梁 圓 ， 張丹丹 ， 程 景 ， 李 博 ， 靳 光 ， 王棟才 ， 張?jiān)獞c

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 山西 太原 030031 ； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 山西 太原 030032)

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是一種腸道常見菌，可引起犢牛腹瀉、出血性腸炎等癥狀。目前抗生素仍是治療大腸桿菌感染的重要手段，但隨著養(yǎng)牛業(yè)規(guī)?；潭妊杆偬岣撸瑺倥８篂a的發(fā)病率逐年上升，大量抗菌藥物的不合理使用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性問題頻發(fā)，交叉耐藥和多重耐藥也愈發(fā)嚴(yán)重，臨床治療難度加大，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。細(xì)菌為了更好的適應(yīng)外部環(huán)境，可通過多種途徑將抗菌藥物對(duì)自身的影響最小化，其中對(duì)可移動(dòng)基因元件(轉(zhuǎn)座子、整合子、整合與接合元件)的研究越來越受青睞，整合子是一種存在于細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子上的可移動(dòng)基因元件，是耐藥基因水平傳播的重要媒介，它可以通過位點(diǎn)特異性重組整合耐藥基因盒，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[3-5]。

本研究采集晉北地區(qū)規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛肛拭子分離鑒定大腸桿菌，開展藥物敏感性、耐藥基因和整合子-基因盒的檢測(cè)，探究耐藥表型與所攜帶耐藥基因和整合子的相關(guān)性，為養(yǎng)殖場(chǎng)合理用藥和牛源大腸桿菌耐藥機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源和主要試劑 2020年從晉北忻州、朔州和大同市3個(gè)養(yǎng)牛場(chǎng)無菌收集腹瀉犢牛肛門拭子27份。伊紅美藍(lán)瓊脂、麥康凱瓊脂和Luria-Bertani(LB)肉湯，均購自金克隆生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、2×TaqPCR Mix、DNA Marker等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 細(xì)菌分離及PCR鑒定 在放有肛門拭子的2 mL離心管中加入1.5 mL LB肉湯，于37 ℃培養(yǎng)4 h后，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取粉紅色單菌落接種于1 mL LB肉湯中，37 ℃培養(yǎng)3 h后劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取帶金屬光澤的紫黑色單菌落接種于LB肉湯增殖培養(yǎng)。

從GenBank下載大腸桿菌16S rRNA基因序列(OK148132.1)，利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物(F：5′-ACGCGAAGAACCTTACCTGG-3′/R：5′-CTCCAATCCGGACTACGACG-3′)，以分離株培養(yǎng)液提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，隨機(jī)選擇5份PCR產(chǎn)物測(cè)序。

1.3 分離株耐藥表型檢測(cè) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)推薦的紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)定分離株對(duì)6類15種抗菌藥物的敏感性。

1.4 分離株耐藥基因檢測(cè) 從GenBank下載大腸桿菌耐藥基因序列(6類15種)，包括β-內(nèi)酰胺類：blaTEM、blaCTX-M-1；氨基糖苷類：aadA1、strA；磺胺類：sul1、sul2；喹諾酮類：GyrA、GyrB、ParC；氯霉素類：cat、FloR、cmlA；四環(huán)素類：tetA、tetB、tetM，利用Primer-BLAST在線設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。以分離株基因組DNA為模板，采用PCR檢測(cè)上述各類耐藥基因。

1.5 分離株整合子-基因盒檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)[6]合成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的整合酶(Integrase,intI)基因引物及耐藥基因盒結(jié)構(gòu)的引物。以基因組DNA為模板，檢測(cè)分離株整合子的攜帶情況，對(duì)攜帶整合子的菌株P(guān)CR擴(kuò)增可變區(qū)，產(chǎn)物測(cè)序后結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)，以分析可變區(qū)基因盒結(jié)構(gòu)和3′保守區(qū)域。

1.6 耐藥表型與耐藥基因、整合子-基因盒的相關(guān)性分析 以在耐藥基因陽性菌株中表型耐藥菌株的占比計(jì)算耐藥基因與耐藥表型的符合率；利用SPSS 17軟件采用Fisher確切概率法分析整合子與耐藥表型的相關(guān)性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及PCR鑒定 將采集的犢牛肛拭子培養(yǎng)液劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，長(zhǎng)出粉紅色菌落；接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，長(zhǎng)出帶綠色金屬光澤的紫黑色菌落，再通過16S rDNA菌種鑒定，最后得到牛源大腸桿菌24株。

2.2 分離株耐藥表型檢測(cè) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，24株牛源大腸桿菌對(duì)6類15種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥性最高，頭孢噻肟、頭孢唑林和氨芐西林耐藥菌株占95.83%(23/24)；對(duì)喹諾酮類抗菌藥耐藥性最低，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氧氟沙星耐藥菌株占比分別為16.67%(4/24)、16.67%(4/24)、12.50%(3/24)；對(duì)氨基糖苷類、四環(huán)素類和氯霉素類抗菌藥耐藥的菌株占比在16.67%～70.83%，其中對(duì)氨基糖苷類抗菌藥耐藥水平跨度較大，慶大霉素耐藥菌株占62.50%(15/24)，而對(duì)阿米卡星較敏感，耐藥菌株占比為16.67%(4/24)。

圖1 24株大腸桿菌對(duì)15種抗菌藥物的耐藥情況Fig. 1 Resistance of 24 strains of E.coli to 15 kinds of antibacterial drugsCTX：頭孢噻肟; CZ：頭孢唑林; AMP：氨芐西林; SM：鏈霉素; KM：卡那霉素; CN：慶大霉素; AK：阿米卡星; TMP：甲氧芐啶; SXT：復(fù)方新諾明; NOR：諾氟沙星; CIP：環(huán)丙沙星; OFX：氧氟沙星; TET：四環(huán)素; DO：多西環(huán)素; C：氯霉素； 下同CTX：Cefotaxime; CZ：Cephazolin; AMP：Ampicillin; SM：Streptomycin; KM：Kanamycin; CN：Gentamicin; AK：Amikacin; TMP：Trimethoprim; SXT：Compound sulfamethoxazole; NOR：Norfloxacin; CIP：Ciprofloxacin; OFX：Ofloxacin; TET：Tetracycline; DO：Doxycycline； C：Chloramphenicol. The same as below

表1 耐藥基因引物Table 1 Primers for resistance genes

24株牛源大腸桿菌中，對(duì)3類及3類以上抗菌藥物耐藥的多重耐藥菌占70.83%(17/24)，對(duì)所測(cè)試抗菌藥物全部敏感的菌株占4.17%(1/24)，有3株菌對(duì)14種抗菌藥物都耐藥。多重耐藥集中分布在4～6重，4重耐藥占比最高，為33.33%(8/24)，多重耐藥譜型共有14種，以CTX+CZ+AMP+TMP+SXT+SM+TET+CN占比最高，為12.50%(3/24)(表2)。

表2 大腸桿菌分離株的多重耐藥譜型Table 2 Type of multi-drug resistance of E.coli isolates

2.3 分離株耐藥基因檢測(cè) 采用PCR檢測(cè)24株大腸桿菌對(duì)6類15種耐藥基因的攜帶情況，結(jié)果如圖2所示，6類耐藥基因均有檢出，共檢測(cè)到13種耐藥基因，檢出率分別為：β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM(79.17%)、blaCTX-M-1(79.17%)；氨基糖苷類aadA1(8.33%)、strA(75.00%)；磺胺類sul1(62.50%)、sul2(70.83%)；喹諾酮類GyrA(95.83%)、GyrB(100%)、ParC(83.33%)；氯霉素類cat(4.17%)、FloR(37.50%)；四環(huán)素類tetA(66.67%)、tetB(8.33%)，沒有檢測(cè)到tetM和cmlA耐藥基因。

圖2 大腸桿菌耐藥基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of E.coli resistance genesM：DL600 Marker； 1～13：blaCTX-M-1、blaTEM、strA、aadA1、sul1、sul2、GyrA、GyrB、ParC、tetA、tetB、cat、FloR

2.4 分離株整合子-基因盒檢測(cè) 24株大腸桿菌中，檢出有19株攜帶Ⅰ類整合子(圖3A)，檢出率為79.17%(19/24)，未檢出Ⅱ、Ⅲ類整合子。

圖3 Ⅰ類整合子-基因盒的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of class I integron-gene cassetteA:整合酶基因的PCR擴(kuò)增(M：DL600 Marker； 1：Ⅰ類整合酶陽性株)； B:可變區(qū)基因盒的PCR擴(kuò)增(M：DL2 000 Marker； 1～9：Ⅰ類整合酶陽性菌株可變區(qū))A:PCR amplification of integrase gene(M:DL600 Marker; 1:intI1-positive isolates); B:PCR amplification of gene cassette in variable region(M:DL2 000 Marker; 1-9:Variable region of intI1-positive isolates)

對(duì)19株Ⅰ類整合子陽性菌株進(jìn)行可變區(qū)PCR擴(kuò)增，共有9株分離菌擴(kuò)增出可變區(qū)片段(圖3B)，將PCR產(chǎn)物測(cè)序后比對(duì)分析，結(jié)果顯示，共有3種不同的基因盒排列，其中有5株分離菌基因盒結(jié)構(gòu)為dfrA17-aadA5，有3株分離菌為單基因基因盒(dfrA7)，有1株分離菌同時(shí)含有2種基因盒(dfrA1-aadA1和dfrA7)；對(duì)3′保守區(qū)域序列分析，顯示9株分離菌均為典型結(jié)構(gòu)qacEΔ1+sul1。

2.5 分離株耐藥基因與耐藥表型的相關(guān)性分析 計(jì)算耐藥基因與耐藥表型的符合率，結(jié)果顯示，7個(gè)耐藥基因(β-內(nèi)酰胺類：blaTEM、blaCTX-M-1；磺胺類：sul1、sul2；四環(huán)素類：tetA、tetB；氯霉素類：cat)與耐藥表型符合率為100%，耐藥基因FloR和strA與耐藥表型符合率分別為77.78%和50.00%，而喹諾酮類耐藥基因(GyrA、GyrB、ParC)與耐藥表型符合率都較低，分別為15.00%、14.28%、11.76%。

2.6 分離株多重耐藥表型與整合子-基因盒的相關(guān)性分析 采用Fisher確切概率法對(duì)24株大腸桿菌按多重耐藥菌株數(shù)與整合子陽性菌株數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，整合子陽性菌株的多重耐藥發(fā)生率極顯著高于整合子陰性菌株(P<0.01)。

表3 Ⅰ類整合子和大腸桿菌多重耐藥性相關(guān)性分析Table 3 Correlation of class I integrons and multi-drug resistance in E.coli

分離株攜帶5種不同的基因盒，賦予了對(duì)氨基糖苷類(aadA1、aadA5)和甲氧芐啶(dfrA1、dfrA7、dfrA17)的耐藥性，分析分離株的基因盒排列類型與對(duì)應(yīng)的耐藥表型，發(fā)現(xiàn)攜帶相同基因盒排列的菌株在耐藥表型組合上有較大差異；但基因盒陽性菌株表型上對(duì)氨基糖苷類和磺胺類的某種藥物耐藥時(shí)，菌株一定攜帶著與表型相對(duì)應(yīng)的基因盒。

3 討論

細(xì)菌耐藥性已成為世界突出的公共衛(wèi)生問題，尤其養(yǎng)殖業(yè)中存在不合理使用抗生素，甚至將其作為促生長(zhǎng)劑使用的現(xiàn)象，大大加快了耐藥性的出現(xiàn)，目前很多研究已證實(shí)大腸桿菌耐藥性正逐年升高[7]。本研究檢測(cè)分離的24株大腸桿菌對(duì)臨床常用的6大類15種抗菌藥的敏感性，發(fā)現(xiàn)分離株耐藥情況嚴(yán)重，對(duì)氨芐西林、頭孢噻肟等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥率在95%以上，對(duì)復(fù)方新諾明和四環(huán)素的耐藥率也在70%以上，可能與養(yǎng)殖場(chǎng)頻繁使用此類藥物治療各種細(xì)菌病有關(guān)。值得注意的是，同屬氨基糖苷類的慶大霉素(62.50%)和阿米卡星(16.67%)耐藥率相差近4倍，這可能與養(yǎng)殖場(chǎng)長(zhǎng)期使用單一抗菌藥有關(guān)。大腸桿菌分離株的多重耐藥情況也很嚴(yán)重，多重耐藥菌株占比70.83%，其中3株分離菌對(duì)14種藥物都表現(xiàn)為耐藥。高?；鄣萚8]分離的牛源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑林和四環(huán)素耐藥率超過90%，對(duì)環(huán)丙沙星和諾氟沙星的耐藥率超過60%，多重耐藥菌株占比達(dá)85.33%；劉勃興等[9]分離的牛源大腸桿菌對(duì)磺胺類抗菌藥高度耐藥，對(duì)β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類抗菌藥的耐藥率在30%以下，對(duì)10種及以上抗菌藥耐藥的菌株占比34%。與本研究結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn)各地區(qū)大腸桿菌多重耐藥問題均很嚴(yán)重，但不同地區(qū)大腸桿菌對(duì)各類抗菌藥物的敏感性有較大差異。

本研究檢測(cè)分離株對(duì)6大類抗菌藥所對(duì)應(yīng)的各類耐藥基因的攜帶情況，發(fā)現(xiàn)除tetM和cmlA耐藥基因外，其余耐藥基因均可檢出，喹諾酮類耐藥基因檢出率最高，β-內(nèi)酰胺類次之，氯霉素類最低。耐藥基因GyrB檢出率達(dá)100%，是喹諾酮類耐藥基因中最流行的基因型，磺胺類耐藥基因sul1、sul2檢出率超過62%，與吳同壘等[10]分離的牛源大腸桿菌中耐藥基因GyrB(100%)、sul1(66.7%)的檢出率非常接近。耐藥基因blaTEM檢出率為79.17%，與吳少鵬等[11]在牛糞中分離的大腸桿菌耐藥基因blaTEM(59.1%)檢出結(jié)果相似，均為β-內(nèi)酰胺類耐藥基因中占優(yōu)勢(shì)的基因型。氯霉素類耐藥基因FloR的檢出率為37.5%，是白慧麗等[12]分離的大腸桿菌中耐藥基因FloR(76.92%)檢出率的1/2，可能與后者所采樣的養(yǎng)牛場(chǎng)長(zhǎng)期使用氟苯尼考有關(guān)。進(jìn)一步分析耐藥基因與耐藥表型的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和四環(huán)素類耐藥基因與耐藥表型的符合率都為100%，而喹諾酮類耐藥基因與耐藥表型的符合率最高為15%，表明除喹諾酮類耐藥基因外，通過對(duì)分離株耐藥基因的檢測(cè)可在一定程度上預(yù)測(cè)菌株的耐藥表型，目前藥敏試驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)菌耐藥表型的有效手段，但檢測(cè)耐藥基因?qū)ρ芯糠蛛x菌株的潛在耐藥性意義重大。

整合子對(duì)細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生有著不可忽視的作用，近年來對(duì)整合子的研究越來越多，其中對(duì)Ⅰ類整合子的研究最多，Ⅱ、Ⅲ類較少。本研究檢測(cè)分離株中三類整合子的攜帶情況，發(fā)現(xiàn)79.17%大腸桿菌攜帶Ⅰ類整合子，沒有檢出Ⅱ、Ⅲ類整合子。與Yang等[13]分離的牦牛源大腸桿菌中Ⅰ、Ⅱ類整合子檢出率(66%、6%)及陳朝喜等[14]分離的大腸桿菌中Ⅰ、Ⅱ類整合子檢出率(30.50%、18.13%)相比，發(fā)現(xiàn)本研究中大腸桿菌Ⅰ類整合子攜帶率更高，同時(shí)說明Ⅰ類整合子相比于Ⅱ類整合子更流行。測(cè)序分析攜帶Ⅰ類整合子的19株分離菌的可變區(qū)，發(fā)現(xiàn)有9株分離菌攜帶耐藥基因盒，有3種不同的基因盒排列類型，其中基因盒排列dfrA17-aadA5最為流行，這與李曉娜等[15]和苑曉萌等[16]對(duì)大腸桿菌Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相同。對(duì)分離株攜帶的Ⅰ類整合子和多重耐藥表型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)整合子陽性株的多重耐藥發(fā)生率較整合子陰性株更高，與李曉娜等[15]和王海生等[17]的研究結(jié)果一致，提示Ⅰ類整合子的存在增強(qiáng)了大腸桿菌的多重耐藥性。

本研究為晉北地區(qū)養(yǎng)牛場(chǎng)治療大腸桿菌感染提供了用藥參考，為進(jìn)一步研究牛源大腸桿菌耐藥性水平傳播機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。