］。CP 含量的提高，表明了茶渣經(jīng)過微生物發(fā)酵可以作為動物飼料，這有利于推進廢棄物飼料化利用的研究。還原糖含量的提高主要與康寧木霉的代謝有關(guān)，菌體生長產(chǎn)生各種酶將淀粉、纖維素等分解為還原糖［36-37］。還原糖具有甜味，能改善發(fā)酵茶渣的適口性。還原糖作為小分子物質(zhì)，容易被動物消化吸收。還原糖含量的增高主要來源于纖維素的降解，從這個角度來說，發(fā)酵茶渣能被動物較好地消化利用?？祵幠久乖黾恿瞬柙狞S酮含量，與以往研究結(jié)果不一致。黑曲霉和綠色木霉發(fā)酵降低了桑葉茶黃酮含量［39］。這歸因于康寧木霉與黑曲霉、綠色木霉酶系的不同、對營養(yǎng)物質(zhì)代謝途徑的不同。發(fā)酵茶渣黃酮含量提高，有利于增加飼料的抗氧化能力，增強動物氧化應(yīng)激的抵抗力［40-41］。真菌能降解皂苷［43］，本試驗結(jié)果與此一致。皂苷含量的降低，有利于減少抗營養(yǎng)因子對動物生長的負面作用，可改善發(fā)酵茶渣的適口性。EE 含量與未發(fā)酵茶渣無顯著差異，可能是康寧木霉利用與生產(chǎn)EE 達到平衡狀態(tài)。

3.7 發(fā)酵對茶渣游離氨基酸的影響

游離氨基酸在蛋白質(zhì)、脂肪和脂肪酸代謝、機體生長、免疫系統(tǒng)中起重要作用。必需氨基酸的含量與種類能反映出飼料的營養(yǎng)價值［45］。發(fā)酵茶渣中含有8 種必需氨基酸?？祵幠久拱l(fā)酵顯著提高了茶渣各種必需氨基酸和總氨基酸含量，即發(fā)酵有利于改善茶渣的營養(yǎng)價值。康寧木霉合成代謝中分泌多種蛋白酶，分解茶渣混合物中蛋白質(zhì)，產(chǎn)生游離氨基酸。在康寧木霉的生長中，合成了苯丙氨酸、谷氨酰胺、β-丙氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、鳥氨酸（未發(fā)酵茶渣中未檢測到）。經(jīng)過發(fā)酵，茶渣中氨含量顯著降低，可以推測康寧木霉利用茶渣中的氨合成、轉(zhuǎn)化為游離氨基酸或蛋白質(zhì)。游離氨基酸是重要的呈味物質(zhì)［46］。發(fā)酵提高了茶渣的風(fēng)味氨基酸含量和比例，能改善茶渣適口性。牛磺酸具有抗氧化、促生長、免疫調(diào)節(jié)等功能［47］，γ-氨基正丁酸能減輕畜禽熱應(yīng)激［48］。?；撬岷挺?氨基正丁酸含量的提高，增強發(fā)酵茶渣作為動物飼料添加劑的功效。發(fā)酵6 或7 d 的部分氨基酸含量不同，這與發(fā)酵時間有關(guān)。不同時間下，微生物的新陳代謝有所不同，產(chǎn)生的游離氨基酸量則有差異?？傊?，康寧木霉發(fā)酵改善了茶渣的游離氨基酸含量和種類，是一種潛在的有價值的動物飼料。

4 結(jié)論

試驗表明，康寧木霉發(fā)酵茶渣（料液比為5∶5）的最佳條件是：基質(zhì)比例為7.0∶2.5，發(fā)酵溫度為31 ℃，接種量為7%，發(fā)酵時間為6 或7 d。康寧木霉發(fā)酵改善了茶渣的營養(yǎng)成分、活性物質(zhì)以及游離氨基酸含量。