劉 磊，嚴(yán)思晴，丘甜美，何援利，徐嘉文，蔡慧華，何善陽(yáng)

[1.廣東省心血管病研究所，廣州 510080;2.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)婦產(chǎn)科，廣州 510080;3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510280]

宮腔粘連(intrauterine adhesions,IUA)是子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)障礙所致的宮腔部分或全部閉塞，常伴月經(jīng)過(guò)少、閉經(jīng)、不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等生殖問(wèn)題[1]。在我國(guó)，IUA發(fā)病率居高不下，在繼發(fā)性不孕癥中占27.5%～61.5%，在胚胎移植失敗中占24.2%～29.1%[2,3]。宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)及術(shù)后眾多的輔助方案能改善IUA患者的宮腔形態(tài)，甚至增加或恢復(fù)部分患者的月經(jīng)量，但術(shù)后粘連復(fù)發(fā)和后續(xù)的不孕問(wèn)題使得IUA治療仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。研究顯示,IUA患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～66%[4]，而總的妊娠率僅為42.8%～66.1%[4]。因此，積極尋求有效的IUA治療方法，尤其是針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的靶向治療，已成為臨床上亟待解決的難題。

目前IUA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。最早于1978年有學(xué)者發(fā)現(xiàn),IUA的病理特征為子宮壁纖維組織異常增多[5]。之后陸續(xù)有越來(lái)越多的研究包括本課題組前期工作，證實(shí)IUA本質(zhì)上是子宮內(nèi)膜纖維化[6-8]。迄今，已有報(bào)道小分子代謝物質(zhì)及其相關(guān)通路的變化參與了其他臟器纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展[9-11]，但基于子宮內(nèi)膜樣本的代謝組學(xué)分析IUA或子宮內(nèi)膜纖維化的相關(guān)研究則鮮有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)非靶向代謝組學(xué)方法探索IUA的潛在標(biāo)志物，為IUA的發(fā)病機(jī)制及診治策略提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年7月至2019年4月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院確診為IUA并行宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)的患者74例(IUA組)。選取同期行宮腔鏡檢查或?qū)m腹腔鏡聯(lián)合檢查且病理確診子宮內(nèi)膜無(wú)病變的育齡女性患者27例(對(duì)照組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理證實(shí)為有子宮內(nèi)膜組織學(xué)改變，如子宮內(nèi)膜息肉、子宮黏膜下肌瘤、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜癌；(2)有手術(shù)及激素治療禁忌證，如凝血功能障礙、急性生殖道感染、嚴(yán)重肝腎功能損傷。研究對(duì)象均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 甲醇(CAS 67-56-1，LC-MS級(jí)，CNW Technologies)、乙腈(CAS 75-05-8，LC-MS級(jí)，CNW Technologies)、乙酸銨(CAS 631-61-8，LC-MS級(jí)，SIGMA-ALDRICH)、氨水(CAS 1336-21-6，LC-MS級(jí)，F(xiàn)isher Chemical)、超純水(屈臣氏)、超高效液相儀(型號(hào)Vanquish,Thermo Fisher Scientific)、高分辨質(zhì)譜儀(型號(hào)Q Exactive HFX,Thermo Fisher Scientific)、離心機(jī)(型號(hào)Heraeus Fresco17,Thermo Fisher Scientific)、天平(型號(hào)BSA124S-CW,Sartorius)、研磨儀(型號(hào)JXFSTPRP-24,上海凈信科技有限公司)、超聲儀(型號(hào)PS-60AL,上深圳市雷德邦電子有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 患者在全身麻醉后接受宮腔鏡手術(shù)，操作過(guò)程中宮腔電切鏡外鞘避免接觸陰道壁，用環(huán)狀電切環(huán)在不帶電狀態(tài)下輕輕刮取少許內(nèi)膜組織，將其放在無(wú)菌無(wú)酶凍存管后迅速投放到液氮罐中儲(chǔ)存。

1.3.2 代謝物提取 稱取2mg樣品，加500μL提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1(V/V)，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物)；35Hz研磨處理4min，超聲5min(冰水浴)；重復(fù)3次；-40℃靜置1h；將樣品4℃，12000r/min離心15min；取上清于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)；所有樣品另取等量上清混合成質(zhì)量控制樣品上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 上機(jī)檢測(cè) 使用Vanquish超高效液相色譜儀，通過(guò)Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1mm×100mm,1.7μm)液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25mmol/L乙酸銨和25mmol/L氨水，B相為乙腈。樣品盤(pán)溫度4℃，進(jìn)樣體積3μL。Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀能在控制軟件(Xcalibur，Thermo)控制下進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。詳細(xì)參數(shù)：Sheath gas flow rate:30 Arb,Aux gas flow rate:25 Arb,Capillarytemperature:350℃,Full ms resolution:60000,MS/MS resolution:7500,Collision energy:10/30/60 in NCE mode,Spray Voltage:3.6kV (positive)或-3.2kV (negative)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫(xiě)的R程序包(內(nèi)核為XCMS)進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理，然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cut off值設(shè)為0.3。應(yīng)用正交偏最小二乘判別分析進(jìn)行建模，并結(jié)合單變量和多元變量分析篩選差異代謝物。KEGG注釋分析差異代謝物參與的通路，通過(guò)富集分析和拓?fù)浞治?，篩選出與代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路。R語(yǔ)言繪制受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC)。

2 結(jié) 果

2.1 模式識(shí)別與差異代謝物分析 正離子模式下，OPLS-DA得分圖(圖1A)顯示：IUA組與對(duì)照組分離明顯，該模型R2Y=0.594，Q2=0.183；進(jìn)一步對(duì)該模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)(圖1B)，R2在Y軸的截距為0.500，Q2在Y軸的截距為-0.530，其值小于0。表明該模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象，可據(jù)此進(jìn)行差異代謝物的篩選。101個(gè)子宮內(nèi)膜樣本中共檢測(cè)出8197個(gè)peak，通過(guò)與HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，其中633種代謝物被成功鑒定出來(lái)。進(jìn)一步結(jié)合單變量及多元變量統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，其中87種代謝物在IUA患者中呈差異表達(dá)。這些差異代謝物包括27種脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子,24種有機(jī)酸及其衍生物,12種有機(jī)雜環(huán)化合物,8種有機(jī)氧化合物,5種生物堿及其衍生物,4種有機(jī)含氮化合物,3種苯環(huán)型化合物,1種核苷、核苷酸和類似物,1種有機(jī)氮化合物,1種有機(jī)硫化合物,1種其它。

圖1 正離子模式下IUA患者及正常子宮內(nèi)膜女性的子宮內(nèi)膜代謝譜A：OPLS-DA得分散點(diǎn)圖；B：置換檢驗(yàn)圖

負(fù)離子模式下，OPLS-DA得分圖(圖2A)顯示：IUA組與對(duì)照組分離明顯，該模型R2Y=0.694，Q2=0.235；進(jìn)一步對(duì)該模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)(圖2B)，R2在Y軸的截距為0.460，Q2在Y軸的截距為-0.580，其值小于0。表明該模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象，可據(jù)此進(jìn)行差異代謝物的篩選。101個(gè)子宮內(nèi)膜樣本中共檢測(cè)出6275個(gè)peak，通過(guò)與HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，其中250種代謝物被成功鑒定出來(lái)。進(jìn)一步結(jié)合單變量及多元變量統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，其中39種代謝物在IUA患者中呈差異表達(dá)。這些差異代謝物包括12種脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子,12種有機(jī)酸及其衍生物,4種核苷、核苷酸和類似物,4種有機(jī)氧化合物,3種苯環(huán)型化合物,3種有機(jī)雜環(huán)化合物,1種苯丙烷和聚酮化合物。

綜上，由于兩組間的肌酸酐水平在正、負(fù)離子模式均存在差異，即正、負(fù)離子模式的差異代謝物存在1種重復(fù)代謝物，因此總離子模式共有125種差異代謝物。設(shè)定多元變量統(tǒng)計(jì)分析參數(shù)P<0.01，VIP(差異貢獻(xiàn)值)>1且FC(倍數(shù)變化IUA vs Control)>3或<0.33，最終篩選出10種具有潛在生物標(biāo)志物作用的差異代謝物。與對(duì)照組相比，IUA組子宮內(nèi)膜的3-甲基戊二酰肉堿(3-Methylglutarylcarnitine,3-MGC)、氟硅唑、L-辛酰肉堿、二甲基二烷基氯化銨、癸酰肉堿、賴氨酰-羥脯氨酸、二氫-2,4,6-三(2-甲基丙基)-4h-1,3,5-二噻嗪、L-己酰肉堿、丙酰肉堿(propionylcarnitine,PC)以及鄰苯二甲酸二丁酯均表達(dá)上調(diào)(表1)。

2.2 差異代謝通路分析 正離子模式下，IUA組與對(duì)照組在組氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，β-丙氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，氮代謝，D-精氨酸和D-鳥(niǎo)氨酸代謝，亞油酸，氰基氨基酸代謝，氨酰tRNA生物合成，泛酸和輔酶A生物合成，賴氨酸生物合成，丁酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，色氨酸代謝，氨基糖和核苷酸糖代謝，嘌呤代謝，卟啉與葉綠素代謝等21條代謝通路途徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

負(fù)離子模式下，IUA組與對(duì)照組在嘧啶代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，丙酸代謝，苯丙氨酸代謝，檸檬酸循環(huán)，精氨酸和脯氨酸代謝，嘌呤代謝，β-丙氨酸代謝，戊糖磷酸途徑，谷胱甘肽代謝，丁酸代謝，煙酸和煙酰胺代謝，脂肪酸生物合成，乙醛酸和二羧酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，酪氨酸代謝，類固醇激素生物合成等17條代謝途徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

經(jīng)富集分析，10種潛在生物標(biāo)志物的差異代謝物均未找到上述相應(yīng)的代謝通路。考慮我們分析通路使用的數(shù)據(jù)庫(kù)是KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(目前國(guó)際上通路信息最大的數(shù)據(jù)庫(kù))，若這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有收錄這些物質(zhì)的通路信息，則做不了通路分析；但并不代表這個(gè)物質(zhì)不存在或者沒(méi)有功能。鑒于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的更新可能有滯后，所以下一步需要結(jié)合文獻(xiàn)檢索來(lái)分析這10種潛在生物標(biāo)志物的差異代謝物的相關(guān)信號(hào)通路和功能。

表2 IUA患者與正常子宮內(nèi)膜女性的子宮內(nèi)膜差異代謝通路

2.3 ROC診斷模型的建立 10種潛在生物標(biāo)志物的差異代謝物中，有4種物質(zhì)用于診斷IUA的曲線下面積(area under the cure，AUC)>0.70，分別為賴氨酰羥脯氨酸(AUC=0.793)、丙酰肉堿(AUC=0.789)、氟硅唑(AUC=0.731)、3-MGC(AUC=0.743)。其中，賴氨酰-羥脯氨酸、PC聯(lián)合3-MGC或氟硅唑診斷IUA可達(dá)到最大效能，AUC均高達(dá)0.846(表3)。

3 討 論

IUA作為纖維化病變，其主要病理基礎(chǔ)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成與降解的動(dòng)態(tài)失衡，促使ECM過(guò)度沉積[12]。ECM蓄積過(guò)程中必然伴隨著代謝物質(zhì)及其相關(guān)通路的變化[13]?，F(xiàn)階段能對(duì)機(jī)體分泌的代謝物進(jìn)行整體性分析的技術(shù)被稱為代謝組學(xué)。其中，非靶向代謝組學(xué)主要是尋找差異代謝物，解釋差異代謝物在其參與的代謝通路中所執(zhí)行的生物學(xué)功能，從而為疾病的診斷和機(jī)制研究提供參考。近年來(lái)，子宮內(nèi)膜組織基于代謝組學(xué)的生物標(biāo)志物和機(jī)制研究的探索主要集中在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位癥及不孕癥患者的子宮內(nèi)膜容受性方面[14-16]，其在IUA的應(yīng)用尚處于空白階段。本研究首次通過(guò)101例IUA患者和正常女性的子宮內(nèi)膜非靶向代謝組學(xué)分析，成功篩選得到10種差異代謝物和38條差異代謝途徑。其中，IUA患者子宮內(nèi)膜的3-MGC、氟硅唑、L-辛酰肉堿、二甲基二烷基氯化銨、癸酰肉堿、賴氨酰-羥脯氨酸、二氫-2,4,6-三(2-甲基丙基)-4h-1,3,5-二噻嗪、L-己酰肉堿、PC以及鄰苯二甲酸二丁酯水平較正常子宮內(nèi)膜女性明顯上升。并且，經(jīng)ROC曲線分析建立聯(lián)合診斷模型，認(rèn)為3-MGC或氟硅唑聯(lián)合賴氨酰-羥脯氨酸和PC的診斷效能最佳，有望作為IUA的診斷標(biāo)志物，有望為IUA的診治策略和機(jī)制研究提供新方向。

3-MGC作為脂肪酰基肉堿之一，主要參與脂肪酸的β-氧化。首先，脂肪酸氧化是指油脂在充足的氧氣供應(yīng)條件下水解產(chǎn)生的甘油和脂肪酸，進(jìn)而產(chǎn)生二氧化碳和水，釋放出大量能量供身體使用。而脂肪酸的β-氧化是脂肪酸氧化的常見(jiàn)形式之一。在脂肪酸β-氧化過(guò)程中，第一步是脂肪酸被細(xì)胞液中的乙酰輔酶A激活為脂肪酸酰輔酶A。之后脂肪酰輔酶A被肉堿運(yùn)輸?shù)骄€粒體中，進(jìn)行β氧化，最終產(chǎn)生乙?；o酶A和脂肪?；鈮A[17-18]。有研究報(bào)道，脂肪酰基肉堿在心肌中的積累可抑制脂肪酸的氧化，并產(chǎn)生一些有害作用[19]。隨后有研究證實(shí)，急性冠脈綜合征患者存在脂肪代謝紊亂，其中尿液3-MGC為主的脂肪?；鈮A水平明顯升高，有助于提高疾病的診斷效率和準(zhǔn)確率[20]。眾所周知，急性冠脈綜合征是以冠脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲，繼發(fā)閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的臨床綜合征，可繼發(fā)心室重構(gòu)和心肌間質(zhì)纖維化[21]。除了心肌纖維化，在肝纖維化方面，Mann等[22]在多中心隊(duì)列人群中發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝相關(guān)的肝纖維化患者外周血1449種代謝物中，高水平的3-MGC與多種等位基因變異的個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其中攜帶PNPLA3和HSD17B13等位基因的風(fēng)險(xiǎn)增加，而攜帶HSD17B13的風(fēng)險(xiǎn)減少。以上研究高度提示高水平3-MGC與纖維化疾病的發(fā)生相關(guān)。本研究亦發(fā)現(xiàn)，IUA患者子宮內(nèi)膜組織中3-MGC蓄積，可能參與子宮內(nèi)膜纖維化形成，后續(xù)需驗(yàn)證其具體關(guān)系和機(jī)制。

氟硅唑是一種三唑類殺菌劑，主要通過(guò)破壞和阻止麥角甾醇的生物合成限制細(xì)胞膜的形成，最終引發(fā)病菌死亡，因此被廣泛應(yīng)用于防治各種農(nóng)作物的真菌感染[23]。然而，氟硅唑在人類健康和疾病方面的研究頗少。僅Karacaoglu等[24]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氟硅唑可引起男性生育能力低下，其作用機(jī)制與細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激受損、脂質(zhì)代謝失調(diào)有關(guān)。氟硅唑在人體纖維化疾病或子宮內(nèi)膜方面的研究，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)，IUA子宮內(nèi)膜纖維化患者中氟硅唑呈上升趨勢(shì)，且差異貢獻(xiàn)值和診斷IUA的效能一致，僅次于3-MGC。后續(xù)可通過(guò)體外研究其對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝情況揭示其可能機(jī)制。

PC屬于?；鈮A，是肉堿與氨基酸或脂肪酸代謝物結(jié)合的一類酯類物質(zhì)。其主要參與細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，尤其是線粒體內(nèi)脂肪酸的β-氧化過(guò)程，在間歇性跛行、心血管疾病、糖尿病等方面均有相關(guān)報(bào)道[25-27]。Silvestro等[25]報(bào)道，在間歇性跛行患者中，踏車(chē)運(yùn)動(dòng)可引起急性內(nèi)皮功能惡化和血漿黏附分子濃度增加，而靜脈注射PC可有效預(yù)防這些損害。Broderick等[26]發(fā)現(xiàn)，PC可通過(guò)影響線粒體的丙酮酸代謝改善糖尿病和缺血性心臟病大鼠的心臟代謝和功能。李蕾等[27]則檢測(cè)到2型糖尿病大鼠血清PC高表達(dá)，通過(guò)運(yùn)動(dòng)干預(yù)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能有效下調(diào)PC和血糖水平。提示PC在不同疾病或疾病的不同階段存在差異，并非絕對(duì)起保護(hù)作用。本研究亦發(fā)現(xiàn)，IUA患者子宮內(nèi)膜組織中PC高表達(dá)，可能參與子宮內(nèi)膜纖維化的發(fā)生。迄今，PC在其他臟器纖維化疾病中的表達(dá)鮮有報(bào)道，因此仍需擴(kuò)大子宮內(nèi)膜臨床樣本量及分層分析進(jìn)行驗(yàn)證其在組織纖維化中的作用。賴氨酰-羥脯氨酸是在IUA患者中具有潛在診斷標(biāo)志物的代謝物，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，IUA患者表現(xiàn)出有別于正常女性的子宮內(nèi)膜代謝譜特征。本研究篩選得到的4種差異代謝物組合，即3-MGC或氟硅唑聯(lián)合賴氨酰-羥脯氨酸和PC，有望作為診斷IUA的潛在標(biāo)志物，后續(xù)仍需擴(kuò)大樣本量及開(kāi)展臨床前實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。