葛曉敏 ， 陳宋琴 ， 李才善 ， 鄭會(huì)珍 ， 郭慶勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆 烏魯木齊 830052)

蜱傳病原(Tick-borne pathogens，TBP)是一類(lèi)經(jīng)蜱傳播的病原，其中包括原蟲(chóng)、微生物等。原蟲(chóng)如泰勒蟲(chóng)(Theileria)、巴貝斯蟲(chóng)(Babesia)等；立克次體(Rickettsiales)如無(wú)漿體(Anaplasma)等[1-2]。無(wú)漿體是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性病原體，屬于立克次體目(Rickettsiales)，無(wú)漿體科(Anaplasmataceae)，無(wú)漿體屬(Anaplasma)，其廣泛分布于世界各地，可造成動(dòng)物的無(wú)漿體病。引起該病的主要病原有綿羊無(wú)漿體(Anaplasmaovis,A.ovis)、牛無(wú)漿體(Anaplasmabovis,A.bovis)等[3-5]；這些寄生菌的感染最終可導(dǎo)致溫和型或嚴(yán)重型的無(wú)血紅蛋白癥和血紅蛋白尿癥狀的貧血與黃疸等[6]。泰勒蟲(chóng)是泰勒蟲(chóng)屬(Theileria)專(zhuān)性胞內(nèi)寄生的原生動(dòng)物，在牛上能引起熱帶或地中海泰勒蟲(chóng)病及東海岸熱病等[7]。環(huán)形泰勒蟲(chóng)是主要病原之一，其感染癥狀有發(fā)熱、貧血、羞明流淚、黃疸、淋巴組織增生等[8-9]。

蜱傳病原都嚴(yán)重影響公共安全，危及動(dòng)物福祉和畜主生計(jì)。本試驗(yàn)采集新疆吐魯番、阿勒泰和伊犁州3個(gè)地區(qū)的牛全血樣品(n=356)，利用PCR檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析方法，分別對(duì)3個(gè)地區(qū)的綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)3種病原在當(dāng)?shù)氐母腥厩闆r進(jìn)行了調(diào)查分析，旨在為后續(xù)的相關(guān)疾病流行病學(xué)調(diào)查研究及防控措施的建立提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2018年7月—2021年5月采用牛頸靜脈采血方式，共采集356份牛全血樣品(n=356)，其中，吐魯番地區(qū)155份(n1=155)、阿勒泰地區(qū)110份(n2=110)、伊犁州地區(qū)91份(n3=91)。將采集的牛全血放置于5 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)，標(biāo)記好后存放于4 ℃環(huán)境，備用。

1.1.2 主要試劑 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、pEASY-T1載體，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×EcoTaqPCR Super Mix、DL-2 000 Marker，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自TaKaRa公司；病原檢測(cè)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 電熱恒溫水浴鍋(型號(hào)為DK-600A)，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外凝膠成像儀(型號(hào)為 Gel Doc2000)、PCR儀，均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；臺(tái)式高速離心機(jī)(型號(hào)為RADIAL20)，購(gòu)自西班牙ORTO ALRESA公司；瓊脂糖電泳儀(型號(hào)為 DYCP-31DN)，購(gòu)自北京六一公司。

1.2 方法

1.2.1 牛全血DNA提取 按照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取牛全血基因組DNA，并保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2.2 病原檢測(cè) 通過(guò)DNAMAN和Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)牛的綿羊無(wú)漿體的特異性引物，并參考陳宋琴等[10]設(shè)計(jì)的牛無(wú)漿體和實(shí)驗(yàn)室已建立的環(huán)形泰勒蟲(chóng)的特異性引物，利用PCR方法對(duì)牛綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增引物信息見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)3種病原使用的引物信息Table 1 Primer details used for detection of three pathogens

以提取的牛全血基因組DNA為模板，分別用特異性引物進(jìn)行綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的目的基因片段擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系均為：2×EcoTaqPCR Super Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度根據(jù)表1設(shè)定，退火時(shí)間30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，各取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，20 min后觀察電泳結(jié)果。將篩選出來(lái)的陽(yáng)性樣品剩余的45 μL PCR產(chǎn)物重新進(jìn)行凝膠電泳，步驟同上，之后將陽(yáng)性條帶切下用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析 按照pEASY-T1 Cloning Kit 說(shuō)明書(shū)將回收的目的片段3 μL與1 μL pEASY-T1載體連接，導(dǎo)入至50 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入LB液體培養(yǎng)基，搖勻。搖菌管傾斜放置于搖床內(nèi)200 r /min，37℃培養(yǎng)1 h。離心棄上清液，沉淀混勻涂板，篩選陽(yáng)性單菌落，獲得重組質(zhì)粒，將選取的菌株進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。以提取的重組質(zhì)粒為模板使用相應(yīng)的PCR引物進(jìn)行鑒定，挑選PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序獲取的綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體的16S rRNA和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的Tams1基因序列在DNAMAN上進(jìn)行比對(duì)，然后與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的其他序列通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性比較。通過(guò)MEGA 7.0軟件采用鄰接(Neighbor-joining，NJ)法以統(tǒng)一模型分析并分別計(jì)算以上病原種間的遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果

2.1 3種病原的PCR檢測(cè) 利用表1所示引物序列，以牛全血基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分別出現(xiàn)了牛的綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的目的片段，大小分別為500、351 bp和527 bp，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of A.ovis,A.bovis and T.annulataM:DL-2 000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～7：檢測(cè)樣品； 8：陰性對(duì)照M:DL-2 000 DNA Marker; 1-7:Test samples； 8:Negative control

2.2 單一病原感染情況 對(duì)采集的356份牛全血樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，3種病原在不同地區(qū)單一感染情況見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，3個(gè)地區(qū)中綿羊無(wú)漿體的總感染率為21.9%(78/356)、牛無(wú)漿體總感染率為37.4%(133/356)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)總感染率為41.6%(148/356)；其中，綿羊無(wú)漿體在阿勒泰地區(qū)的感染率最高(29.1%，32/110)，吐魯番地區(qū)的感染率最低(14.8%，23/155)；牛無(wú)漿體在阿勒泰和伊梨州地區(qū)感染率相同，均為41.8%(46/110和38/91); 吐魯番地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染率最高(43.2%，67/155)。運(yùn)用SPSS軟件中的單因素方差分析對(duì)3個(gè)地區(qū)病原單一感染情況進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明，3個(gè)地區(qū)中牛單一感染綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)不存在顯著性差異(P>0.05)。

表2 3種病原單一感染調(diào)查情況Table 2 Investigation of single infection with three pathogens

2.3 3種病原混合感染情況 對(duì)采集的356份樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，混合感染情況見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，74頭牛(20.8%，74/356)感染了2～3種病原(雙重感染，n=63；三重感染，n=11)；最主要的雙重混合感染病原體是牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)(78.4%，58/74)，其次是綿羊無(wú)漿體和牛無(wú)漿體(5.4%，4/74)；同時(shí)，有11頭牛感染了綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)3種蜱傳病原。

表3 3種病原混合感染情況調(diào)查T(mén)able 3 Investigation of mixed infection with three pathogens

2.4 測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析 測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體的16S rRNA和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的Tams1基因與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的其他地區(qū)分離株的同源性分別是98%～100%、96%～99%和95%～98%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果如圖2所示，伊犁州綿羊無(wú)漿體與中國(guó)廣西株(登錄號(hào)：EF587237)和烏干達(dá)株(登錄號(hào)：AF318945)同在一支，阿勒泰地區(qū)綿羊無(wú)漿體與中國(guó)甘肅株(登錄號(hào)：AJ633049)同在一支，吐魯番地區(qū)綿羊無(wú)漿體與中國(guó)浙江株(登錄號(hào)：JN558818)同在一支；此外，伊犁州和阿勒泰地區(qū)的綿羊無(wú)漿體遺傳距離較近，與吐魯番地區(qū)較遠(yuǎn)。

圖2 綿羊無(wú)漿體16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of A.ovis 16S rRNA gene▲：本試驗(yàn)測(cè)定的吐魯番、阿勒泰和伊犁州的A.ovis 16S rRNA基因序列▲：Sequence of A.ovis 16S rRNA gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

阿勒泰與吐魯番地區(qū)的牛無(wú)漿體分別與突尼斯株(登錄號(hào)：KM401903)和中國(guó)陜西株(登錄號(hào)：MN044717)處于同一支，伊犁州牛無(wú)漿體與俄羅斯株(登錄號(hào)：MT036513)屬同一支且親緣關(guān)系近；阿勒泰和吐魯番地區(qū)的無(wú)漿體遺傳距離較近，與伊犁州較遠(yuǎn)，見(jiàn)圖3。

圖3 牛無(wú)漿體16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of A.bovis 16S rRNA gene▲：本試驗(yàn)測(cè)定的吐魯番、阿勒泰和伊犁州的A.bovis 16S rRNA基因序列▲：Sequence of A.bovis 16S rRNA gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

吐魯番和阿勒泰地區(qū)環(huán)形泰勒蟲(chóng)與埃及株(登錄號(hào)：AB917279)在同一支，伊犁州環(huán)形泰勒與印度株(登錄號(hào)：KP235484)屬同一支；阿勒泰和吐魯番地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲(chóng)的遺傳距離較近，與伊犁州較遠(yuǎn)，見(jiàn)圖4。

圖4 環(huán)形泰勒蟲(chóng)Tams1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of T.anuulata Tams1 gene▲：本試驗(yàn)測(cè)定的吐魯番、阿勒泰和伊犁州的T.annulata Tams1基因序列▲：Sequence of T.annulata Tams1 gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

3 討論

新疆位于我國(guó)西北邊陲，占總國(guó)土面積1/6，位于亞歐大陸腹地，與八國(guó)接壤，國(guó)際畜牧貿(mào)易頻繁[1]，畜牧業(yè)是當(dāng)?shù)刂饕?jīng)濟(jì)來(lái)源之一[11]。據(jù)前期文獻(xiàn)報(bào)道，多個(gè)地區(qū)出現(xiàn)牛感染環(huán)形泰勒蟲(chóng)和無(wú)漿體等病原的病例[12]。新疆主要存在的無(wú)漿體病原有牛無(wú)漿體、綿羊無(wú)漿體和嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體等[13]。其中，牛無(wú)漿體和綿羊無(wú)漿體流行最為廣泛。Liu等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，牛無(wú)漿體和綿羊無(wú)漿體的單一病原體感染率分別為16.0%和15.3%，高于嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體感染率(6.1%)[14]。環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染在新疆牛屬動(dòng)物中普遍存在，在全疆14個(gè)地州的感染率高達(dá)20.9%[15]。新疆是該病的高發(fā)地區(qū)之一，據(jù)當(dāng)?shù)匦竽莲F醫(yī)局統(tǒng)計(jì)，2010— 2012年因該病造成的牛只死亡率為24%[16]。

本試驗(yàn)使用PCR方法對(duì)新疆3個(gè)地區(qū)牛的綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綿羊無(wú)漿體在阿勒泰地區(qū)感染率最高(29.1%，32/110)，吐魯番地區(qū)感染率最低(14.8%，23/155)，該結(jié)果與張玉婷等[11]報(bào)道的新疆阿勒泰地區(qū)、巴州地區(qū)的綿羊無(wú)漿體感染率(27%)相近。環(huán)形泰勒蟲(chóng)在吐魯番地區(qū)的感染率最高(43.2%，67/155)，阿勒泰地區(qū)感染率最低(40.0%，44/110)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，吐魯番地區(qū)環(huán)形泰勒蟲(chóng)病的總陽(yáng)性率達(dá)49.5%(413/835)[16]，比本試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果略高。分析其主要原因可能是由于當(dāng)?shù)貧夂驐l件、媒介分布和樣本量的差異等引起。Yang等[17]研究表明，新疆南疆綿羊無(wú)漿體的感染率為55.2%(69/125)。張晶等[18]對(duì)新疆南疆21個(gè)(市、縣)地區(qū)637份羊血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綿羊無(wú)漿體感染率為72.2%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，吐魯番、伊犁州和阿勒泰3個(gè)地區(qū)的牛血液樣品中綿羊無(wú)漿體總感染率為21.9%，均比上述研究結(jié)果低；該結(jié)果表明綿羊無(wú)漿體可能存在跨宿主傳播，且在不同種宿主間的感染率存在差異。

本試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，有74頭牛出現(xiàn)混合感染情況(雙重感染，n=63；三重感染，n=11)，混合感染率最高的是環(huán)形泰勒蟲(chóng)和牛無(wú)漿體。此次檢測(cè)地區(qū)養(yǎng)殖類(lèi)型以散養(yǎng)為主，且大多家畜是混合飼養(yǎng)，這為蜱蟲(chóng)在各個(gè)動(dòng)物間爬行吸血傳播病原提供有利條件[1]，從而增加了家畜混合感染的可能性。用PCR方法針對(duì)牛綿羊無(wú)漿體、牛無(wú)漿體和環(huán)形泰勒蟲(chóng)的16S rRNA和Tams1基因序列擴(kuò)增，并在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，同源一致性結(jié)果分別為98%～100%、96%～99%和95%～98%。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，伊犁州和阿勒泰地區(qū)的綿羊無(wú)漿體親緣關(guān)系較近，與吐魯番地區(qū)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；阿勒泰和吐魯番地區(qū)的牛無(wú)漿體、環(huán)形泰勒蟲(chóng)的親緣關(guān)系較近，與伊犁州地區(qū)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

本試驗(yàn)病原均為蜱傳病原，一般在蜱吸血時(shí)將病原傳播給家畜。有報(bào)道指出滅蜱計(jì)劃在亞熱帶邊緣地區(qū)已取得成功，扇頭蜱分布在美國(guó)南部和阿根廷中部，這些地區(qū)的扇頭蜱和巴貝斯蟲(chóng)病已得以根除，非洲南部的東海岸熱病(由泰勒蟲(chóng)傳播)已被消滅[19]。為了減少家畜被感染的風(fēng)險(xiǎn)，消滅蜱蟲(chóng)起到至關(guān)重要的作用。畜主應(yīng)及時(shí)消滅家畜身上及環(huán)境中的蜱，或在蜱蟲(chóng)多發(fā)季節(jié)前加強(qiáng)對(duì)蜱蟲(chóng)的防控，試圖切斷病原傳播途徑，減少蜱傳疾病的發(fā)生。