張智慧 , 舒相華 ， 李鑫漢 , 羅 高 , 李 鑫 , 龔紹榮 , 羅班乾 ，王余磊 ， 張雅靖 ， 黃 鑫 ， 呂 濤 ， 潘 瓊 ， 張雅倫 ， 宋春蓮

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 云南 昆明 650201 ； 2.昆明偉牧得生物科技有限公司 ， 云南 昆明 650201 ；3.云南省昭通市畜牧局 ， 云南 昭通 657000 ； 4.云南省保山市畜牧工作中心 ， 云南 保山 678000 ；5.云南省永德縣畜牧獸醫(yī)局 ， 云南 永德 677600)

近年來(lái)，云南省養(yǎng)豬業(yè)取得迅速發(fā)展，但制約養(yǎng)殖戶(hù)經(jīng)濟(jì)收入的因素很多，由于飼養(yǎng)密度不合理、防疫制度和隔離措施不規(guī)范等引起的一些常見(jiàn)的急性、烈性傳染病，如豬瘟(Classical swine fever，CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)、豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease，PCVD)、豬流行性腹瀉病 (Porcine epidemic diarrhea,PED)等，目前已成為困擾養(yǎng)豬業(yè)的重大問(wèn)題?；旌细腥驹絹?lái)越多，給綜合防控帶來(lái)困難，也給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。為了解云南省規(guī)模豬場(chǎng)常見(jiàn)疾病的發(fā)病情況，進(jìn)行動(dòng)物疫病防控方案制定、疫苗選擇和免疫程序優(yōu)化、外來(lái)傳染源防控、疫病治療、病原變異監(jiān)控等后續(xù)工作以減少疫病的發(fā)生發(fā)展[2]。本試驗(yàn)對(duì)云南省部分規(guī)模豬場(chǎng)主要疫病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法分別對(duì)抗原和抗體進(jìn)行檢測(cè)，以期為云南省規(guī)模豬場(chǎng)疾病防控提供有效理論依據(jù)及臨床數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理 2017—2020年收集昆明、楚雄、臨滄、保山、宣威、宜良、富源、文山共10個(gè)地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)母豬、種公豬、仔豬和育肥豬的組織和血液樣品共 12 946份，對(duì)其中4 118份樣品進(jìn)行抗原檢測(cè)，8 828份樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)(表1)。將送檢血液樣品分離血清，備用。

表1 2017—2020年7種疾病的抗原和抗體檢測(cè)量Table 1 Detection amount of antigens and antibodies of 7 diseases during 2017—2020

1.2 主要儀器設(shè)備及耗材 -80 ℃冰箱，購(gòu)自合肥美菱股份有限公司；PCR儀，購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司；酶標(biāo)儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；全血基因組DNA提取試劑盒和病毒核酸DNA/RNA抽提試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；ELISA抗體(血清學(xué))檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢科前生物有限公司。

豬瘟疫苗：細(xì)胞源兔化弱毒株、武漢科前(2015)170041004、中牧江西制藥廠(2014)140401004、廣東永順(2013)150251084；豬繁殖與呼吸綜合征疫苗：武漢科前JXAI-R株17041064、哈獸研2020003、云南生物制藥廠250121064、美國(guó)輝瑞；豬圓環(huán)2型疫苗：WH株、武漢科前(2013)170041087、大腸埃希桿菌源、普萊科生物160021128、柏林格；偽狂犬疫苗：Bartha-K61株，武漢科前(2016)170041056、齊魯動(dòng)保(2015)150257018、海林格生物制藥(2014)220527018；O 型口蹄疫Rv-2/O/Rv-1株、中農(nóng)威特280027542。

1.3 PCR檢測(cè)方法的建立

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見(jiàn)表2。

表2 引物信息Table 2 Primer details

1.3.2 擴(kuò)增反應(yīng)程序 從組織和血液樣品中提取核酸，按以下擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增。

反轉(zhuǎn)錄程序按照：42 ℃ 2 min,50 ℃ 15 min(去除gDNA),85 ℃ 8 s,42 ℃預(yù)變性45 min(將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA);4 ℃保存。

cDNA擴(kuò)增程序分別按照：CSFV：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；PRRSV：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，44 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存；PRV：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存；PCV2：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；HPS：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；PEDV：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 ELISA檢測(cè)方法 按照豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬gE、豬偽狂犬gB、豬圓環(huán)病毒2型、豬O型口蹄疫ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗體檢測(cè)和結(jié)果判定。

1.5 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2019對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 2017—2020年6種疫病抗原檢測(cè) 如圖1所示，2017—2020年CSFV抗原陽(yáng)性率平均為13.18%，其中最高為2019年(16.35%),最低為2020年(10.92%)，呈逐年上升再下降的趨勢(shì)；PRRSV抗原陽(yáng)性率平均為19.74%，其中最高為2018年(30.06%)，最低為2020年(6.09%)，呈先上升再迅速下降的趨勢(shì)；PRV抗原陽(yáng)性率平均為14.81%，其中最高為2020年(20.34%)，最低為2017年(10.75%)，呈逐漸上升、下降再上升的趨勢(shì)；PCV2抗原陽(yáng)性率平均為46.20%，其中最高為2018年(62.50%),最低為2020年(5.34%)，呈逐漸下降趨勢(shì)；PEDV抗原陽(yáng)性率平均為22.06%，其中最高為2017年(27.78%)，最低為2019年和2020年(兩年均為20.00%)，呈逐漸下降趨勢(shì)；HPS抗原陽(yáng)性率平均為45.58%，其中最高的是2020年(62.00%)，最低的是2018年(31.82%)，呈逐漸下降再上升的趨勢(shì)。

圖1 2017—2020年各病原PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR detection results of individual pathogens from 2017 to 2020

2.2 混合感染檢測(cè) 混合感染情況嚴(yán)重，其中2017年CSFV+PRRSV二重感染陽(yáng)性率最高(8.65%)，其次是2020年CSFV+PCV2(6.65%)；CSFV+PRV、PRV+PRRSV、PCV2+PRV二重感染陽(yáng)性率呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)。PCV2+PRRSV二重感染陽(yáng)性率呈逐年上升再下降的趨勢(shì)，但在2019年未被檢測(cè)到(圖2)。

圖2 2017—2020年抗原檢測(cè)二重感染陽(yáng)性率Fig.2 Antigen positive rates of double infection from 2017 to 2020

由圖3可知，CSFV+PCV2+PRRSV三重感染陽(yáng)性率2019年最高(2.22%)，CSFV+PCV2+PRV三重感染陽(yáng)性率2020年最高(1.40%)，PCV2+PRV+PRRSV三重感染陽(yáng)性率2019年最高(2.22%)；CSFV+PCV2+PRV、PCV2+PRV+PRRSV、CSFV+PCV2+PRRSV和CSFV+PRV+PRRSV這4種三重感染在2018年均有檢出，其他年份均有不同程度的混合感染。

圖3 2017—2020年抗原檢測(cè)三重感染陽(yáng)性率Fig.3 Antigen positive rates of triple infection from 2017 to 2020

2.3 2017—2020年5種疫病ELISA檢測(cè) 2017—2020年CSF抗體陽(yáng)性率分別為81.67%、84.82%、91.18%、85.21%，呈逐年上升再下降的趨勢(shì)；PCVD抗體陽(yáng)性率分別為90.52%、71.79%、100.00%、50.63%，呈逐年下降、上升再下降的趨勢(shì)。PRRS抗體陽(yáng)性率分別為50.47%、71.55%、85.29%、60.75%，呈逐年上升再下降的趨勢(shì)。FMD抗體陽(yáng)性率分別為36.81%、66.19%、87.80%、97.20%，呈逐年增高趨勢(shì)；PR-gB抗體陽(yáng)性率分別為54.02%、40.80%、58.13%、86.18%,呈先下降再上升的趨勢(shì)(圖4)。

圖4 2017—2020年各疫病ELISA抗體陽(yáng)性率Fig.4 ELISA antibody positive rates for individual diseases from 2017 to 2020

2017—2020年P(guān)R-gE抗體陽(yáng)性率分別為16.49%、26.50%、10.93%、1.11%，呈逐年先上升后下降的趨勢(shì)，其中2018年最高(26.50%)，2020年最低(1.11%)(圖5)。

圖5 2017—2020年P(guān)R-gE ELISA抗體陽(yáng)性率Fig.5 ELISA antibody positive rates for PR-gE from 2017 to 2020

3 討論

本次調(diào)查顯示，CFSV抗原陽(yáng)性率2019年最高(16.35%)，低于云南楊曉穎等[3]2017年(20%),高于陜西葉超[4]2018年(7.5%)。PRRSV抗原陽(yáng)性率2018年最高(30.06%),低于湖南段群棚等[5]2018年(43.41%)、江西袁為鋒等[6]2017年(70.86%)，高于四川覃思楠等[7]2016—2017年(平均22.15%)。2017—2019年CSFV和PRRSV陽(yáng)性率出現(xiàn)上升趨勢(shì)，原因可能與2018年云南省解除強(qiáng)制免疫有關(guān)。PCV2陽(yáng)性率最高為2018年(62.5%)，高于貴州趙新霞等[8]2018年(26.51%)、四川李海全等[9]2015—2017年(49.2%)，低于貴州徐鍍涵等[10]2017年(90%)。PCVD屬于免疫抑制性疾病，感染一直居高不下，且有上升趨勢(shì)，是造成混合感染多發(fā)的主要原因。PRV陽(yáng)性率2020年最高(20.34%)，高于云南宋春蓮等[11]2015年(13.33%)，低于蘇琳琳等[12]2017年(23.1%)，同時(shí)PR-gE陽(yáng)性率2018年最高(26.5%)，表明規(guī)模豬場(chǎng)存在PRV野毒感染，雖然近年來(lái)使用基因缺失苗對(duì)其防控取得一定效果，但PRV感染仍呈上升趨勢(shì)，可能原因是PRV出現(xiàn)變異毒株。PEDV陽(yáng)性率2017年最高(27.78%)，低于牟迪等[13]2015—2017年 (52.13%～83.47%)、海南Zhang等[14]2016—2017年(59.5%)。HPS陽(yáng)性率2020年最高(62.00%)，高于郭龍等[15]2017年(57.93%)，細(xì)菌感染率較高。雖然云南省PEDV陽(yáng)性率偏低，但與其他病原混合感染對(duì)仔豬危害極大，加大了防控難度。近幾年來(lái)，HPS在我國(guó)屬于多發(fā)性疾病，各地均有不同程度感染的報(bào)道。

二重感染陽(yáng)性率最高為CSFV+PRRSV，2017年陽(yáng)性率為8.65%，低于張?jiān)ｌ鱗16]2014年(31.8%)，高于云南楊潤(rùn)煥等[17]2016—2017年(4.46%)。三重感染與黎軍等[18]的報(bào)道相比，均為逐年上升，PCV2+PRV+PRRSV三重感染陽(yáng)性率最高(2.22%)，高于黎軍等[18]2015—2019年(0.68%)，低于韋顯凱等[19]2014年(2.29%)。近幾年來(lái)，HPS在我國(guó)屬于多發(fā)性疾病，本試驗(yàn)中2018年部分地區(qū)出現(xiàn)與HPS相關(guān)的二重感染，PCV2+HPS及PRRSV+HPS二重感染陽(yáng)性率均為14.28%，HPS高發(fā)與PCV2、PRRSV的高發(fā)病率密不可分，病毒性肺炎的繼發(fā)感染使該病防治更加困難。

免疫抗體CSF陽(yáng)性率最高為2019年(91.18%)，高于丁亮等[20]2018年(80.15%)、山東王宏宇等[21]2017年(76.46%)，低于張衛(wèi)兵[22]2018年(94.10%)。2019年P(guān)CVD抗體陽(yáng)性率為100%,高于云南顧紹鋒等[23]2015—2016年(88.21%)。2020年FMD抗體陽(yáng)性率(97.2%)高于山西任昊[24](96.97%)、謝增勝[25]2015年(84.84%)。2020年P(guān)R-gB抗體陽(yáng)性率(86.18%)低于四川陳第詩(shī)等[26]2016年(93.1%)。2019年P(guān)RRS抗體陽(yáng)性率(85.29%)低于吉林劉曉東等[27]2016年(90.42%)，高于蔡丙嚴(yán)等[28]2018年(57.72%)。通過(guò)此次調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)疫病的疫苗保護(hù)率基本都在80%以上，表明疫苗保護(hù)率效果較好；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，PR-gB、FMD免疫抗體在2017—2019年低于80%，保護(hù)率未達(dá)到理想效果，但隨著豬場(chǎng)管理者對(duì)疫苗免疫意識(shí)的提升，保護(hù)率也在逐漸上升。