馬穎超，董維沖，吳瑕，楊秀嶺（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000）

黏菌素（又稱多黏菌素E）是一種含多種組分的陽離子多肽類抗菌藥物，于1950年從大腸埃希菌中分離得到，其結(jié)構(gòu)是脂肪酸鏈通過酰胺鍵與陽離子十肽環(huán)連接。黏菌素主要成分為多黏菌素E1（C53H100N16O13）和多黏菌素E2（C52H98N16O13），兩者區(qū)別僅是脂肪酸側(cè)鏈相差一個甲基，多黏菌素E1為6-甲基辛酸，多黏菌素E2為6-甲基庚酸[1]，這兩種成分占黏菌素總含量的85%以上[2]，決定其主要血藥濃度和臨床抗菌活性[3]。硫酸黏菌素，原名硫酸抗敵素，又稱硫酸多黏菌素E，是1966年我國自主研發(fā)的抗菌藥物。硫酸黏菌素與多黏菌素E 甲磺酸鹽不同，無需轉(zhuǎn)化，直接殺菌。因市場用量少，曾經(jīng)停產(chǎn)。近年來，由于臨床耐藥菌的廣泛出現(xiàn)，硫酸黏菌素對多重耐藥及泛耐藥革蘭氏陰性桿菌特別是銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌有強大的抗菌活性，被作為治療這些多重耐藥菌感染的最后一道防線，于2018年重新上市，用于危重患者嚴(yán)重感染的治療[4]。但由于其上市較早，未經(jīng)歷過現(xiàn)代藥物開發(fā)程序，早期的藥動學(xué)、藥效學(xué)、毒理學(xué)等資料非常有限，缺少指導(dǎo)臨床使用的相關(guān)信息。其治療窗窄，不良反應(yīng)發(fā)生率高[5-6]，尤其在重癥感染患者中，臨床個體差異大，需要進行血藥濃度監(jiān)測[7]，以便實現(xiàn)個體化給藥。本文建立一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定人血漿中硫酸黏菌素主要成分多黏菌素E1和多黏菌素E2的濃度，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-20C 高效液相色譜儀（日本島津），API4000＋三重四級桿質(zhì)譜儀（Applied Biosystem，美國），離心機（德國ABBOTT），渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），低溫冰箱（MDF-U2086S，日本三洋），冷藏柜（YC-180，澳柯瑪），電子分析天平（CPA225D，德國Sartorius）。

1.2 試藥

硫酸黏菌素對照品（含量：95.1%，批號：833621）、內(nèi)標(biāo)硫酸多黏菌素B（含量：88.1%，批號：174224）（德國Dr Ehrenstorfer 公司）；人血漿（河北省血液中心）；甲酸（色譜純，上海Aladdin）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流動相A：水（含0.1%甲酸），流動相B：乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脫（0 ～1 min，95%A；1～5 min，25%A；5～7 min，5%A；7 ～9 min，95%A）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），多重反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）正離子模式，噴霧電壓（IS）：5500 V，離子源溫度（TEM）：550℃，氣簾氣壓力（CUR）：10 psi，霧化器壓力（GAS1）：55 psi，輔助氣壓力（GAS2）：55 psi，碰撞氣壓力（CAD）：4 psi。多黏菌素E1、多黏菌素E2和內(nèi)標(biāo)多黏菌素B 的定量離子對分別為m/z585.7 →101.2、m/z578.8 → 101.2 和m/z602.7 → 241.4，去簇電壓（DP）分別為61 V、59 V 和68 V，碰撞電壓（CE）分別為47 V、49 V 和33 V。

2.3 對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取硫酸黏菌素、硫酸多黏菌素B 對照品各20 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用20%甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為2 mg·mL－1的硫酸黏菌素儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液。精密量取硫酸黏菌素儲備液適量，以20%甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)量濃度為1、10、80 μg·mL－1的質(zhì)控工作液，用20%甲醇稀釋內(nèi)標(biāo)儲備液為40 μg·mL－1作為內(nèi)標(biāo)工作液，4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品處理

取血漿200 μL，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)工作液（40 μg·mL－1），渦旋混勻后加入400 μL 甲醇-5%三氯乙酸（50∶50，V/V），渦旋2 min，10 900 r·min－1離心5 min，取上清液200 μL 進樣。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性 取人空白血漿、人空白血漿＋硫酸黏菌素對照品儲備液（5 μg·mL－1）＋內(nèi)標(biāo)工作液（40 μg·mL－1）、臨床患者用藥后血漿樣品，按“2.4”項下方法處理分析。結(jié)果多黏菌素E1、多黏菌素E2和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為5.64、5.54和5.68 min。峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)在待測物保留時間處無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 硫酸黏菌素的HPLC-MS/MS 色譜圖Fig 1 HPLC-MS/MS chromatogram of colistin sulfate

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 將“2.3”項下配制好的硫酸黏菌素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液分別加入到空白血漿中制備成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。按“2.4”項下方法處理后進樣，以多黏菌素E1和多黏菌素E2總濃度為橫坐標(biāo)，多黏菌素E1和多黏菌素E2總峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，以加權(quán)最小二乘法進行線性回歸運算，得硫酸黏菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝1.851x－0.059（r＝0.9982），在0.1 ～10 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。定量限（LOQ）為0.1 μg·mL－1。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度 取“2.3”項下硫酸黏菌素系列質(zhì)控工作液，分別加入到空白血漿中制得低（0.1 μg·mL－1）、中（1 μg·mL－1）、高（8 μg·mL－1）質(zhì)控工作液，按“2.4” 項下方法處理，每個濃度平行做5 份，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

表1 精密度和準(zhǔn)確度試驗結(jié)果(n ＝5)Tab 1 Precision and accuracy tests (n ＝5)

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取“2.5.3”項下3個濃度的質(zhì)控工作液，按“2.4” 項下方法處理，作為樣品A；取空白血漿進行預(yù)處理后的上清液，加入系列質(zhì)控工作液，制得低、中、高質(zhì)控工作液，作為樣品B；另配制同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為樣品C，每個質(zhì)控濃度各5 份。將3 組樣品同法進行HPLCMS/MS 分析，用樣品A 的峰面積與樣品C 的峰面積比計算提取回收率，樣品B 的峰面積與樣品C的峰面積比計算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。

表2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果(n ＝5)Tab 2 Extraction recovery and matrix effect (n ＝5)

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 制備低、中、高3 種質(zhì)量濃度硫酸黏菌素質(zhì)控血漿樣品，考察分別經(jīng)過室溫放置6 h 和24 h，自動進樣器15℃放置24 h，－20℃凍融循環(huán)3 次，－70℃冰箱放置30 d，按“2.4” 項下方法處理后測定血漿樣品的穩(wěn)定性，得到硫酸黏菌素濃度的RSD均在±15%，穩(wěn)定性符合相關(guān)要求，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n ＝5)Tab 3 Stability test (n ＝5)

2.6 方法學(xué)驗證

用本研究所建方法檢測10 例患者硫酸黏菌素血藥谷濃度，平均年齡為（53.20±24.36）歲，給藥劑量按照說明書規(guī)定靜脈滴注每次50 萬IU，每12 h 給藥一次，其中3 例患者給予首劑加倍。硫酸黏菌素谷濃度應(yīng)在穩(wěn)態(tài)下進行測定，其半衰期在腎功能正常的患者中為6 h，根據(jù)藥代動力學(xué)理論，需經(jīng)過4 ～5 個半衰期達到穩(wěn)態(tài)濃度，故可在用藥2 ～3 d 達穩(wěn)態(tài)后取血測定，最終選定第7 劑給藥前30 min 采集血樣，測定硫酸黏菌素穩(wěn)態(tài)谷濃度，結(jié)果中最大濃度為1.44 μg·mL－1，最小濃度為0.25 μg·mL－1。同時抽取了其中兩例患者第7 劑給藥后15 ～30 min 血樣，測定硫酸黏菌素峰濃度，分別為1.96 μg·mL－1和1.79 μg·mL－1，結(jié)果見表4。

表4 10 例患者硫酸黏菌素峰谷濃度測定結(jié)果Tab 4 Cmax and Cmin of colistin sulfate in 10 patients

3 討論

3.1 硫酸黏菌素臨床應(yīng)用困惑

硫酸黏菌素曾因其腎毒性和神經(jīng)毒性遭到臨床棄用，僅應(yīng)用于獸藥中。但隨著多重耐藥菌感染在臨床逐漸增多，在新藥開發(fā)有限的前提下，硫酸黏菌素又被重新應(yīng)用于臨床[8]。但由于硫酸黏菌素未經(jīng)歷過現(xiàn)代藥物開發(fā)程序，缺乏合理應(yīng)用所需要的藥理學(xué)信息，目前對各類患者特別是重癥患者，其給藥方案并沒有得到循證醫(yī)學(xué)的證實[9]；并且目前應(yīng)用較少，經(jīng)驗不足，臨床醫(yī)師對硫酸黏菌素的使用存在很大困惑。一方面很多臨床醫(yī)師不完全清楚硫酸黏菌素的給藥劑量，原因是各藥企所生產(chǎn)的多黏菌素E 有著不同的標(biāo)簽和不同的給藥方案，有些為國際單位，有些標(biāo)有“多黏菌素E 基礎(chǔ)活性”的標(biāo)簽。這種在標(biāo)簽以及每日推薦劑量上的不一致，造成臨床醫(yī)師對多黏菌素E 的兩種常用劑型黏菌素甲磺酸鹽和硫酸黏菌素的使用劑量產(chǎn)生混亂，對硫酸黏菌素的臨床使用有著非常大的影響。另一方面，近年來很多研究指出硫酸黏菌素的腎毒性發(fā)生率和嚴(yán)重程度遠(yuǎn)低于早期臨床觀察結(jié)果，僅在聯(lián)用其他腎毒性藥物或劑量過高時可增加腎功能損害發(fā)生的可能性[10-12]。文獻報道，硫酸黏菌素導(dǎo)致的腎功能損害是可逆的，停藥后數(shù)周至數(shù)月內(nèi)可恢復(fù)[13]。盡管如此，在使用硫酸黏菌素時仍需密切監(jiān)測腎功能且避免聯(lián)用有腎毒性的藥物。藥動學(xué)和藥效學(xué)分析可明晰藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄，從而指導(dǎo)臨床用藥劑量和給藥方式，降低不良反應(yīng)發(fā)生率，因此，當(dāng)硫酸黏菌素被重新應(yīng)用于臨床后，對其進行藥動學(xué)和藥效學(xué)研究顯得越發(fā)重要。

3.2 硫酸黏菌素血藥濃度分析方法選擇

現(xiàn)有的多黏菌素E 血藥濃度分析方法有微生物法、免疫法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法[14]和高效液相色譜法（HPLC）[15]。微生物法樣本耗時多且缺乏特異性，免疫法免疫原制備復(fù)雜，分析成本高，薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法重復(fù)性差，不具有普遍性[1]。由于多黏菌素E 最大吸收波長為210 nm，有末端吸收，此波長處流動相中的有機相會有一定吸收，因此對檢測器靈敏度和流動相要求苛刻。紫外檢測器會造成基線漂移，數(shù)據(jù)不可信。熒光檢測器雖然專屬性和靈敏度高，但由于多黏菌素E 沒有原生熒光，需要進行提取和衍生化，操作繁瑣[16]。本文采用LC-MS/MS 法測定人血漿中硫酸黏菌素的濃度，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，符合《中國藥典》生物樣本檢測方法的要求。

文獻[14-16]中對多黏菌素E 樣品前處理大多采用固相萃取法，但該技術(shù)操作繁瑣，不利于大量生物樣品的檢測，且固相萃取板價格昂貴。本研究采用蛋白沉淀樣品的前處理方式，簡化了血漿預(yù)處理過程，節(jié)約了成本，適用于臨床大量樣本分析。在方法學(xué)優(yōu)化過程中考察了多種流動相，包括水-甲醇、水-乙腈、水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）、水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）、水（含0.5%甲酸）-乙腈（含0.5%甲酸）、水（含1%乙酸）-乙腈（含1%乙酸），最終選擇本文流動相。通過加入0.1%甲酸使得多黏菌素E1和多黏菌素E2色譜峰峰形良好，響應(yīng)值得到改善。在洗脫方法研究中，選擇梯度洗脫，首先采用較低比例的有機相沖洗，讓極性物質(zhì)先流出色譜柱，保證了極性物質(zhì)和藥物先后流出，避免了基質(zhì)效應(yīng)的干擾，并通過調(diào)整初始有機相比例得到了較為合適的保留時間和峰形，提高了檢測靈敏度。在內(nèi)標(biāo)選擇中，選擇與黏菌素結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似的多黏菌素B，保證完全分離的同時，又可以獲得相似的回收率、離子化效率和色譜保留行為，并且無內(nèi)源性物質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)干擾。

3.3 硫酸黏菌素血藥濃度檢測結(jié)果分析

多黏菌素E 血藥濃度的高低與抗菌效果、腎毒性緊密相關(guān)，重癥患者體內(nèi)多黏菌素E 藥動學(xué)變化大，血藥濃度監(jiān)測不僅能保證治療效果，也能降低腎臟損害的風(fēng)險。2019年多黏菌素國際共識中建議[17]，多黏菌素E 的推薦靶值為穩(wěn)態(tài)時24 h 血漿藥時曲線下面積（AUCss，24h）達到50 mg·h·L－1，即穩(wěn)態(tài)平均血藥濃度（Css，avg）維持在2 μg·mL－1。該濃度被認(rèn)為是能耐受的最高暴露量，高于此濃度將增加急性腎損傷的發(fā)生率和嚴(yán)重性。通過本研究方法檢測10 例患者硫酸黏菌素血藥谷濃度在0.25 ～1.44 μg·mL－1，谷濃度差異較大。其中5 號和8 號患者平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度低于指南要求，患者硫酸黏菌素給藥劑量為50 萬IU q12h，符合說明書規(guī)定，且患者腎功能正常，但平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度不能達標(biāo)，推測給藥劑量可能偏低，但由于本研究峰濃度樣本量較少，該結(jié)論尚需更多峰谷濃度測定來證實。另外，1 號和2 號患者采用首劑加倍給藥方案，其谷濃度分別為1.44 μg·mL－1和1.25 μg·mL－1，明顯高于未采用首劑加倍的患者。計算患者肌酐清除率，1、2 號患者均存在腎功能不全，硫酸黏菌素主要經(jīng)腎排泄，用藥后8 h 內(nèi)尿中排出用藥量的40%，腎功能不全者，藥物易在體內(nèi)蓄積，故血藥谷濃度升高是首劑加倍和腎功能不全兩者同時導(dǎo)致的。但與同樣腎功能不全、未采用首劑加倍的3、4、5 號患者相比，谷濃度也明顯升高，說明首劑加倍可提高硫酸黏菌素的血藥濃度。

綜上，硫酸黏菌素體內(nèi)個體差異較大，患者腎功能情況可影響藥物排泄，說明書規(guī)定50 萬IU q12h 的給藥方案可能存在劑量不足，需采用首劑加倍的給藥方案來增加血藥濃度，提高臨床療效。但由于本研究納入病例數(shù)和取血點有限，其他影響硫酸黏菌素體內(nèi)藥動學(xué)的因素尚需更大樣本量、更全面的臨床研究證實，本研究所建方法為進一步研究硫酸黏菌素藥動學(xué)-藥效學(xué)性質(zhì)提供了參考。