袁玉,馬希珍,宋寧,謝俊霞

(青島大學(xué)腦科學(xué)與疾病研究院,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，據(jù)統(tǒng)計，2016年我國60歲以上人群中PD患病率為1.37%[1]。PD的臨床表現(xiàn)除肌僵直、運動遲緩、靜止性震顫等運動癥狀外，還伴隨有嗅覺障礙、快速眼動睡眠障礙、便秘、抑郁等非運動癥狀。其主要病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變及黑質(zhì)腦區(qū)存在特異性的異常鐵沉積[2-6]。研究表明，75%～90%的PD病人早期嗅覺功能減退，因此嗅覺障礙被認(rèn)為是PD發(fā)病早期的一個重要標(biāo)志[7-10]。鼻腔上皮的嗅覺感知神經(jīng)元能夠檢測環(huán)境中的氣味信息，并通過嗅神經(jīng)傳遞到嗅覺相關(guān)的大腦皮質(zhì)，最終形成嗅覺[11]。嗅覺感知神經(jīng)元容易受到環(huán)境毒素如細(xì)菌、病毒、灰塵、花粉等的影響，繼而引發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致嗅覺系統(tǒng)出現(xiàn)損傷[12]。有研究顯示，C57BL/6小鼠鼻內(nèi)滴注脂多糖(LPS)6周后出現(xiàn)明顯的嗅覺障礙及PD樣行為學(xué)變化；經(jīng)鼻給予α-突觸核蛋白的預(yù)制纖維，獼猴黑質(zhì)和蒼白球腦區(qū)內(nèi)出現(xiàn)明顯鐵沉積[13-14]。但在發(fā)生上述病變之前其他腦區(qū)是否存在鐵沉積尚不清楚。有研究結(jié)果證實，黑質(zhì)到嗅球和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)存在直接的神經(jīng)投射通路[15-16]。本研究旨在探討經(jīng)鼻給LPS對小鼠嗅覺和嗅球及內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)中輕鏈鐵蛋白表達的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑

SPF級雄性C57BL/6小鼠，7周齡，體質(zhì)量為(19±1) g，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)在可自由飲水?dāng)z食、室溫25 ℃、濕度(50±5)%、12 h晝夜循環(huán)光照的SPF級清潔環(huán)境中，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。LPS購于美國Sigma公司；酪氨酸羥化酶(TH)抗體購于美國Millipore公司，輕鏈鐵蛋白抗體購于美國abcam公司，Rabbit Anti-GAPDH和HRP-IgG標(biāo)記的二抗購于中國愛必信公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購于美國Millipore公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物分組與處理

將16只小鼠隨機分為對照組和LPS組，每組8只。LPS組雙側(cè)鼻孔交替給藥(LPS用生理鹽水配制的工作濃度為1 g/L)，每只10 μL；對照組給予等體積的生理鹽水。小鼠異戊烷麻醉后，采用文獻報道的方法進行鼻內(nèi)滴注，隔天1次[17]。給藥時間為3周，3周后立即進行嗅覺檢測。

1.3 嗅覺功能檢測

檢測采用透明的亞克力盒(30 cm×20 cm×20 cm)，盒子中間有可拆卸的透明隔板，隔板底部中間有可供小鼠自由穿梭的拱形通道。將小鼠置于盒子底部通道處，盒子一側(cè)鋪放適量新墊料，另一側(cè)鋪放等量的小鼠籠內(nèi)的舊墊料(籠內(nèi)已生活過3～5 d)。小鼠適應(yīng)1 min后，應(yīng)用Ethvision XT7系統(tǒng)分別采集兩組小鼠自由活動5 min內(nèi)在新墊料中的總逗留時長，若時長存在統(tǒng)計學(xué)差異則反映LPS組有嗅覺障礙；反之，則不存在嗅覺障礙。

1.4 免疫印跡法檢測TH和輕鏈鐵蛋白表達

嗅覺功能檢測結(jié)束后，處死小鼠，取新鮮的嗅球及內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)組織并稱質(zhì)量。按每毫克25 μL的比例向組織樣本中加入RIPA蛋白裂解液，用機器充分研磨后，于冰上靜置30 min充分裂解，以12 000 r/min離心25 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入1/4體積的Loading Buffer后95 ℃金屬浴5 min。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(80 V、40 min，120 V、90 min)，然后應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜上(300 mA、90 min)。用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入TH(1∶3 000)、輕鏈鐵蛋白(1∶1 000)、GAPDH(1∶20 000)一抗于4 ℃搖床孵育過夜；以TBST溶液洗3次，每次10 min；加入山羊抗兔的HRP-IgG二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h；以TBST溶液洗3次，每次10 min；使用ECL發(fā)光液顯影。應(yīng)用Image J軟件進行分析，TH和輕鏈鐵蛋白表達水平以目的蛋白和內(nèi)參照蛋白(GAPDH)的比值表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)鼻給LPS對嗅覺功能的影響

兩組小鼠在新墊料中的總逗留時長的差值為(9.95±15.38)s，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 經(jīng)鼻給LPS對嗅球TH和輕鏈鐵蛋白表達的影響

與對照組相比較，LPS組小鼠嗅球內(nèi)TH蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；輕鏈鐵蛋白表達明顯上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.486，P<0.05)。見圖1和表1。

2.3 經(jīng)鼻給LPS對內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)中輕鏈鐵蛋白表達的影響

與對照組相比，LPS組輕鏈鐵蛋白表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.391，P<0.05)。見圖1和表1。

注：Ferritin-L為輕鏈鐵蛋白。

表1 兩組小鼠嗅球和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)中各蛋白表達水平比較

3 討 論

Braak分級學(xué)說認(rèn)為，PD病理過程始于嗅球并逐漸累及延髓等低位腦干，進而中腦黑質(zhì)等腦區(qū)發(fā)生損傷，出現(xiàn)運動癥狀[18-20]。有研究表明，經(jīng)鼻給予LPS 6周，嗅球中小膠質(zhì)細(xì)胞激活，導(dǎo)致黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損傷，紋狀體內(nèi)多巴胺減少，這一過程與炎癥因子受體介導(dǎo)有關(guān)[13]。本研究探討經(jīng)鼻給予LPS 3周能否引發(fā)嗅覺損傷，結(jié)果顯示，LPS處理后小鼠沒有明顯的嗅覺障礙。這可能是由于LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在3周時不足以引起嗅覺系統(tǒng)損傷。普遍認(rèn)為嗅覺障礙可能與嗅球內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元有關(guān)[17]。PD病人尸檢研究顯示，嗅球內(nèi)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目增多；另有臨床研究顯示，PD病人給予多巴胺制劑，不能改善其嗅覺障礙[7,21]。這兩項研究表明嗅球中的多巴胺能神經(jīng)元似乎與嗅覺障礙并無直接關(guān)系。本研究亦未觀察到嗅球內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)明顯損傷。

在腦內(nèi)神經(jīng)元生長代謝過程中，金屬元素鐵發(fā)揮著重要的生理作用，如參與線粒體中能量產(chǎn)生、合成血紅蛋白參與氧轉(zhuǎn)運、髓鞘形成、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與代謝等。然而，腦內(nèi)過多的鐵能通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基等活性氧，造成氧化應(yīng)激；過多的鐵也可能通過鐵死亡方式誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物積累，造成細(xì)胞死亡[6,22-24]。研究表明，PD病人腦鐵代謝存在異常[25-26]。本文研究結(jié)果顯示，鼻內(nèi)滴注LPS 3周能夠引起嗅球和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)輕鏈鐵蛋白表達上調(diào)，提示嗅球和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)可能存在鐵沉積。有文獻報道，經(jīng)鼻給LPS通過白細(xì)胞介素1β及其受體途徑介導(dǎo)嗅球小膠質(zhì)細(xì)胞激活和α-突觸核蛋白聚集[13]。嗅覺系統(tǒng)具有極其復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，在腦內(nèi)與多個腦區(qū)存在直接或間接的聯(lián)系[27]。聚集形式的α-突觸核蛋白可經(jīng)相互聯(lián)系的神經(jīng)通路從嗅球傳播至黑質(zhì)和紋狀體并造成多巴胺能神經(jīng)元損傷[13]。因此我們推測，LPS誘導(dǎo)的嗅球α-突觸核蛋白聚集體也可能傳播至內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)或其他腦區(qū)，并進一步誘導(dǎo)這些腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活。本實驗室的研究結(jié)果和有關(guān)文獻報道結(jié)果均表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可以促進腦區(qū)鐵沉積的發(fā)生[14,28-34]，但鐵沉積是否能夠引發(fā)神經(jīng)炎癥尚無定論[35]。因此，LPS能夠引起內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)等不同腦區(qū)的鐵含量增加，且可能與LPS導(dǎo)致的α-突觸核蛋白聚集體的傳播和神經(jīng)炎癥有關(guān)。鑒于黑質(zhì)與嗅球和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)存在直接的神經(jīng)投射通路，這兩個腦區(qū)的鐵沉積也可能通過跨腦區(qū)鐵轉(zhuǎn)運導(dǎo)致黑質(zhì)等PD相關(guān)腦區(qū)鐵沉積，但這還需要進一步的實驗研究證實。

綜上所述，經(jīng)鼻給LPS 3周后，小鼠嗅覺功能沒有發(fā)生顯著變化，而且嗅球內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元沒有明顯損傷，嗅球和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)的鐵含量顯著上升。在本研究基礎(chǔ)上，我們將繼續(xù)探討鐵與炎癥是否具有協(xié)同作用，以及經(jīng)鼻給LPS能否引起黑質(zhì)等PD相關(guān)腦區(qū)的鐵含量上升。本文結(jié)果為研究經(jīng)鼻給藥對腦內(nèi)鐵代謝的影響提供了新的實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。