陳凌志 ， 黃紫貝 ， 徐康智 ， 李 俊 ， 孫啟亮 ， 王彥紅 ， 劉文博 ，許金俊 ， 潘志明 ， 陶建平 ， 焦庫華 ， 候照峰

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009 ；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 4.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 ， 山東 菏澤 274000)

江蘇省南通市通州區(qū)某養(yǎng)殖戶共飼養(yǎng)200只山羊，3月齡，近5 d內(nèi)發(fā)病，發(fā)病率為15%(30/200)，死亡4只，于2021年5月14日送至揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診，該養(yǎng)殖戶采用圈養(yǎng)結(jié)合放牧的飼養(yǎng)方式，圈舍為臨時(shí)搭建而成，衛(wèi)生條件較差，排泄物清理不及時(shí)，養(yǎng)殖戶曾使用阿苯達(dá)唑伊維菌素驅(qū)蟲，并已注射小反芻獸疫疫苗?；疾∩窖蚱毡槭秤徽?，腹瀉，糞便帶有黏液，氣味略腥臭，并有少數(shù)眼球下陷，近2 d已注射土霉素，未見明顯效果。本試驗(yàn)通過對(duì)腹瀉山羊進(jìn)行解剖檢查、實(shí)驗(yàn)室診斷和病原學(xué)鑒定，確診其為大量結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balantioidescoli)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的混合感染病例，該起病例報(bào)道及其病原學(xué)診斷方法可為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中山羊腹瀉的防控工作提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 產(chǎn)氣莢膜梭菌測定用培養(yǎng)基，16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(TaKaRa公司)，OxoidTMAnaeroGenTM厭氧袋(Thermo scientific公司)等。

1.2 解剖與顯微鏡檢查 對(duì)病死羊只進(jìn)行剖檢，觀察各實(shí)質(zhì)器官病理變化。無菌采集山羊各段腸道黏膜和內(nèi)容物，分別收集至潔凈樣品袋中送至實(shí)驗(yàn)室，用鑷子挑取少量樣品，與蒸餾水混勻涂片，蓋玻片直接壓片后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 細(xì)菌分離 采集肝臟、腎臟、小腸、盲腸等病變組織，無菌接種于綿羊血平板，分別在37 ℃需氧和厭氧條件下培養(yǎng)24 h。隨后，挑取單菌落接種于產(chǎn)氣莢膜梭菌測定用培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，并進(jìn)行2次純化，純化后選取典型菌落觀察生物學(xué)形態(tài)并進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.4 分離菌16S rDNA鑒定 參照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit操作說明書，挑取單個(gè)菌落于200 μL超純水中，100 ℃煮沸10 min，離心取上清5～10 μL作為模板，采用試劑盒提供的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：PCRPremix25 μL，上游和下游引物各0.5 μL，DNA模板50～100 ng，加16S-free H2O至總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50～55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR純化產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.5 分離菌16S rDNA遺傳進(jìn)化分析 將所得序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，分析所得序列與GenBank已公布序列的同源性，選取相同宿主和不同宿主源細(xì)菌16S rDNA序列，運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定所分離細(xì)菌的種屬。

1.6 細(xì)菌毒力分型鑒定 采用多重PCR方法鑒定分離菌毒素分型，參照參考文獻(xiàn)[1]引物信息，由南京金斯瑞生物科技公司合成plc、iap、etx、netB、cpe和cpb共6對(duì)特異性引物，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序比對(duì)，進(jìn)一步確定產(chǎn)氣莢膜梭菌分型。

1.7 藥敏試驗(yàn) 通過Kirby-Bauer(K-B)紙片瓊脂擴(kuò)散法測定山羊分離菌對(duì)常見抗菌藥物的耐藥性[2]，無菌操作將分離菌的純培養(yǎng)物均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 病死山羊剖檢病變 送檢病死山羊，剖檢病變發(fā)現(xiàn)肺臟氣腫、局部出血，肝臟腫大、淤血，膽囊異常腫大，膽汁濃稠，脾臟壞死、出血，腎臟水腫、質(zhì)軟，腸道組織表現(xiàn)出典型的病理變化，如腸管內(nèi)大量水樣稀便、黏膜出血等。

2.2 腸道黏膜與內(nèi)容物顯微鏡檢查 取各段腸道黏膜與內(nèi)容物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室顯微鏡檢查，未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊及線蟲、吸蟲、絳蟲等蟲卵或蟲體節(jié)片等，但在結(jié)腸和盲腸內(nèi)容物中觀察到大量結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體(圖1)。山羊結(jié)腸小袋纖毛滋養(yǎng)體呈梨形或卵圓形，大小約45.85 μm × 112.33 μm，全身附有纖毛，蟲體前端纖毛較長，后端鈍圓、略尖，纖毛擺動(dòng)呈規(guī)律的波浪狀，使身體旋轉(zhuǎn)或向前快速移動(dòng)。

2.3 細(xì)菌分離與純化 取病羊肝臟、腎臟、小腸和盲腸等組織病料，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。在有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，綿羊血平板上未見雙溶血菌落，而厭氧培養(yǎng)24 h后，可見邊緣整齊、光滑濕潤、圓形隆起、透明雙溶血菌落。隨后，于產(chǎn)氣莢膜梭菌測定用培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24 h后，形成典型的黑色菌落形態(tài)，挑取黑色單菌落進(jìn)行2次純化(圖2)，革蘭染色鏡檢，顯示分離菌為直桿狀，兩端鈍緣，單個(gè)或成雙的革蘭陽性菌。

圖2 細(xì)菌分離和純化Fig.2 Bacteria isolation and purification

2.4 分離菌16S rDNA鑒定 采用16S rDNA Bacterial Identication PCR Kit對(duì)分離菌菌落DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后進(jìn)行測序驗(yàn)證。結(jié)果如圖3所示，分離菌菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生1條約500 bp大小的特征條帶。經(jīng)測序驗(yàn)證，成功獲得分離菌16S rDNA序列。

圖3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA M：DL2 000 DNA Marker； P：陽性對(duì)照； 1：分離菌； N：陰性對(duì)照M: DL2 000 DNA Marker; P: Positive control; 1: Isolated strain; N: Negative control

2.5 分離菌16S rDNA遺傳進(jìn)化分析 將所得序列于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，顯示本試驗(yàn)中山羊分離株16S rDNA序列與產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性均在99%以上，因此確定山羊分離株為產(chǎn)氣莢膜梭菌，并命名為NTCPG1。選取分離于不同國家和地區(qū)的豬、雞、鴨、山羊和綿羊來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rDNA基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果如圖4所示，所有分離株共分為2個(gè)大的分支，本試驗(yàn)分離于山羊的產(chǎn)氣莢膜梭菌NTCPG1株與來源于巴基斯坦的山羊分離株(GenBank：MW551947.1)、綿羊分離株(GenBank：MW556208.1)及來源于國內(nèi)的豬源分離株(GenBank：KX094442.1)位列同一分支，且與分離于芬蘭的豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌(GenBank：CP075903.1)親緣關(guān)系最近。

圖4 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA▲：本試驗(yàn)分離的山羊產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株▲：C. perfringens isolated from goat in this study

2.6 毒力基因分型 多重PCR毒力基因分型中plc、iap、etx、netB、cpe基因和cpb基因片段大小分別對(duì)應(yīng)324、461、656、738、233 bp和196 bp，電泳結(jié)果如圖5所示，山羊分離株NTCPG1株僅出現(xiàn)1條324 bp左右目的條帶，初步判定為plc基因，經(jīng)測序驗(yàn)證確為plc基因，因此，山羊分離株NTCPG1株為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖5 毒力基因的PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR amplification of virulence genes M：φX174-HaeⅢ digest DNA Marker； 1～4: 山羊分離株NTCPG1； N：陰性對(duì)照M: φX174-HaeⅢ digest DNA Marker; 1-4: NTCPG1 strain isolated from goat; N: Negative control

2.7 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見表1，山羊NTCPG1分離菌對(duì)氨基糖苷類(妥布霉素、鏈霉素、新霉素、慶大霉素、卡那霉素)，復(fù)方新諾明和氟苯尼考等抗生素耐藥；而對(duì)青霉素類(阿莫西林、美洛西林)，頭孢菌素類(頭孢曲松鈉、頭孢哌酮、頭孢噻肟)，喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)，多西環(huán)素和多黏菌素B等抗生素敏感。

表1 山羊NTCPG1分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of drug susceptibility test for NTCPG1 strain from goat

3 討論

羊傳染性腹瀉是臨床生產(chǎn)中較為常見的消化道疾病，該病由多種病原單獨(dú)或混合感染引起，臨床上常見病原如大腸埃希菌、沙門菌、魏氏梭菌、金黃色葡萄球菌、小反芻獸疫病毒、球蟲、結(jié)腸小袋纖毛蟲、蛔蟲、絳蟲等，均可導(dǎo)致腹瀉癥狀，并造成較高病死率。本試驗(yàn)腹瀉病羊經(jīng)病原學(xué)分析和鑒定，診斷為結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌混合感染，該2種病原均屬人獸共患病原。在以往的臨床生產(chǎn)中，結(jié)腸小袋纖毛蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌單獨(dú)感染的病例已有較多報(bào)道，但二者混合感染的病例分析較為少見。

結(jié)腸小袋纖毛蟲可入侵人或動(dòng)物大腸壁，引起以腹瀉、脫水、消瘦和貧血為特征的腸道原蟲病[3]，該病呈全球性分布[4]，且在國內(nèi)大部分地區(qū)廣泛流行，嚴(yán)重威脅人畜安全[5]。目前，有關(guān)結(jié)腸小袋纖毛蟲的病例分析多見于豬，而羊結(jié)腸小袋纖毛蟲少有報(bào)道[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸小袋纖毛蟲在宿主體內(nèi)繁殖能力極強(qiáng)，動(dòng)物攝入極少量包囊即可能造成嚴(yán)重感染[4]，同時(shí)，該病原對(duì)高溫、陽光、干燥等因素非常敏感，而對(duì)陰濕環(huán)境更為適應(yīng)[7]，因此，該病的發(fā)生多與飼養(yǎng)環(huán)境和衛(wèi)生條件相關(guān)。本病例中病羊飼養(yǎng)場地為臨時(shí)搭建而成，平時(shí)衛(wèi)生條件較差，排泄物清理不及時(shí)等，為結(jié)腸小袋纖毛蟲的感染創(chuàng)造了有利條件。

產(chǎn)氣莢膜梭菌多存在于食物、污水、土壤及人、畜腸道中，能引起人類和畜禽的多種腸道疾病，同時(shí)也是畜禽壞疽性皮炎、腸毒血癥和壞死性腸炎的主要病原[8]。目前已經(jīng)證實(shí)產(chǎn)氣莢膜梭菌至少存在19種以上毒素，其中最主要為α、β、?、毒素[9]，并依此分為A、B、C、D和E共5個(gè)毒素型[10-11]。盡管不同毒素的致病機(jī)制有所區(qū)別，但其致病性均很強(qiáng)[12]，研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起羔羊痢疾、腸毒血癥、羊猝狙等疫病[13]，感染羊只表現(xiàn)為發(fā)病急、病程短、死亡率高[14]，尤其可引起膘情較好的羊急性死亡[15]，這與本試驗(yàn)病例的發(fā)病特點(diǎn)一致。目前，羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌主要有A、B、C、D型，來源于國內(nèi)不同地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，A型羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌感染率最高，是肉羊體內(nèi)的主要流行菌株[12,16]，該型菌株可導(dǎo)致羊腸毒血癥[16]，病羊表現(xiàn)為多器官組織壞死、水腫或充血、出血等病變[17]，與本試驗(yàn)NTCPG1株感染引起的病理變化相符。另外，本試驗(yàn)遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，來源于不同國家不同宿主的產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rDNA序列同源性均較高，且NTCPG1株與豬源和羊源分離株親緣關(guān)系較近，提示該菌存在跨地區(qū)跨物種的傳播特性。本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山羊NTCPG1分離菌主要對(duì)氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)為多重耐藥，這與分離自北京和山西等地的產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥表型一致[18]，而與分離于陜西、青海、寧夏三地區(qū)呈磺胺類耐藥表型的特點(diǎn)不盡一致[12]。盡管不同地區(qū)間存在差異，但以上結(jié)果均表明，山羊產(chǎn)氣莢膜梭菌的多重耐藥愈發(fā)嚴(yán)重，提示臨床上應(yīng)規(guī)范使用抗生素，并可合理的聯(lián)合或交叉使用敏感藥物進(jìn)行預(yù)防治療。

以往羊腹瀉病例分析多為病原單獨(dú)感染或多種細(xì)菌混合感染[19]，鮮有寄生蟲與其他病原混合感染的病例報(bào)道，這在一定程度上表明寄生蟲在臨床生產(chǎn)中的重要性和危害性未能引起足夠重視。在實(shí)際臨床生產(chǎn)中，結(jié)腸小袋纖毛蟲感染非常普遍，主要以慢性感染或無癥狀感染為主，僅少數(shù)導(dǎo)致急性腹瀉[20]，但與其他病原混合感染時(shí)，可加速破壞腸道黏膜的免疫系統(tǒng)，造成宿主發(fā)病率和死亡率上升，并增加了治療難度[4]。本試驗(yàn)中山羊病例在腹瀉初期，曾采用抗生素注射治療，但未見明顯效果，在隨后的治療措施中，建議養(yǎng)殖場采用地美硝唑與環(huán)丙沙星聯(lián)合用藥，并加強(qiáng)圈舍清理和消毒，治療后病羊腹瀉情況得到明顯改善，表明結(jié)腸小袋纖毛蟲在該病的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要作用。