馬白榮 ， 張海森,2 ， 高登科,2 ， 李 超,2 ， 靳亞平,2 ， 陳華濤,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西 楊凌 712100 ； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 陜西 楊凌 712100)

為了適應(yīng)地球晝夜、季節(jié)等外界環(huán)境條件的周期性更替，地球上的生物隨之進(jìn)化出了一系列具有周期性變化規(guī)律的內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制，這種內(nèi)源性的調(diào)控機(jī)制被稱為生物鐘。狹義上的生物鐘指的是晝夜節(jié)律生物鐘(Circadian clock)，它能使生物體的行為活動(dòng)和生理功能表現(xiàn)出以近似24 h為周期的節(jié)律性變化[1]。哺乳動(dòng)物的中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus,SCN)，能夠同步外界光照明暗的周期性變化，將其轉(zhuǎn)換為神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)，協(xié)調(diào)同步肝臟、骨骼肌、腎臟、心臟等組織的外周生物鐘(Peripheral clocks)，以使機(jī)體的內(nèi)源性節(jié)律與外界環(huán)境變化相適應(yīng)[1]。哺乳動(dòng)物分子生物鐘系統(tǒng)主要由腦肌類(lèi)芳烴受體核轉(zhuǎn)位樣蛋白1(Brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1, BMAL1)、晝夜運(yùn)動(dòng)輸出周期(Circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)蛋白、周期(Period,PER)蛋白、隱花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白等生物鐘蛋白形成的轉(zhuǎn)錄-翻譯正負(fù)反饋環(huán)路構(gòu)成，在分子水平與細(xì)胞水平呈現(xiàn)以近似24 h為周期的節(jié)律性振蕩[2]。

隱花色素2(Cryptochrome 2,CRY2)屬于藍(lán)光受體基因家族和光酶解家族成員，是生物鐘正負(fù)反饋環(huán)路中重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子。細(xì)胞質(zhì)中的CRY與另一負(fù)調(diào)控因子PER經(jīng)過(guò)酪蛋白激酶CK1ε/δ的磷酸化修飾后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，抑制正調(diào)控因子BMAL1-CLOCK二聚體對(duì)下游鐘控基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性[2]。此外，CRY2在調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖和代謝穩(wěn)態(tài)方面具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，CRY2通過(guò)抑制c-Myc-BMAL1-MMP2/9通路來(lái)抑制滋養(yǎng)層遷移和侵襲，在胚胎著床過(guò)程中扮演重要角色[3]。小鼠在禁食狀態(tài)下，CRY蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)的節(jié)律性表達(dá)和G蛋白偶聯(lián)受體的活性來(lái)調(diào)節(jié)肝臟糖異生的晝夜節(jié)律性變化[4]。研究表明，CRY2具有棕色脂肪細(xì)胞分化增強(qiáng)劑的作用[5]，同時(shí)在維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面也具有重要意義[6]。

有關(guān)哺乳動(dòng)物生物鐘的研究主要集中于小鼠和大鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物，對(duì)牛羊等反芻動(dòng)物的研究則相對(duì)較少。山羊作為支撐我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，深入探究山羊生物鐘調(diào)控生殖和代謝等過(guò)程的具體機(jī)制對(duì)提高畜牧生產(chǎn)效益至關(guān)重要。然而，山羊生物鐘的分子調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)旨在克隆山羊CRY2基因編碼序列(Coding sequence,CDS)并構(gòu)建其真核表達(dá)載體，利用生物信息學(xué)軟件分析和預(yù)測(cè)CRY2基因及其編碼蛋白的基本理化特性，為后續(xù)探究山羊生物鐘的生物學(xué)功能提供前期基礎(chǔ)和關(guān)鍵材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清和0.25%胰蛋白酶，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；無(wú)內(nèi)毒素小提中量試劑盒和DNA純化回收試劑盒，均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Total RNA提取試劑盒和QuickCutEcoR I，均購(gòu)自日本TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真PCR用DNA聚合酶和SYBRPremixExTaqTMII試劑盒，均購(gòu)自日本ToYoBo公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自美國(guó)HydraGene公司；蛋白提取試劑，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自江蘇凱基生物公司；兔抗CRY2多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；鼠抗β-actin抗體，購(gòu)自中國(guó)三箭公司；HRP共軛羊抗兔抗體，購(gòu)自中國(guó)中杉金橋公司。

1.2 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和核酸蛋白濃度檢測(cè)儀，均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；倒置熒光顯微鏡，購(gòu)自日本Nikon公司；CFX-96型熒光定量PCR儀、普通PCR儀和電泳儀，均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自英國(guó)Syngene公司。

1.3 組織樣本、質(zhì)粒、菌種與細(xì)胞 山羊卵巢組織取自楊凌區(qū)楊沛屠宰場(chǎng)。pcDNA3.1-Puro-N-3HA質(zhì)粒，購(gòu)自美國(guó)Promega公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。人體腎臟細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 山羊卵巢組織總RNA的提取及cDNA的合成 稱取20 mg山羊卵巢組織置于離心管中，加入TRIzol裂解液，采用酚-氯仿抽提法提取總RNA，測(cè)定濃度后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系(10 μL)：模板總RNA 5 μL，5×RT Master Mix 2 μL，去離子水3 μL。反應(yīng)程序：37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。將獲得的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊CRY2基因(XM_018059193.1)的CDS區(qū)信息，使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)完成后添加同源臂(小寫(xiě)字母)，即在CRY2的上下游PCR擴(kuò)增引物的5′端分別加上與pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)的同源序列(下劃線表示EcoR I酶切位點(diǎn))，Primer F：agcaagctttcta-gagaattcATGGCGGCGGCGGCAGCGGCGA，Primer R：accggatccgatatcgaattcTCAGACGCCCCTGCTCGGCAGT，引物由西安擎科生物科技有限公司合成。

1.4.3 山羊CRY2基因CDS區(qū)的克隆 以卵巢組織的cDNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增帶有同源臂的山羊CRY2基因的CDS區(qū)。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：cDNA模板4 μL(50 ng/μL)、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，預(yù)混液25 μL，添加ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸105 s，循環(huán)35次；72 ℃總延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)符合預(yù)期的條帶進(jìn)行膠回收。

1.4.4 山羊CRY2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 利用限制性內(nèi)切酶EcoR I對(duì)空載體pcDNA3.1-Puro-N-3HA進(jìn)行單酶切，經(jīng)核酸電泳鑒定后，通過(guò)膠回收試劑盒回收線性化載體片段。根據(jù)同源重組試劑盒說(shuō)明書(shū)，按照一定比例將線性化載體片段與帶有同源臂的目的基因片段混合，37 ℃反應(yīng)30 min獲得重組質(zhì)粒。反應(yīng)體系(20 μL)：線性化載體0.88 μL(71.64 ng)，目的基因片段1.36 μL(104.22 ng)，5×Buffer 4 μL，ExnaseⅡ 2 μL，ddH2O 11.76 μL。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)后挑取單克隆菌落，在37 ℃條件下?lián)u菌12 h，使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取重組質(zhì)粒，并對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)公司測(cè)序后將得到的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-3HA-gCRY2。

1.4.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞 復(fù)蘇凍存的HEK293T細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞以密度1×106個(gè)/皿接種到60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)，使用Turbofect轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1-3HA-gCRY2和pcDNA3.1-Puro-N-3HA空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后分別收取細(xì)胞樣品用于RNA和蛋白提取，檢測(cè)山羊CRY2基因在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)變化。

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)山羊CRY2基因在mRNA水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h后，分別提取pcDNA3.1-3HA-gCRY2轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1-Puro-N-3HA轉(zhuǎn)染組HEK293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系并完成上機(jī)檢測(cè)。qPCR反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA 4 μL，PremixExTaqII 10 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸15 s，95.5 ℃變性5 s。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)出能同時(shí)擴(kuò)增山羊和人CRY2基因CDS區(qū)的qPCR引物，以人的GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法對(duì)樣品的Ct值進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列信息Table 1 Primer details

1.4.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot,WB)檢測(cè)山羊CRY2基因在蛋白水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，分別提取pcDNA3.1-3HA-gCRY2轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1-Puro-N-3HA轉(zhuǎn)染組HEK293T細(xì)胞的總蛋白，使用BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定其蛋白濃度，并將其與上樣緩沖液混勻，煮沸10 min進(jìn)行蛋白變性以獲得蛋白上樣樣品。WB的操作步驟：配制10%分離膠與5%濃縮膠，置于電泳槽后拔出梳子，從左到右依次加入蛋白Marker和20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜，10%脫脂奶粉中封閉2 h，TBST溶液洗滌4次，每次5 min；4 ℃過(guò)夜孵育一抗，TBST溶液洗滌4次，每次5 min；室溫下孵育二抗2 h，TBST溶液洗滌4次，每次5 min；將PVDF膜浸泡于配制好的ECL顯色液中，利用G：BOX凝膠成像系統(tǒng)曝光，拍照并記錄結(jié)果。

1.4.8 生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找并下載山羊(Caprahircus)、小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、人類(lèi)(Homosapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes)、綿羊(Ovisaries)、牛(Bostaurus)、馬(Equuscaballus)、雞(Gallusgallus)和斑馬魚(yú)(Daniorerio)CRY2基因的CDS區(qū)，利用DNASTAR軟件分析各物種CRY2基因CDS區(qū)的序列相似性，并應(yīng)用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用ExPASy在線軟件分析山羊CRY2蛋白的分子質(zhì)量、分子式、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)目、半衰期和不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)；利用ProtScale在線軟件預(yù)測(cè)山羊CRY2蛋白氨基酸序列的親疏水性；分別使用SingalP 5.0和TMHMM-2.0在線工具預(yù)測(cè)山羊CRY2蛋白氨基酸序列的信號(hào)肽區(qū)域和跨膜區(qū)域；通過(guò)SOPMA和SWISS-MODEL在線軟件分析預(yù)測(cè)山羊CRY2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，并使用STRING工具分析相互作用蛋白。生物信息學(xué)相關(guān)軟件網(wǎng)址及數(shù)據(jù)庫(kù)見(jiàn)表2。

表2 生物信息學(xué)分析在線軟件Table 2 Online software for bioinformatics analysis

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤方式表示。采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 山羊CRY2基因CDS區(qū)的成功克隆 以山羊卵巢的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得CRY2基因帶有同源臂的CDS區(qū)片段(山羊CRY2基因CDS區(qū)為1 791 bp，上下游引物5′端同源臂42 bp)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)一清晰明亮的條帶，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符(1 833 bp)。

圖1 山羊CRY2基因CDS區(qū)的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of goat CRY2 gene CDS regionM：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：DL5 000 DNA Marker； 1：PCR amplification product

2.2 山羊CRY2基因真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建 使用EcoRⅠ酶對(duì)pcDNA3.1-Puro-N-3HA空載體和pcDNA3.1-3HA-gCRY2重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，并以pcDNA3.1-3HA-gCRY2為模板擴(kuò)增CRY2基因的CDS區(qū)片段，分別將以上獲得的3種產(chǎn)物按順序加樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖2所示，酶切后pcDNA3.1-Puro-N-3HA空載體與pcDNA3.1-3HA-gCRY2重組質(zhì)粒的第1條帶位置相同(5 211 bp)；酶切后pcDNA3.1-3HA-gCRY2的第2條帶與以pcD-NA3.1-3HA-gCRY2為模板擴(kuò)增獲得的目的基因的條帶大小相同(1 791 bp)。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中XM_018059193.1序列信息完全一致。上述結(jié)果表明，pcDNA3.1-3HA-gCRY2真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Results of enzymatic identificationM：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1：pcDNA3.1-Puro-N-3HA酶切產(chǎn)物; 2：pcDNA3.1-3HA-gCRY2酶切產(chǎn)物； 3：PCR產(chǎn)物M：DL15 000 DNA Marker； 1：Restriction enzyme digested product of pcDNA3.1-Puro-N-3HA； 2：Restriction enzyme digested product of pcDNA3.1-3HA-gCRY2； 3：PCR product

2.3 山羊CRY2基因在HEK293T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá) 將空載體和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，分別使用qPCR和WB方法檢測(cè)CRY2基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。與pcDNA3.1-Puro-N-3HA轉(zhuǎn)染組相比，pcDNA3.1-3HA-gCRY2轉(zhuǎn)染組中山羊CRY2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高約600倍(P<0.001)(圖3A)。同時(shí)，WB檢測(cè)到CRY2-3HA融合蛋白在pcDNA3.1-3HA-gCRY2轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)，而在pcDNA3.1-Puro-N-3HA轉(zhuǎn)染組中未檢測(cè)到條帶(圖3B)。

圖3 山羊CRY2基因在mRNA(A)和蛋白(B)水平的表達(dá)變化Fig.3 Relative changes of goat CRY2 gene expression at mRNA and protein levels*** :P<0.001

2.4CRY2基因在不同物種間的序列相似性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 不同物種CRY2基因CDS區(qū)的相似性比對(duì)結(jié)果如圖4A所示，山羊的CDS區(qū)與人類(lèi)、黑猩猩、牛、馬、小鼠和大鼠的相似性分別為90.7%、90.5%、93.4%、92.0%、86.5%和86.5%，與綿羊的相似性高達(dá)99.2%，而與雞和斑馬魚(yú)的相似性分別為77.1%和68.9%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果如圖4B所示，山羊CRY2基因與綿羊、牛、馬的遺傳距離最近，與雞和斑馬魚(yú)的遺傳距離最遠(yuǎn)。

2.5 山羊CRY2蛋白的理化性質(zhì) ExPASy在線工具分析結(jié)果顯示，山羊CRY2蛋白的理論分子量為66 804.33 Da，分子式為C2 999H4 636N844O847S23，由596個(gè)氨基酸組成。各種氨基酸的數(shù)量及其出現(xiàn)的頻率如表3所示，其中出現(xiàn)頻率較高的氨基酸依次為Ala(10.2%)、Leu(9.9%)、Arg(8.4%)和Ser(8.4%)。山羊CRY2蛋白氨基酸序列的理論等電點(diǎn)(pI)為8.90，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為48.87，屬于不穩(wěn)定蛋白。使用ProtScale在線軟件分析氨基酸序列的親疏水性，結(jié)果如圖5所示，山羊CRY2蛋白氨基酸序列大部分位于親水區(qū)域，故推測(cè)該蛋白為親水性蛋白，其中位于序列第522位和第525位的氨基酸疏水性最強(qiáng)，分?jǐn)?shù)均為1.900，位于序列第446位的氨基酸親水性最強(qiáng)，分?jǐn)?shù)為-2.311。

圖4 不同物種間CRY2基因CDS區(qū)序列相似性比對(duì)(A)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(B)Fig.4 Sequence similarity comparison (A) and construction of phylogenetic trees (B) of CRY2 CDS region in different species▲：本試驗(yàn)獲得的山羊CRY2基因▲:Goats CRY2 gene obtained in this study

表3 山羊CRY2蛋白的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of goat CRY2 protein

圖5 山羊CRY2蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of goat CRY2 protein

2.6 山羊CRY2蛋白的信號(hào)肽及跨膜區(qū)域預(yù)測(cè) 利用SingalP 5.0在線軟件預(yù)測(cè)山羊CRY2蛋白的信號(hào)肽區(qū)域，結(jié)果顯示，該蛋白不存在信號(hào)肽。利用TMHMM-2.0在線軟件對(duì)山羊CRY2蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)，山羊CRY2蛋白不存在跨膜區(qū)。

2.7 山羊CRY2蛋白的二/三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SMOPA在線分析軟件對(duì)山羊CRY2蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6A所示，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲，占比分別為38.26%、5.20%、9.90%和46.64%，其中無(wú)規(guī)卷曲占比最多。此外，使用同源建模法(SWISS-MODEL軟件)對(duì)山羊CRY2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇模型質(zhì)量評(píng)估得分最高的模型，結(jié)果如圖6B所示。

圖6 山羊CRY2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of secondary structure (A) and tertiary structure (B) of goat CRY2 protein

2.8 山羊CRY2的互作蛋白預(yù)測(cè) 使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)山羊CRY2的互作蛋白，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖7所示，主要包括ARNTL、PER2、FBXL3、PER1、CLOCK、ENSCHIP00000026821、NR1D1、NPAS2、CSNK1D和BHLHE41。

圖7 山羊CRY2蛋白的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Interactive protein networks of goat CRY2 proteinARNTL：芳香烴受體核轉(zhuǎn)位體樣蛋白； PER2：周期蛋白2； FBXL3：F-box和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白3； PER1：周期蛋白1；CLOCK：晝夜運(yùn)動(dòng)輸出周期蛋白； ENSCHIP00000026821：含蛋白激酶域的蛋白質(zhì)，屬于蛋白激酶超家族；NR1D1：核受體家族1 D組成員1； NPAS2：神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2；CSNK1D：酪蛋白激酶1δ，屬于蛋白激酶超家族；BHLHE41：基本螺旋-環(huán)螺旋家族成員e41ARNTL:Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein;PER2:Period circadian regulator 2; FBXL3:F-box and leucine rich repeat protein 3; PER1:Period circadian regulator 1; CLOCK:Circadian locomotor output cycles kaput; ENSCHIP00000026821:Protein kinase domain-containing protein,belong to the protein kinase superfamily; NR1D1:Nuclear receptor subfamily 1 group D member 1; NPAS2:Neuronal PAS domain protein 2; CSNK1D:Casein kinase 1δ,belongs to the protein kinase superfamily; BHLHE41:Basic helix-loop-helix family member e41

3 討論

生物鐘是地球上的生物為適應(yīng)外界環(huán)境條件的周期性變化所產(chǎn)生的一種內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制，可以接收來(lái)自環(huán)境中的光照、溫度以及進(jìn)食等周期性變化信號(hào)，以協(xié)調(diào)機(jī)體能量代謝、激素分泌、血壓、睡眠等與環(huán)境變化相適應(yīng)[7-8]。哺乳動(dòng)物分子生物鐘由BMAL1、CLOCK、CRY1/2、PER1/2/3、RORs、REV-ERBs等核心生物鐘基因共同構(gòu)成的正反饋回路組成，其中，BMAL1-CLOCK異源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與PERs和CRYs基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box結(jié)合，促進(jìn)PERs和CRYs基因的轉(zhuǎn)錄激活與翻譯；當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的PERs和CRYs蛋白積累到一定程度時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞核后通過(guò)抑制BMAL1-CLOCK異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而抑制其自身的轉(zhuǎn)錄，從而形成一個(gè)負(fù)反饋回路。此外，核受體RORs和REV-ERBs可以結(jié)合到BMAL1啟動(dòng)子區(qū)域的RORE位點(diǎn)，分別激活和抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄[2]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，CRY2等核心生物鐘基因在哺乳動(dòng)物卵巢中呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)，在下丘腦—垂體—性腺軸調(diào)控激素釋放和靶組織敏感性等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[9-10]。在中樞生物鐘SCN中，精氨酸加壓素(Arginine vasopressin)的表達(dá)受BMAL1-CLOCK二聚體調(diào)控，而精氨酸加壓素與雌激素協(xié)同刺激Kisspeption神經(jīng)元，進(jìn)而興奮GnRH神經(jīng)元，從而通過(guò)垂體—門(mén)脈系統(tǒng)調(diào)控黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)和促卵泡激素(Follicular stimulating hormone，F(xiàn)SH)的釋放[11]。在卵巢中，卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞均存在生物鐘基因的表達(dá)。在大鼠卵巢中，生物鐘基因的表達(dá)受卵泡發(fā)育階段影響，發(fā)育早期的卵泡未檢測(cè)到生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)，當(dāng)卵泡發(fā)育到竇狀卵泡后和成熟卵泡時(shí)，其生物鐘基因表達(dá)則會(huì)表現(xiàn)出節(jié)律性變化[12-13]。在發(fā)育到竇狀卵泡期之后的小鼠卵泡中，白天BMAL1和CLOCK的表達(dá)水平較高，夜間PER1、PER2、CRY1和CRY2的表達(dá)水平較高[14]。此外，在人和小鼠的成熟卵泡顆粒細(xì)胞中，StAR、CYP11A1、CYP19A1、HSD3B2等類(lèi)固醇生成基因的表達(dá)都具有晝夜節(jié)律性變化[15-17]。上述研究結(jié)果表明，CRY2等生物鐘基因在嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)的生殖內(nèi)分泌調(diào)控、卵泡發(fā)育和類(lèi)固醇激素合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其調(diào)控牛羊等反芻動(dòng)物生理功能的作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的深入研究。

前期研究發(fā)現(xiàn)，羊卵巢中的BMAL1、CLOCK、CRYs等核心生物鐘基因的表達(dá)具有顯著的晝夜節(jié)律性變化[18]，且持續(xù)黑暗誘導(dǎo)的生物鐘紊亂會(huì)改變母羊和胎羊的促卵泡激素、黃體生成素、孕酮和雌二醇的分泌[19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，山羊CLOCK基因和BMAL1基因在山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有節(jié)律性表達(dá)，并構(gòu)建了山羊CLOCK基因和BMAL1基因的真核表達(dá)載體，隨后通過(guò)BMAL1 siRNA干擾和BMAL1過(guò)表達(dá)等技術(shù)證明了生物鐘基因BMAL1通過(guò)調(diào)節(jié)山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的類(lèi)固醇生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控睪酮的產(chǎn)生[20-21]。然而，目前關(guān)于山羊CRY2的生理功能及其在分子生物鐘的具體作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步探究。本試驗(yàn)利用山羊卵巢組織的cDNA，克隆了CRY2基因的CDS區(qū)，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-3HA-gCRY2真核表達(dá)載體，并在HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證了其表達(dá)。HEK293T細(xì)胞作為一種質(zhì)粒輔助細(xì)胞，可以使帶有SV40啟動(dòng)子的pcDNA3.1質(zhì)粒具有較高的表達(dá)效率[22-23]。本試驗(yàn)將山羊的CRY2基因的CDS區(qū)片段克隆至pcDNA3.1載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)CRY2基因的高效表達(dá)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，山羊CRY2基因CDS區(qū)與人和小鼠相比，具有較高的保守性和同源性，表明山羊CRY2基因可能存在與人和小鼠相似的生理功能。蛋白互作分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，山羊CRY蛋白主要與ARNTL、PER2、FBXL3、PER1和CLOCK等蛋白存在相互作用。而在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，CRYs蛋白和PERs蛋白主要作為抑制因子抑制ARNTL、CLOCK對(duì)一些生物鐘控制基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，F(xiàn)BXL3可以促使CRY2蛋白發(fā)生泛素化并使其降解[24]。由此推測(cè)，在山羊生物鐘的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，CRY2蛋白與其他蛋白之間的互作可能與小鼠類(lèi)似，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探究。

本試驗(yàn)成功克隆了山羊CRY2基因的CDS區(qū)，采用同源重組方法構(gòu)建了pcDNA3.1-3HA-gCRY2真核表達(dá)載體，并在HEK293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)山羊CRY2蛋白的過(guò)表達(dá)，對(duì)山羊CRY2蛋白的基本理化特性進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步探究山羊生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。