莊科勤 ， 董文龍 ， 沙萬(wàn)里 ， 徐菁岐 ， 盧殿杰 ， 孟雨晴 ， 高學(xué)勇 ， 付連軍

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林 吉林 132109 ； 2.吉林市豐滿區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 吉林 吉林 132013)

近年來(lái)，關(guān)于莫拉菌在臨床上的致病報(bào)道日益增多，該菌多寄生在人體和哺乳動(dòng)物的呼吸道，為條件性致病菌。當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，多數(shù)莫拉菌可單獨(dú)或與其他細(xì)菌共同引起疾病，尤其是在幼兒及老年中較為常見(jiàn)[1]。與人類疾病密切相關(guān)的莫拉菌中，卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)是兒童呼吸道感染的第3位常見(jiàn)致病菌，并會(huì)引發(fā)敗血癥、腦膜炎、肺炎、自發(fā)性腹膜炎等；腔隙莫拉菌(Moraxellalacunae)可引發(fā)結(jié)膜炎、慢性鼻竇炎、心內(nèi)膜炎等；非液化莫拉菌(Moraxellanonliquefaciens)可引發(fā)角膜炎；奧斯陸莫拉菌(Moraxellaosloensis)和亞特蘭大莫拉菌(Moraxellaatlantae)可導(dǎo)致敗血癥[2-8]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，山羊莫拉菌可與某些致病菌共同作用引起山羊紅眼病[9]。此外，國(guó)外曾有兒童因感染該菌而導(dǎo)致心內(nèi)膜炎發(fā)生的報(bào)道[10]。但就目前的資料來(lái)看，山羊莫拉菌的基本生物學(xué)特性、致病性和耐藥機(jī)制等尚不明確，因此，本試驗(yàn)對(duì)其基本生物學(xué)特性進(jìn)行探究，以期對(duì)將來(lái)的臨床防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 病料和試驗(yàn)動(dòng)物 吉林市某養(yǎng)殖場(chǎng)的患病山羊，表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、流黏性鼻液并伴有輕微咳嗽。昆明系4周齡SPF級(jí)小鼠20只，雌雄各半，體重為18～22 g。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 BHI瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、BHI肉湯培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；LB瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、50×TAE緩沖液，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；PremixTaq(ExTaqversion)，購(gòu)自TaKaRa Bio；微量生化管、藥敏紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；核酸染料、革蘭染色試劑，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；凝膠回收試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。16S rDNA上、下游引物，由庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 把采集的鼻拭子接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。將接種環(huán)徹底灼燒滅菌后，挑取單個(gè)菌落在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，并將其命名為MC-1。

1.4 染色鏡檢 對(duì)載玻片用酒精消毒后，挑取單菌落用無(wú)菌生理鹽水稀釋，在酒精燈外焰加熱固定，按照革蘭染色說(shuō)明書步驟進(jìn)行染色，并于顯微鏡下觀察。

1.5 生化試驗(yàn) 挑取純化培養(yǎng)后的MC-1接種于微量生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，試驗(yàn)過(guò)程參照微量生化管說(shuō)明書。

1.6 16S rDNA序列測(cè)定

1.6.1 基因組DNA的提取 取1.5 mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液，嚴(yán)格按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取基因組DNA。

1.6.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系(25 μL)：PremixTaq酶12.5 μL，去離子水9.5 μL，模板MC-1基因組、上游引物(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL，混合均勻。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6.3 PCR測(cè)序 PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，其切膠純化產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.7 系統(tǒng)進(jìn)化分析 分離菌株MC-1的16S rDNA測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的不同種的細(xì)菌基因核酸進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并參照相關(guān)菌株16S rDNA核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8 藥敏試驗(yàn) 選用獸醫(yī)臨床上常用的14種抗菌藥，采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株MC-1的抑菌圈直徑，分析其藥物敏感性。

1.9 小鼠致病性試驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，每組5只，其中1個(gè)組作為對(duì)照組。取新鮮培養(yǎng)菌液，12 000 r/min離心10 min，棄上清，菌體沉淀用PBS重懸，調(diào)整菌液濃度為1×109CFU/mL。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射重懸菌液0.2 mL/只，對(duì)照組腹腔注射相同劑量的PBS。接種后每隔6 h觀察1次，連續(xù)觀察5～7 d，期間觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)、體表變化和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將菌液接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃需氧培養(yǎng)36 h后進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)該菌菌落較小，呈灰白色，菌落圓潤(rùn)，表面光滑有凸起，見(jiàn)圖1。

圖1 MC-1菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of MC-1

2.2 染色鏡檢 對(duì)挑取的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，在顯微鏡油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌株MC-1為革蘭陰性桿菌，在視野內(nèi)多數(shù)排列緊密，常上下組合在一起，見(jiàn)圖2。

圖2 MC-1革蘭染色 (1 000×)Fig.2 Gram staining of MC-1 (1 000×)

2.3 生化試驗(yàn) 記錄試驗(yàn)結(jié)果并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，MC-1氧化酶陽(yáng)性，符合莫拉菌的性質(zhì)。但MC-1可以發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，這點(diǎn)與其他莫拉菌存在不同，見(jiàn)表1。

表1 MC-1生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of MC-1 biochemical test

2.4 16S rDNA序列測(cè)定 分離菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，其擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500 bp左右，見(jiàn)圖3。序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)BLAST分析，顯示該菌與莫拉菌的同源性為99.7%，證實(shí)分離菌株為莫拉菌。

圖3 分離株16S rDNA的PCR 擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA gene from isolated strain M：DL2 000 DNA Marker； 1、2：MC-1 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M:DL2 000 DNA Marker; 1,2:PCR product of MC-1 16S rDNA

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析 核苷酸測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，與莫拉屬其他種的16S rDNA序列建立進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，該分離菌株與Moraxellacaprae(登錄號(hào)：NZ AUGF0100104.1)親緣關(guān)系極近，再次證明MC-1為山羊莫拉菌，見(jiàn)圖4。

圖4 MC-1與其他莫拉菌16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene from MC-1 and other Morexella strains▲：本試驗(yàn)獲得分離株▲：The isolates obtained in this test

2.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法對(duì)MC-1進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并測(cè)定抑菌圈直徑。分析藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)并參考相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)MC-1對(duì)試驗(yàn)中的14種抗菌藥物均敏感，見(jiàn)表2。

表2 MC-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of MC-1 drug sensitivity test

2.7 小鼠致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組注射菌液約24 h后，部分小鼠出現(xiàn)精神沉郁、毛發(fā)蓬亂、打堆現(xiàn)象；48 h后隨機(jī)選取精神不佳小鼠剖檢，未發(fā)現(xiàn)典型病變癥狀；72 h內(nèi)所有精神不佳小鼠恢復(fù)正常狀態(tài)，試驗(yàn)階段小鼠均未死亡。

3 討論

本試驗(yàn)在采集的山羊鼻拭子樣品中分離得到菌株MC-1，通過(guò)對(duì)其菌落及菌株的形態(tài)特征觀察，并結(jié)合生化試驗(yàn)、16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，鑒定菌株MC-1為山羊莫拉菌。山羊莫拉菌是Kodjo等在健康山羊的鼻腔中分離的類莫拉菌，在進(jìn)行了全基因組DNA-DNA雜交、DNA堿基組成和遺傳轉(zhuǎn)化研究后，將其歸屬于莫拉菌屬[11]。莫拉菌屬為無(wú)動(dòng)力的桿菌或球桿菌，氧化陽(yáng)性酶，對(duì)糖類不發(fā)酵，生化反應(yīng)不活潑。過(guò)去認(rèn)為莫拉菌屬對(duì)人體無(wú)致病力，目前認(rèn)為其對(duì)人體是機(jī)會(huì)致病菌，在機(jī)體防御功能不健全或免疫功能受到嚴(yán)重抑制時(shí)，其可單獨(dú)或與其他細(xì)菌共同感染，引起腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和胸膿等[12]。多篇報(bào)道顯示，絕大多數(shù)莫拉菌對(duì)青霉素敏感，某些菌株對(duì)卡那霉素、青霉素、慶大霉素耐藥[13]。

本試驗(yàn)中山羊莫拉菌菌株MC-1，通過(guò)小鼠致病試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其毒力較弱。從基本生物學(xué)特性來(lái)看，菌株MC-1與同屬的其他莫拉菌存在明顯的差異。生化試驗(yàn)中，傳統(tǒng)莫拉菌對(duì)糖類不發(fā)酵，但本試驗(yàn)獲得的山羊莫拉菌在葡萄糖、蔗糖的檢測(cè)中呈陽(yáng)性。鏡檢結(jié)果顯示，本試驗(yàn)獲得的山羊莫拉菌為桿菌，王江博[14]曾在文章中提到山羊莫拉菌為球菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)獲得的山羊莫拉菌對(duì)阿莫西林、四環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素、阿奇霉素、氯霉素、頭孢曲松、磺胺異噁唑等多種抗菌藥物高度敏感。雖然山羊莫拉菌目前對(duì)多種抗菌藥物敏感，但作為人體和哺乳動(dòng)物呼吸道的常駐菌，在當(dāng)今濫用抗菌藥物導(dǎo)致耐藥菌株不斷增多的嚴(yán)峻形勢(shì)下，不可忽視每一種潛在病原菌在抗菌藥物壓力下產(chǎn)生耐藥性的能力。